组蛋白去乙酰化酶活性降低介导肝细胞在缺血和再灌注损伤期间高迁移率族蛋白1的释放^*

体内热I/R模型

使用了先前描述的I/R方案，该方案涉及节段性（70%）肝热缺血的非致命模型(18). 假动物接受了麻醉、剖腹手术和暴露门静脉三联征，但没有肝脏缺血。对基线或未经治疗的动物进行麻醉，并在不暴露门静脉三联体的情况下处死。

肝细胞分离

用就地胶原酶（IV型，西格玛）灌注技术，如前所述(19). 通过光学显微镜评估，肝细胞纯度超过98%，通过台盼蓝排除试验测定，肝细胞存活率通常大于95%。

细胞培养和治疗

肝细胞（3×10⁶)将其置于6厘米的涂胶塑料组织培养皿上。初始培养基为含有10%小牛血清的William’s培养基E，15 m米Hepes，2米米 我-谷氨酰胺和100单位/ml的青霉素和链霉素。允许肝细胞在一夜之间附着在平板上。然后在添加化学抑制剂之前更换培养基。对于低氧实验，培养基被低氧培养基取代（用1%O平衡₂，5%一氧化碳₂和94%N₂)，并放入缺氧室（Coy）。

核蛋白和细胞质蛋白的分离

冷冻的肝组织悬浮在一个含有10 m的缓冲液中米Tris，pH 7.5，1.5米米氯化镁₂，10米米KCl和0.1%Triton X-100，并通过均质化进行裂解。样品每5分钟轻轻旋转30分钟，然后以7500 rpm离心5分钟。收集含有细胞质和膜蛋白的上清液，并将其储存在−80°C下。核蛋白在4°C下提取，方法是将核颗粒轻轻重新悬浮在含有20 m的缓冲液中米Tris，pH 7.5，20%甘油，1.5 m米氯化镁₂，420米米氯化钠，0.2米米EDTA和0.1%Triton X-100。偶尔出现漩涡1小时后，在4°C下以13000 rpm离心再悬浮核蛋白15分钟，并收集含有核蛋白的上清液。蛋白质浓度用BCA蛋白质分析试剂（Pierce）测定。

SDS-PAGE和Western印迹

20μg蛋白质在SDS缓冲液中稀释，并在SDS-PAGE凝胶上运行（8、10、12%）。将样品转移至硝化纤维素中过夜，并用5%的BSA封闭8 h。然后用一级抗体培养过夜，其中包括抗HMGB1（1:1000；Abcam）；抗乙酰赖氨酸（1:1000，细胞信号）、抗HDAC1（1:1000；圣克鲁斯生物技术）；抗pHDAC1（1:1000；Abcam）；抗HDAC4（1:1000；圣克鲁斯生物技术）；抗pHDAC4（1:1000；Abcam）、抗组蛋白H3、Ac-H3-Lys9、Ac-H3-Lys18（1:1000，细胞信号）。清洗后，将膜与辣根过氧化物酶偶联兔或鼠二级抗体（1:5000至1:10000）在5%牛奶中孵育1小时，并使用Super Signal West Pico化学发光试剂盒（Pierce）进行开发。

HDAC比色活性测定

HDAC活性比色测定试剂盒（Abcam，ab1432）根据制造商的协议使用。简单地说，将100μg核蛋白稀释成85μl ddH的最终体积₂O并放置在一个圆形底部96-well板中。向每个孔中添加10μl 10×分析缓冲液，然后添加5μl HDAC比色底物。将混合物在37°C下培养3 h。然后添加10μl赖氨酸显影剂，并将平板在37°C下培养30 min。在405 nm处的ELISA平板阅读器中读取样品。

光染色法

细胞在盖玻片上培养，用冷PBS洗涤两次，用PBS中的2%多聚甲醛固定15分钟，在室温下用PBS中的0.1%Triton X-100透化30分钟，并用PBS中的5%BSA封闭1小时。然后将细胞与1%BSA中的HMGB1特异性一级抗体（Abcam，ab18256）孵育1小时，洗涤，并与二级抗体（AlexaFluor 488山羊抗兔，Invitrogen）孵育。F-actin用罗丹明-阴茎倍体素（Invitrogen）染色。细胞用带DAPI核染色的Vecta-Shield贴壁培养基贴壁。用奥林巴斯Provis和徕卡TSL-SL免疫荧光显微镜观察幻灯片。

细胞转染和RT-PCR

2.0×10浓度的小鼠肝细胞⁶接种在6厘米的培养皿中。让肝细胞整夜粘附。使用脂蛋白转染试剂（Invitrogen）将细胞清洗并转染到含有HDAC1 siRNA（Santa Cruz Biotechnology，sc-29344）或打乱的对照siRNA（圣克鲁斯Biotechnology，sc-37007）的Opti-Mem无血清培养基中6小时。分别在24小时和40小时分析HDAC1 mRNA和蛋白质的总水平。对于HDAC1 mRNA表达，根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取总RNA。使用钛一步法PCR试剂盒（Clontech）和HDAC1-HDAC9引物进行RT-PCR。

协同免疫沉淀

用1μg抗乙酰赖氨酸或HMGB1抗体在200μg全裂解物蛋白或40μl在IP缓冲液中稀释的血清（50 m米Hepes，0.5%Nonide P-40，150米米氯化钠、10%甘油、1 m米EDTA）。正常兔IgG作为阴性对照。样品首先用非特异性IgG抗体进行预处理。然后将预澄清的裂解物与抗乙酰赖氨酸或HMGB1抗体孵育过夜，然后与蛋白A/G-琼脂糖孵育2 h。样品用PBS洗涤四次，并进行Western blot分析。

肝脏I/R和缺氧后核HDAC活性降低

由于乙酰化HMGB1的水平随着肝脏I/R和缺氧而增加，我们使用比色法评估I/R期间的核HDAC活性。我们发现，在缺血和早期再灌注期间，与基线动物相比，I/R动物肝组织中的核HDAC-活性显著降低(图2A类). 此外，在Lys-9和Lys-18进行I/R后，乙酰化组蛋白H3的水平也增加(图2B类). 这些结果表明，核HDAC活性的降低导致核乙酰化/脱乙酰化平衡的净增加，从而促进HMGB1超乙酰化。体外，在8小时和24小时，肝细胞中的核HDAC活性也被1%的缺氧抑制(图2C类). 这些发现表明HDAC活性受到抑制体内在I/R和在体外缺氧期间。这反过来又导致HDAC底物（包括组蛋白和HMGB1）的超乙酰化。

在单独的窗口中打开

图2。

肝脏I/R和缺氧后，核HDAC活性降低。 A类从缺血/再灌注小鼠肝脏中提取核蛋白。HDAC活性通过比色法测定。*，第页< 0.05. 所示的测定是具有相似结果的三个实验的代表。B类假手术和1 h I/R小鼠乙酰化（Lys-9和Lys-18）和总H3的Western blot。C类，肝细胞暴露于缺氧（1%O₂)1、4、8和24小时，分析核蛋白的HDAC活性。*，第页< 0.05. 所示的分析是具有类似结果的三个实验的代表。

抑制HDAC导致HMGB1的核胞质移位和HMGB1释放

为了进一步研究HDAC和HMGB1之间的关系，用HDAC抑制剂曲古抑菌素A（TSA）处理小鼠肝细胞。TSA以前曾在培养的大鼠肝细胞中进行过检测(21，22)，剂量高达50μ米被很好地容忍。我们发现剂量为1μ米治疗后24小时内在正常或缺氧培养条件下对肝细胞无毒(图3A类). 用TSA处理肝细胞24 h，并对HMGB1的细胞培养上清液进行Western blot分析。与基线检查时上清液中HMGB1含量较低相比，TSA诱导HMGB1释放到上清液的水平与H类似₂O（运行）₂处理(图3B类). 此外，我们发现TSA处理与细胞培养上清液中乙酰化HMGB1的量之间存在剂量依赖性关系，表明HMGB1乙酰化与其细胞外释放之间存在关系(图3C类). 接下来，我们用TSA处理肝细胞8小时，并对HMGB1进行免疫荧光染色。未经处理的肝细胞显示HMGB1的强核定位，而HDAC抑制和H刺激₂O（运行）₂8小时诱导HMGB1核-细胞质易位(图3D类). 我们还使用高含量分析来量化HDAC抑制对肝细胞HMGB1易位的影响(图3E类). 正如预期的那样，8小时缺氧处理导致HMGB1从细胞核转移到细胞质的活肝细胞比例急剧增加。此外，TSA治疗在常压下诱导HMGB1易位阳性细胞的比例呈剂量依赖性且具有统计学意义的增加。我们还使用了另一种HDAC抑制剂Scriptaid及其非活性类似物Nullscript来研究HDAC抑制对HMGB1易位的影响。结晶紫染色显示剂量为10 m米对肝细胞无毒（数据未显示）。通过Western blot分析，HMGB1在基线时主要存在于细胞核中。添加Scriptaid诱导的HMGB1在8小时时从细胞核易位到胞浆(图3F类). 相反，Nullscript处理的肝细胞保持HMGB1的恒定核-细胞溶质比率。这些结果表明，HDAC抑制促进肝细胞中乙酰化HMGB1的核质易位和释放，支持HDAC调节HMGB1。

在单独的窗口中打开

图3。

抑制HDAC导致HMGB1的核-胞质易位和HMGB1释放。 A类用Crystal Violet染色检测1μ米美国运输安全管理局。B类、TSA处理后大鼠肝细胞上清液HMGB1的Western blot分析或500μ米H（H）₂0₂治疗。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。C类TSA处理后细胞上清液的联合免疫沉淀。用抗HMGB1免疫沉淀细胞并免疫印迹抗乙酰赖氨酸。所示斑点是具有类似结果的三个实验的代表。D类，大鼠肝细胞用1μ米TSA或500μ米H（H）₂0₂并对HMGB1进行染色。绿色HMGB1；蓝色，细胞核；红色，F-肌动蛋白。所示的图像是具有类似结果的三个实验的代表。E类肝细胞培养中HMGB1易位的高含量分析。对细胞进行HMGB1免疫染色，并使用细胞组学对细胞核和细胞斑点区室中的染色强度进行定量^TM（TM）Arrayscan®平台。使用Spotfire Decisisite软件确定“HMGB1易位阳性”和“HMGB1-易位阴性”细胞群。*，第页< 0.05.F类10 m处理的原代大鼠肝细胞核和细胞质蛋白HMGB1的Western blot分析米HDAC抑制剂Scriptaid或其非活性类似物Nullscript，并受到缺氧（1%O₂)针对不同的时间点。

HDAC1和HDAC4在小鼠肝细胞中表达

上述HDAC抑制剂对特定的HDAC同种型不是特异性的，并且HDAC活性测定测量所有HDAC的活性。为了首先确定HDAC亚型在小鼠肝细胞中表达最强烈，对从肝细胞培养物中分离的RNA进行RT-PCR。最高表达的HDAC mRNA是HDAC1和4(图4A类). 接下来，为了评估HDAC1和HDAC4是否因I/R损伤而改变，对小鼠进行肝脏I/R，并对假手术和1h I/R动物的蛋白质进行Western blots分析。与在体外结果，HDAC1和HDAC4蛋白在小鼠肝脏中表达(图4B类). 此外，在I/R后，HDAC1和HDAC4的蛋白水平保持不变。因此，我们假设，I/R或氧化应激后总核HDAC活性的降低是由于HDAC1与HDAC4调节，而不是其总蛋白水平的变化。

在单独的窗口中打开

图4。

HDAC1和HDAC4在小鼠肝细胞中表达。 A类，大鼠肝细胞中HDAC 1-9的RT-PCR。B类、小鼠肝细胞核蛋白提取物HDAC1和HDAC4的Western blot分析。Jurkat核提取物被用作HDAC1和-4的阳性对照。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。C类I/R后对缺血肝组织核提取物进行Western blot分析。对磷酸化HDAC1和总HDAC1进行免疫印迹。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。D类小鼠肝细胞缺氧，通过Western blot分析pHDAC1和tHDAC1。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。

接下来，我们重点研究HDAC1的脱乙酰酶活性，因为其活性部分取决于其磷酸化状态(23，24). 我们检查了肝脏I/R是否改变了HDAC1磷酸化状态。与基线相比，缺血1小时导致磷酸化HDAC1减少(图4C类). 再灌注后，磷酸化HDAC1水平保持较低，但与缺血相比有所增加。然后，我们将肝细胞暴露于1%的缺氧条件下，并对核提取物中磷酸化的HDAC1进行Western blot分析。到2小时，磷酸化HDAC1水平显著下降。因此，缺氧似乎是肝细胞中HDAC1去磷酸化的强烈刺激物。

HDAC1的特异性抑制促进核HMGB1向细胞质的易位并增加HMGB1的释放

为了更具体地研究HDAC1在HMGB1释放中的作用，用HDAC1 siRNA转染肝细胞并经受8小时的缺氧。添加HDAC1 siRNA，但不添加搅乱的siRNA，会降低常氧和缺氧条件下HDAC1 mRNA和蛋白质的水平(图5，A类和B类). 然后，我们评估了HDAC1 siRNA处理细胞在基线和缺氧条件下HMGB1的定位。向正常氧合细胞中添加HDAC1 siRNA后，HMGB1从细胞核中动员到细胞质中，缺氧后，更多的HMGB1移位到细胞质(图5C类). 对这些肝细胞上清液的Western blot分析支持了这些发现。缺氧单独导致HMGB1释放增加。HDAC1敲除增强了这种作用，而添加扰乱的siRNA没有影响(图5D类). 我们的研究结果表明，HDAC1在改变HMGB1的定位和释放方面具有潜在作用。

在单独的窗口中打开

图5。

HDAC1的特异性抑制促进核HMGB1向细胞质的移位，并增加HMGB1的释放。用打乱的siRNA或HDAC1 siRNA转染小鼠肝细胞，并在转染后24小时进行RT-PCR(A类)或Western印迹(B类)转染后40h分析。所示的印迹代表了具有相似结果的三个实验。C类，肝细胞转染10μ米40–48小时后通过免疫荧光染色分析HDAC1 siRNA。在常压缺氧或缺氧1、4和8小时（1%氧自由基）后对细胞进行分析₂)通过免疫染色。绿色HMGB1；蓝色，原子核。所示的图像是具有类似结果的三个实验的代表。D类，缺氧8h后转染HDAC1 siRNA的肝细胞上清液中HMGB1的Western blot。所示的印迹是具有类似结果的三个实验的代表。