神经元。作者手稿；PMC 2011年12月9日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院305278
突触体素调节中枢神经元突触囊泡内吞动力学
威斯康星州麦迪逊市威斯康星大学霍华德·休斯医学院和神经科学系，邮编53706
- 补充资料
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总结
尽管突触素是最丰富的突触囊泡膜蛋白，但其功能仍不得而知。例如，据报道，突触素敲除小鼠的突触传递完全正常；然而，尚未进行直接的实验来监测突触囊泡周期。在这里，利用光学成像和电生理实验，我们证明突触素是培养海马神经元中突触小泡动态高效内吞所必需的。截短分析表明，突触素的不同结构元素在刺激期间和刺激后对小泡提取有不同的调节作用。因此，突触素调节至少两个内吞阶段，以确保在持续的神经元活动期间和之后囊泡的可用性。
结果
突触素调节代偿性SV内吞的动力学
为了确定syp是否在SV循环途径中发挥作用，我们直接监测了标记有pH-敏感GFP，pHfluorin的SV蛋白的运输(Miesenbock等人，1998年;Sankaranarayanan和Ryan，2000年)，在syp基因敲除的分离海马神经元中(西普−/−）小鼠。我们使用了两种不同的光学报告物syt1-pH和SV2A-pH，其中pHfluorin分别与SV膜蛋白syntotagmin 1（syt1）或SV2A的蛋白内结构域融合(Fernandez-Alfonso等人，2006年). 这些报告者使用慢病毒在神经元中表达。SV2A-pH是一位新颖的记者；如图所示，其用于监测培养神经元的SV循环得到了验证图S1简而言之，SV2A-pH有效地靶向SV的再循环，其表达不会干扰正常的SV再循环途径(图S1，A–D).
我们比较了野生型（wt）和西普−/−神经元。休息时，由于囊泡腔的pH值较低（pH5.5），syt1-pH的荧光仍然熄灭(). 通过传递300个刺激物（10 Hz）诱发的胞吐，由于暴露于微碱性细胞外溶液（pH 7.4）时pHfluorin信号失活，导致荧光迅速上升，随后由于胞吞和小泡再酸化，导致缓慢衰减(). 刺激后荧光衰减的平均时间常数（τ）在西普−/−与wt神经元（wt的τ=18.6±1.8 s，wt的η=29.6±1.5 s西普−/−) ()表明SV内吞和/或再酸化较慢。为了区分这些可能性，我们测量了囊泡再酸化的时间过程，发现wt（τ=3.13±1.2 s）与西普−/−神经元（τ=3.31±1.2 s）(图S1E); 这些时间常数与以前使用培养神经元的研究一致(Atluri和Ryan，2006年). 用SV2A-pH证实syp−/−神经元刺激后缓慢内吞（τ=19.8±0.5 s，wt，τ=30.6±1.1 s西普−/−) (). 直接比较这些内吞时间常数是有效的，因为这两种基因型的总循环SV池大小相同(图S1、F和G). 通过表达野生型突触素（wt-syp），可以修复观察到的内吞率缺陷西普−/−神经元（τ=20.4±0.9 s in西普−/−; 重量-类型）(). 有趣的是，当使用较弱的刺激方案（50脉冲，10赫兹）时，wt和西普−/−神经元（τ=19.3±0.4 s，wt，τ=18.5±0.3 s，in西普−/−) (). 讨论部分提供了对这一结果的解释。
Syp调节持续神经元活动停止后SVs的内吞作用（A） 野生型（黑色）和西普在10 Hz下对300个刺激作出反应时，表达突触结合蛋白1-pHfluorin（syt1-pH）的−/−（白色）神经元。取3张盖玻片的平均值，每张20磅。
（B） 野生型（黑色）和西普表达SV2A-pHfluorin（SV2A-pH）的−/−（白色）神经元对100个10 Hz的刺激作出反应。平均6张盖玻片，每张30磅。
（C） 荧光图像显示突触前波顿在wt和西普−/−神经元，在10 Hz刺激前（t=0）和停止刺激后（t=41s或80s）持续30秒。“t”表示图水平轴上的一个时间点，如(B类). 比例尺为2μm。
（D） 的平均SV2A-pH记录道西普−/−（白色，6个盖玻片，每个30个鲍顿）和wt-型救援（灰色，5个盖玻板，每个30鲍顿）神经元对100个10 Hz的刺激作出反应。
（E） 野生型（黑色）和西普−/−（白色）神经元对10 Hz的50个刺激作出反应。取4张盖玻片的平均值，每张40磅。
（F） 野生型、，西普−/−和wt-型救援神经元。所有ΔF值均归一化为最大荧光强度变化。在归一化之前，用单指数函数拟合syt1-pH或SV2A-pHΔF记录道的衰减相位，并根据拟合计算时间常数。
（G） FM 1-43脉冲相位实验协议。以10 Hz的频率刺激神经元30 s。在短暂延迟（30 s）后，将神经元暴露于FM 1-43中3 min，然后在Ca中清洗2+解决方案持续10分钟。发送两列900脉冲（10 Hz）以触发FM 1-43卸载。休息10分钟后，在FM 1-43的存在下以10 Hz的频率刺激神经元30 s。随后以与第一轮相同的方式进行洗涤和卸载。
（H） 显示延迟加载（左侧面板）和最大加载（右侧面板）期间标有FM 1-43的boutons的示例图像。比例尺为1.5μm。
（一） 平均ΔF1/ΔF2重量比和西普−/−神经元。平均4个盖玻片，每个盖玻片40次。所有误差条均为SEM。**，p<0.001（双尾，未配对t吨-测试）。
我们进行了FM 1-43摄取实验，以测试SV膜循环以及转运货物蛋白是否因syp的丢失而改变(). 重量和西普在没有FM 1-43的情况下，以10 Hz的频率刺激−/−神经元30 s，延迟30 s后，将其暴露在FM染料中3 min。然后在Ca中清洗神经元10 min2+-自由溶液，然后是两个刺激序列（每个900个脉冲，频率为10Hz，两个序列之间休息2分钟），以驱动囊泡中染料的最大释放。荧光变化（ΔF1)通过900个脉冲序列前后采集的图像进行测量。每个测量值均归一化为随后的控制运行，在该运行中，在刺激开始时立即应用FM染料；该方案允许标记在30 s刺激期间和之后发生外吞和内吞作用的SV的总池，从而产生ΔF2我们假设，在wt神经元中，内吞作用将在30秒内基本完成，只剩下很少的囊泡可用于FM染料的摄取(). 然而，在西普−/−神经元，在30 s延迟期间和之后，仍会发生内吞作用，导致更多的FM染料标记SV。的确，西普−/−神经元比wt神经元内化更多的染料（wt为0.15±0.01，wt为0.27±0.01）西普−/−），与使用pHfluorin观察到的较慢内吞作用一致().
因此，我们得出结论，虽然syp对内吞作用不是必需的就其本身而言持续刺激后，需要进行动态有效的SV恢复。
Syp在神经元活动期间调节内吞作用
最近的证据表明，持续刺激期间发生的内吞作用可能通过与刺激后发生的内食作用不同的分子机制进行(Ferguson等人，2007年;Mani等人，2007年). 如上所示，syp调节持续神经元活动后的囊泡恢复，因此我们随后测试syp是否在刺激期间内吞作用。为此，我们利用了囊泡ATP酶阻滞剂bafilomycin（Baf）抑制SVs再酸化(Nicholson-Tomishima和Ryan，2004年). 在没有Baf的情况下，以10 Hz的频率刺激表达SV2A-pH的神经元30 s，在休息10 min后，在有Baf的条件下以10 Hz再次刺激更长时间（120 s）(). 两轮刺激之间荧光强度的差异反映了刺激期间发生的内吞作用的程度(，“Endo”）(Nicholson-Tomishima和Ryan，2004年). 我们推导了刺激期间囊泡回收的时间过程（标记为“内吞”)通过计算中每组的上部（有Baf）和下部（无Baf）迹线之间的差异，面板B–D。显示了所有组在持续刺激过程中胞吐和胞吞的进展。根据时间进程斜率（例如，“wt”样本的实线，) (Nicholson-Tomishima和Ryan，2004年). 内吞率在年降低了约4倍西普−/−（0.014个任意单位（AU）s−1以重量计，0.0035 AUs−1在里面西普−/−），并通过在西普−/−神经元（0.0095 AUs−1在里面西普−/−; 重量-类型）(). 我们还将内吞程度（“Endo”）量化为列车末端（t=43 s）的胞吐分数（“Exo”）。在西普与wt神经元相比，持续神经元活动期间的内吞作用（endo/exo）程度显著降低（wt为0.35±0.02，wt为0.10±0.03）西普−/−，p<0.001）；通过在西普−/−神经元（0.28±0.03英寸西普−/−; 重量-类型）(). 通过用单指数函数拟合Baf处理的SV2A-pH曲线来估计细胞吐出的时间进程，在所有组中都是相同的（τ=31.0±1.2 s（wt），τ=32.3±1.3 s（wd）西普−/−，τ=32.5±1.8 s英寸西普−/−; 重量-类型）(). 因此，在持续的神经元活动期间以及之后，syp是SV有效内吞所必需的。
持续突触传递期间的细胞内吞减少西普−/−神经元（A） 使用巴非霉素（Baf）测量神经元活动期间内吞作用的时间进程和程度的协议，以防止囊泡再次酸化。在没有Baf的情况下，以10 Hz的频率刺激表达SV2A-pH的神经元30 s。休息10分钟后，在Baf存在下以10 Hz的频率刺激神经元120 s。在刺激的每个阶段都采集图像。
（B） 在10 Hz下，wt神经元对300个刺激的平均SV2A-pH轨迹。痕迹代表6个盖玻片的平均值，每个盖玻片30磅。在Baf存在的情况下，值被归一化为1200次刺激结束时的最大荧光变化。短箭头和长箭头（也在(C类)以及(D类))分别以10 Hz表示300个刺激结束时的内吞和外吐程度（垂直虚线）。
（C） 同样的实验在西普−/−神经元（6个盖玻片，每个盖玻片30次）
（D） 在wt型救援样本中重复相同的实验（5个盖玻片，每个盖玻片30个）。
（E） wt的胞吐（Baf）和内吞的时间进程，西普在刺激期间（30 s，10 Hz），−/−和wt-syp拯救神经元。通过从面板中的“Baf”轨迹减去在没有Baf的情况下获得的SV2A-pH轨迹来计算每个内吞时间过程(B–D类). 用线性函数拟合细胞内吞痕迹（实线显示为“wt”的示例）。通过计算拟合线的斜率，根据经验确定内吞率。
（F） 年测定的内分泌率（以任意单位每秒（AU/s）为单位）(E类).
（G） 输送300次脉冲后，作为胞吐分数的平均内吞量。
（H） 通过拟合面板中Baf痕迹的上升期估计平均外显时间常数(B–D类)具有单指数函数。
所有误差条均为SEM.**，p<0.001。
突触素的细胞质尾部在神经元活动期间选择性地控制内吞作用，而不是在神经元活动之后
为了了解syp如何控制SV内吞的两个阶段，我们将重点放在C端细胞质尾部，该尾部包含假定的磷酸化位点，由酪氨酸-甘氨酸-脯氨酸/谷氨酰胺（YG（P/Q））的九个重复序列组成(Sudhof等人，1987年). 据报道，该尾部区域结合动力蛋白I，动力蛋白I被认为在内吞过程中介导囊泡裂变(Daly和Ziff，2002年;Ferguson等人，2007年). 此外，将syp的C末端片段注射到鱿鱼的巨大轴突中，在长时间刺激过程中导致突触抑制加速(Daly等人，2000年;Daly和Ziff，2002年).
为了解决syp的C末端尾部的功能，我们表达了一个突变体syp，该突变体缺失该片段（ΔC-syp，缺失含有所有9个YG（P/Q）重复序列的244-307氨基酸）西普−/−神经元，并使用SV2A-pH分析囊泡恢复。令人惊讶的是，ΔC-syp在西普−/−神经元几乎与全长蛋白水平相同（τ=20.9±0.7s in西普−/−; ΔC-syp，τ=20.4±0.9 s英寸西普−/−; 重量-类型）(). 然后，我们使用与(). 与wt-syp相比，截断突变syp未能在神经元活动期间挽救有缺陷的内吞作用（0.0095 AUs）−1在里面西普−/−; 重量类型，0.0045 AU s−1在里面西普−/−; ΔC-syp）()和囊泡回收的相对大小（0.28±0.03 in西普−/−; 重量类型，0.14±0.03英寸西普−/−; ΔC型）(). 这些结果表明syp的C末端结构域对持续突触传递停止期间发生的内吞有选择性地需要，而不是在持续突触传输停止之后。
突触素的C末端胞质尾部在持续神经元活动期间调节内吞作用，但对刺激后内吞作用并不重要（A） （左）的平均SV2A-pH记录道西普−/−（白色，6个盖玻片，每个30磅）、重量型救援（黑色，5个盖玻片，每个三十磅）和ΔC-syp神经元（灰色，5个盖玻片，每一个三十磅），对10 Hz的300个刺激作出响应。（右）刺激后平均内吞时间常数的比较西普−/−、wt-syp救援和ΔC-syp神经元。
（B） 使用与中所示相同的方案分析神经元活动期间的细胞内吞(A类). 每个记录道是与中相同数量的样本的平均值(A类). 以下患者胞吐（Baf）和胞吞的时间进程西普30 s刺激方案中的−/−（左）、wt-syp救援（中）和ΔC-syp神经元（右）。
（C） 以下患者胞吐（Baf）和胞吞的时间进程西普−/−，wt-syp在10Hz的30s刺激期间拯救ΔC-yp神经元。每个内吞作用时间过程的计算方法是，将在没有Baf的情况下获得的SV2A-pH轨迹从三个面板中每个面板的“Baf”轨迹中减去(B类). 通过用线性函数拟合斜率来确定内吞率，如(E类).
（D） 根据(C类).
（E） 传递300个刺激后，作为胞吐分数的平均内吞量。
所有误差线均为SEM.*，p<0.05，**，p<0.001。
先前的一项研究报告称，C末端尾部对于成纤维细胞内syp的内化至关重要(Linstedt和Kelly，1991年). 我们使用全长pHfluoroin-tagged synaptophysin（fl-sypHy）和缺失相同C末端片段（氨基酸244-307）的突变sypHy（ΔC-sypHy）来测试这一概念。在10 Hz刺激方案结束时（30 s），ΔC sypHy荧光呈点状分布，与全长sypHy无明显区别，反映了对SVs的有效靶向(图S2A). 刺激后ΔC sypHy的内吞时间常数（τ=18.8±0.8 s）与全长sypHy（τ(图S2B)这表明syp的C末端尾部不需要在神经元活动后有效内化syp。接下来，我们测试了在神经元活动期间，ΔC sypHy中syp的贩运是否与有趣的是，与全长sypHy（0.015 AU s）相比，神经元活动期间ΔC sypHy的恢复显著降低（fl sypHy0.31±0.02，ΔC sypHy 0.18±0.04），并且变得较慢−1对于fl sypHy，0.010 AU s−1ΔC sypHy）(图S2、C和D). 因此，这些结果进一步证明，syp中的不同模体参与控制SV在持续突触传递期间和之后发生的内吞作用，这可能是通过招募不同的蛋白质集合进行再循环。
西普−/−神经元表现出明显的突触抑制，循环囊泡池恢复较慢
我们研究了细胞内吞缺陷的生理意义西普通过在分离的皮层神经元中进行全细胞电压灯记录来检测−/−神经元。我们通过使用刺激电极向细胞体发送电脉冲来局部刺激神经元，并记录来自突触后伙伴细胞体的诱发抑制性突触后电流（IPSC）。在许多研究中，这种方法已被用于检查SV池的动力学(Chung等人，2010年;Ferguson等人，2007年). 我们测量了wt和西普−/−神经元，发现这些参数没有改变(图S3、A和B). 通过配对脉冲比测量的短期塑性在西普−/−神经元(图S3、C和D). 这些结果表明，syp的缺失不会影响神经递质释放概率、突触后反应或短期突触可塑性，这与之前的研究一致(McMahon等人，1996年).
然后我们测试了syp在维持持续神经元活动期间是否在维持循环SV池中发挥作用。为此，我们通过以10 Hz的频率发送100个脉冲序列来刺激神经元，并在序列中监测IPSC的抑制情况。wt和西普−/−神经元在20次刺激后出现，并在以后的时间点变得更加明显；在100个刺激结束时，只有很小的IPSC可以被激发出来西普−/−神经元，表明几乎没有剩余的小泡准备融合(). IPSCs的平均稳态振幅，通过对最后10个响应进行平均来确定，如下所示：0.171±0.04（wt），0.060±0.01(西普−/−). 观察到的明显突触抑制西普表达wt-syp可以完全拯救−/−神经元(). 相比之下，ΔC-syp未能挽救西普−/−神经元(). 连同上述调查结果()，我们得出结论，C末端细胞质结构域的丢失导致SV内吞效率低下，并在持续的神经元活动期间出现明显的突触抑制。
突触抑制和恢复的时间进程西普−/−神经元（A） wt（顶部）和西普在3 mM Ca中以10 Hz进行100次刺激期间的−/−（底部）2+.
（B） （顶部）标准化IPSC振幅（wt）（黑色）和西普持续10 Hz刺激期间的−/−（白色）神经元。数值为7 wt和7 wt的平均值西普−/−神经元。振幅值标准化为列车中的第一个响应。（底部）为了清楚起见，显示了10 Hz刺激期间前20个响应的平均值。
（C） 在3 mM Ca中以10 Hz频率100次刺激时wt-syp（Top）和ΔC-syp（Bottom）神经元中IPSC的代表性痕迹2+.
（D） wt-型救援（灰色）和ΔC-syp神经元（灰色三角形）的归一化IPSC振幅与wt和西普−/−数据来自(B类). 值是8 wt-syp和6ΔC-syp样品的平均值。
（E） 囊泡池回收实验中IPSC的代表性痕迹。神经元受到两个不同阶段的刺激：在4 mM Ca中以10 Hz进行200次刺激2+循环SV池的最大消耗，然后在0.5 Hz的轻度刺激下进入恢复阶段。
（F） wt（黑色）和西普恢复期的−/−（白色）神经元。振幅值归一化为耗尽阶段的第一响应，并用单指数函数拟合。数值为8 wt和8 wt的平均值西普−/−神经元。
所有误差条均为SEM。
我们还测量了回收SV池的回收时间过程。以10赫兹的频率刺激神经元20秒以耗尽小泡，短暂停顿后，以0.5赫兹的频率对其进行刺激以监测IPSC的再生长(). 所有响应的振幅均归一化为列车期间的第一个响应。年，从消耗中恢复的速度明显较慢西普−/−神经元(). 我们注意到，即使在我们能够使用的最强烈的刺激下，wt神经元中的可释放囊泡池也没有完全耗尽，而不会影响细胞活力（200个AP，4 mM Ca中10 Hz2+). 然而，与西普−/−神经元（τ=12.8 s）()，与上述pHfluorin实验的结果一致。
讨论
这里报道的数据坚定地确立了syp在促进哺乳动物中枢神经元快速有效SV内吞中的作用。Syp公司在神经元活动期间和之后，−/−神经元均表现出SV内吞缺陷，而SV外吐和总循环池的大小不受影响。syp的C末端尾部截短导致神经元活动期间内吞减慢，这与之前的一项研究一致，该研究将尾部片段注射到乌贼的巨大轴突中(Daly等人，2000年). 然而，相同的截断突变对神经元活动后的内吞作用没有影响；因此，两个内吞过程（一个是在刺激期间，另一个是刺激后）由syp的不同域控制。
观察到的SV内吞缺陷西普−/−神经元会导致功能性后果，包括明显耗竭和循环SV池恢复较慢。刺激后内吞作用的缓慢时间常数似乎与wt和西普持续刺激期间的−/−神经元(). 在西普−/−神经元促使我们测试在没有syp的情况下，快速恢复或“接吻和奔跑”小泡内吞受到影响的可能性。我们注意到，kiss-and-run/fast retrieval（在约1秒内）是否是海马突触内吞的常见模式仍然存在争议(Balaji等人，2008年;Ertunc等人，2007年;Granseth等人，2006年;Zhang等人，2009年). 我们计算了刺激期间发生的囊泡回收率，作为总循环池的一部分（由Baf轨迹中的最大ΔF值确定）(). 对于wt神经元，在1s内只有约1.3%的循环池发生内吞作用；这一结果与快速检索（即kiss-and-run）在持续传播过程中占主导地位的观点相矛盾。因此，这些结果表明，突触抑制时间进程在wt和西普−/−神经元不能归因于假定的快速内吞作用的丧失。
脑脊髓炎明显突触抑制的另一种解释西普−/−神经元是指syp可能调节另一个相对快速的步骤，例如清除囊泡释放位点(Neher，2010年). 胞吐后，需要破坏囊泡和靶膜上SNARE蛋白之间的相互作用，以允许囊泡再循环。Syp可能通过与synaptobrevin II结合并将其从活性区清除来促进这一过程。syp的丢失可能导致释放位点的囊泡成分“交通堵塞”，从而导致持续活动期间的突触抑制。然而，目前尚不清楚释放位点的清除是否是海马突触中的速率控制步骤。最后，我们注意到，由于几个技术差异，从pHorion成像实验和生理记录中读取的结果可能无法直接相互比较。这些包括（成像与电生理）刺激神经元的不同方法（场刺激与局部刺激）以及时间分辨率的差异（“ms”与“ms”）。因此，对于直接比较这两种实验方法的数据有一些警告。
我们考虑了在没有syp的情况下如何影响SV内吞的以下可能性：（1）单一内吞事件变慢，或（2）可以同时检索到的SV数量，即“内吞能力”减少，而单个SV的内吞未受影响(Balaji等人，2008年). 由于我们只测量了囊泡提取的宏观时间过程，我们无法完全区分这两种可能性。然而，补偿性囊泡恢复的发现西普−/−只有在300次刺激后才变慢，这是第一种情况。事实上，据报道，单一内吞事件的发生率在很大程度上是不变的(Balaji等人，2008年). 因此，我们认为syp的作用是维持突触的内吞能力。在分子水平上，syp可能招募或促进内吞成分的组装，以便在持续的神经元活动期间和之后保持可用的“内吞机器”数量。
在syp和突触素双基因敲除小鼠中，长时程增强受损（一种用于学习和记忆的神经基质）是否会进一步影响SV的内吞作用，这将是一个有趣的问题(Janz等人，1999年). 未来的研究还将侧重于syp与结合伙伴相互作用的分子机制，例如syptobevin II、dynaminI和适配器蛋白I，以控制囊泡再循环(Daly和Ziff，2002年;Edelmann等人，1995年;Glyvuk等人，2010年;Horikawa等人，2002年). 鉴于syb II在囊泡内吞作用中起作用，并且syp促进syb II的囊泡定位，很容易推测syp在有效SV内吞中的作用可能涉及与syb II之间的物理相互作用(Deak等人，2004年;Hosoi等人，2009年;Wienisch和Klingauf，2006年).
实验程序
分子生物学
Syt1-pH和sypHy构件分别由T.A Ryan（纽约州纽约市）和L.Lagnado（英国剑桥市）提供。SV2A-pH如所述补充实验程序
活细胞成像
用浴液（140 mM NaCl、5 mM KCl、2 mM CaCl）持续灌注神经元2，2 mM氯化镁210 mM HEPES、10 mM葡萄糖、50μM D-AP5、10μM CNQX，在成像期间在室温下用葡萄糖调节至310 mOsm，pH 7.4）。在休息或清洗步骤中，2 mM Ca2+替换为2 mM Mg2+。对于现场模拟，使用ClampEX 10.0通过成像室中间距为10 mm的两根平行铂丝数字传输1ms恒定电压脉冲（70 V）（华纳仪器）。在带有100×油物镜的倒置显微镜（Nikon TE300）上，在氙光源（Lambda DG4）的照射下，以1秒的间隔拍摄的延时图像。使用Cascade 512II EMCCD相机（Roper Scientific）和2×2箱检测单个香肠的荧光变化；使用MetaMorph 6.0软件离线收集和分析数据。请参见补充实验程序了解详细信息。
电生理学
使用pClamp 10驱动的AxoPatch 200B放大器（分子器件）对诱发的IPSC进行全细胞电压灯记录。内部移液管溶液含有以下物质（单位：mM）：135 CsCl2、1个EGTA、10个HEPES、1个NaGTP、4个QX-314（pH 7.4）。用细胞外液（ECF）持续灌注细胞：140 mM NaCl，5 mM KCl，3 mM CaCl2，2 mM氯化镁210 mM HEPES、10 mM葡萄糖、50μM D-AP5、10μM CNQX，用葡萄糖调节至310 mOsm，pH 7.4。串联电阻明显大于20 MΩ的记录被丢弃。当4 mM Ca2+用作，[镁2+]将其降低至1 mM。用电压为20–30 V的θ刺激电极刺激突触前神经元1 ms，从而诱发动作电位。数据在10 kHz下采样，并在2 kHz下过滤。
致谢
我们感谢M.Jackson和X.Lou对这份手稿的评论。我们还感谢M.Dong和M.Dunning对用于开展这项工作的cDNA构建的帮助。这项研究得到了NIH（MH061876）的资助。S.E.K得到了癫痫基金会的产前研究金的支持。E.R.C是霍华德·休斯医学研究所的研究员。
脚注
出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。
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