老龄化（纽约州奥尔巴尼）。2016年2月；8（2）：328–344。
NKG2D配体介导衰老细胞的免疫监视
，#1 ，#1,5 ，1 ，1 ，2 ，三 ，4 ，2和1
阿迪·萨吉夫
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
多米尼克·G·A·伯顿
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
5现住址：英国伯明翰阿斯顿大学生命与健康科学学院
扎纳·莫沙耶夫
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
埃兹拉·瓦代
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
希夫拉·本多尔
三以色列雷霍沃特魏茨曼科学研究所生物信息学和生物计算部门
奥夫拉·戈拉尼
4以色列Rehovot Weizmann科学研究所生物服务部
瓦列里·克里扎诺夫斯基
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
1以色列Rehovot Weizmann科学研究所分子细胞生物学系
2克罗地亚里耶卡大学医学院
三以色列Rehovot Weizmann科学研究所生物信息学和生物计算股
4以色列Rehovot Weizmann科学研究所生物服务部
5现住址：英国伯明翰阿斯顿大学生命与健康科学学院
#贡献均等。
2015年12月18日收到；2016年1月27日接受。
这是一篇根据知识共享署名许可证条款分发的开放存取文章，该许可证允许在任何媒体上不受限制地使用、分发和复制，前提是原始作者和来源得到了认可。
- 补充资料
GUID:7F116CBD-C01A-41AC-9081-C7C3E8A4CCC9
摘要
细胞衰老是一种限制肿瘤发生和组织损伤的应激反应机制。细胞衰老的诱导通常与免疫原性表型一致，该表型促进免疫系统成分的自我抑制，从而促进肿瘤抑制和限制伤口修复过程中的过度纤维化。衰老细胞调节免疫监视的机制尚不完全清楚。在这里，我们发现激活的自然杀伤细胞受体（NKG2D）、MICA和ULBP2的配体在诱导复制性衰老、肿瘤诱导衰老和DNA损伤诱导衰老后持续上调。MICA和ULBP2蛋白对于NK介导的对衰老成纤维细胞的有效细胞毒性是必需的。衰老细胞中NKG2D配体初始表达的调节机制依赖于DNA损伤反应，而这些配体的持续表达受ERK信号通路的调节。在肝纤维化中，缺乏NKG2D受体的小鼠中衰老活化星状细胞的积累增加，导致纤维化加剧。总的来说，我们的结果为调节衰老细胞中免疫配体表达的机制提供了新的见解，并揭示了NKG2D受体-受体相互作用在预防肝纤维化中的重要性。
关键词：衰老、DNA损伤反应、纤维化、自然杀伤细胞、NKG2D、ERK
简介
虽然衰老细胞曾被认为是细胞周期停滞的被动状态，但现在已知其控制着诸如肿瘤预防和组织修复等生理过程[1-5]。衰老状态可以通过对各种应激源的反应而诱导，从而导致不可逆的细胞周期阻滞，并经常导致分泌体的改变。这些应激源包括端粒功能障碍、癌基因激活、直接DNA损伤、细胞内活性氧（ROS）升高和细胞间融合[1-三，6]。衰老程序的许多触发因素与持续的DNA损伤反应（DDR）有关，从而导致共济失调毛细血管扩张症突变（ATM）和共济失调毛细管扩张症及RAD3相关（ATR）的激活[7-9]。ATM和ATR可以通过促进p53积累来抑制细胞周期进程，p53积累随后调节许多靶基因，包括细胞周期依赖性激酶抑制剂p21（CDKN1A）。衰老细胞的染色质组织也发生显著变化，导致pRb-p16通路激活，该通路与DDR-p53通路并行作用，诱导并维持细胞周期阻滞[10，11]。因此，由多种信号通路调节的衰老诱导通过限制肿瘤发生和组织损伤发挥重要的生理功能。
虽然衰老细胞的短暂出现起着重要的生理作用，但衰老细胞的长期存在可能通过持续分泌促炎因子而促进病理状态[2，4，12，13]。化学引诱剂的分泌和粘附分子的上调也形成了通常归因于衰老细胞的免疫原性表型的一部分[14，15]。这种表型可促进免疫系统对衰老细胞的自我抑制，并可防止其存在所引发的长期负面影响[1，14，16]。衰老细胞与免疫系统的相互作用对于实现衰老细胞的生理功能和防止其存在的长期负面后果是必要的。
衰老细胞的主要生理功能之一是抑制肿瘤[17，18]。衰老细胞的免疫监视有助于这种作用。在肿瘤抑制因子重新激活后，肿瘤细胞变得衰老，并被先天免疫系统的组成部分瞄准[19]。突变型N-RAS表达后，癌前衰老肝细胞接受适应性免疫反应介导的免疫清除[20]。对这些肝细胞的免疫监测受损会促进小鼠发生肝细胞癌，这表明了衰老细胞免疫监测作为肿瘤抑制功能的重要性。
除了在肿瘤抑制中的作用外，衰老细胞的免疫清除对于限制短期组织损伤反应也是必要的[21，22]。激活的肝星状细胞中细胞衰老的诱导限制了损伤后的肝纤维化。随后，衰老细胞被自然杀伤细胞（NK）清除，以确保纤维化的适当逆转[21]。为了消除衰老细胞，NK细胞利用颗粒胞吐作用，而不是死亡受体介导的途径，而死亡受体在衰老细胞中被DCR2抑制[23]。颗粒胞吐途径对于清除纤维化肝脏中的衰老细胞，从而抑制纤维化的发展是必要的。因此，NK细胞介导的免疫监测对于肿瘤发生、肿瘤治疗和组织损伤过程中衰老细胞的免疫监测是必要的。
NK细胞是先天免疫系统的组成部分，对病毒感染细胞和肿瘤细胞具有快速反应[24，25]。NKG2D（NCBI符号KLRK1）受体是NK细胞活化的受体之一，与NK细胞在肿瘤发生和肿瘤治疗过程中与衰老细胞的相互作用有关[26，27]。NKG2D受体识别应激细胞表面的配体MICA/B和ULBP1-6，导致直接细胞毒性[24，28，29].
迄今为止，我们对衰老细胞与NK细胞相互作用的理解主要来自于少数研究，这些研究侧重于癌症细胞而非生理正常细胞的衰老诱导[26，27]。由这些正常细胞衍生的衰老细胞在组织损伤部位和衰老过程中积累。因此，我们研究了来自正常细胞的衰老细胞与NK细胞相互作用的调节机制。我们发现，由各种刺激诱导的衰老细胞在其细胞表面呈现NKG2D配体MICA和ULBP2，使其能够被NK细胞识别和消除。配体的表达受DNA损伤反应和ERK信号调节。小鼠NKG2D受体敲除可阻止肝损伤期间衰老细胞的有效清除，导致肝纤维化加剧。总之，我们的研究为衰老细胞的免疫监视机制及其调控途径提供了新的见解。
结果
衰老细胞中NKG2D配体的表达升高
NK细胞介导的对衰老细胞的免疫监测限制了肿瘤的发生和组织损伤。为了实现这一功能，NK细胞通过颗粒胞吐途径优先诱导衰老细胞的细胞死亡[23]。我们旨在确定NK细胞特异性识别衰老细胞的机制，从而激活对衰老细胞的特异性细胞毒性。NK细胞表达NKG2D受体，这与NK细胞和受损细胞之间的相互作用有关，包括因p53活化或化疗而衰老的癌细胞[19，26，27]。因此，我们评估了在经典刺激下经历衰老的细胞是否转录上调了常见NKG2D配体。在人类细胞中，这些配体是ULBP1-6、MICA和MICB。用足叶乙甙（DIS）处理正常人成纤维细胞IMR-90细胞，通过直接DNA损伤诱导其衰老；通过延长细胞培养诱导端粒缩短的复制性衰老（RS）；通过H-RAS的过度表达诱导癌基因诱导衰老（OIS）第12版。使用几种常见的生物标记物证实了细胞衰老(图S1)并评估不同NKG2D配体的表达水平。与生长的对照细胞相比，NKG2D配体MICA、ULBP1和ULBP2在所有三种类型的衰老IMR-90成纤维细胞中持续上调至少两倍（p<0.05；图分别用于DIS、RS和OIS单元）。值得注意的是，除了MICA、ULBP1和ULBP2外，与生长细胞相比，在OIS细胞中观察到ULBP4的表达增加了五倍，但在DIS或RS细胞中没有观察到（p＜0.0001；图). 因此，衰老的IMR-90细胞上调NKG2D受体几个配体的mRNA水平。
衰老细胞上调NKG2D配体RT-PCR分析表明MICA、ULBP1和ULBP2在DNA损伤诱导衰老（DIS）中持续上调(一个)，复制衰老（RS）(B类)和H-RAS第12版-介导致癌诱导衰老（OIS）(C类)IMR-90成纤维细胞与生长（对照）细胞的比较。类似地，DIS WI38(D类)和BJ(E类)成纤维细胞和DIS肝星状细胞(F类)也显示NKG2D配体上调。这些图表表示至少四个独立实验中至少三次测量的平均值和S.E.M。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
为了排除MICA、ULBP1和ULBP2的表达对IMR-90成纤维细胞具有特异性的可能性，在通过DNA损伤处理诱导衰老的其他成纤维细胞株（即WI38和BJ）中测定了这些配体的表达。与IMR-90细胞类似，与生长细胞相比，衰老的WI38和BJ成纤维细胞显著提高了MICA、ULBP1和ULBP2的表达（p<0.05；图分别适用于WI38和BJ）。然而，与生长细胞相比，衰老的BJ细胞也上调了ULBP4和ULBP5的表达两倍以上（p<0.05；图). 为了评估配体在生理相关细胞类型中的表达，我们评估了活化肝星状细胞（HSC）中NKG2D配体的表达。这些细胞在肝纤维化过程中衰老，对限制纤维化反应至关重要[21]。与之前的结果一致，与生长激活的HSC相比，MICA和ULBP2显著升高两倍（p<0.05；图). 然而，来自活化HSC的衰老细胞并没有上调ULBP1（图。). 此外，与生长细胞相比，衰老激活的HSC升高了MICB、ULBP4和ULBP5（p<0.0001；图). 总的来说，这些发现表明衰老细胞上调NKG2D配体的表达。重要的是，无论衰老诱导刺激如何，这种上调都会发生，这些NKG2D配体的确切表达谱在细胞株和细胞类型之间可能有所不同。
MICA和ULBP2蛋白上调并定位于衰老细胞的细胞表面
配体定位在质膜上，使靶细胞与免疫细胞相互作用。因此，我们想利用DIS细胞作为原理验证模型来确定NKG2D配体是否定位于衰老细胞的细胞表面膜。为此，我们将重点放在MICA和ULBP2定位上，因为它们在我们评估的所有衰老细胞中，尤其是在HSC（一种生理相关的细胞类型）的mRNA水平上持续上调（图). 我们使用结合了成像和流式细胞术的ImageStreamX系统来监测MICA和ULBP2蛋白的强度和定位（图).
衰老细胞上调细胞表面的MICA和ULBP2(一个)ImageStream分析表明，与对照（生长）细胞相比，DIS IMR-90成纤维细胞（衰老）的细胞表面膜上MICA和ULBP2的表达水平更高。(B类)总强度和总膜强度的量化表明DIS IMR-90细胞中的MICA和ULBP2水平高于生长（对照）细胞。(C类)在非渗透性细胞上进行的MICA和ULBP2的代表性免疫荧光染色表明，与生长（对照）细胞相比，DIS WI38和BJ细胞的细胞表面膜上这些蛋白的表达水平更高。比例尺：50μm。MICA和ULBP2显示为红色。DAPI显示为蓝色。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
随后测量DIS IMR-90细胞中MICA或ULBP2蛋白的总强度和膜结合强度。该分析显示，MICA和ULBP2的总强度升高了两倍（MICA的p＜0.001，ULBP2的p＜0.0001；图)与生长细胞相比，衰老细胞的细胞膜上蛋白质的强度也提高了两倍（MICA为p<0.05，ULBP2为p<0.0001；图). 值得注意的是，对DIS IMR-90细胞进行标准流式细胞术分析也证实了细胞表面膜上的MICA和ULBP2蛋白上调(图S2A). 通过免疫细胞化学的荧光强度测定，与生长细胞相比，DIS WI38、BJ和IMR90细胞中MICA和ULBP2的蛋白质丰度也有所增加（图和图S2B). 这些发现表明，MICA和ULBP2的转录上调随后与蛋白质丰度的升高相关，蛋白质丰度位于NK细胞可能识别的细胞膜上。
MICA和ULBP2促进NK细胞介导的细胞毒性作用
在应激细胞的细胞表面出现NKG2D配体后，表达NKG2D受体的NK细胞可以识别这些细胞并与之相互作用，以促进特异性细胞毒性[24，30]。我们之前已经证明NK细胞对衰老细胞具有特异性细胞毒性在体外[21，23].
值得注意的是，我们的细胞毒性方法使用活性测定法在共同孵育期结束时量化剩余的活细胞。传统的NK介导的细胞毒性试验依赖于靶细胞负载51使用衰老细胞时不能使用Cr，因为有效负荷需要细胞增殖的阈值水平[31]这在衰老细胞中是无法实现的。NKG2D配体存在于衰老细胞的膜上（图)，我们现在的目的是确定这些配体是否是NK细胞介导的对衰老成纤维细胞的细胞毒性所必需的。我们用针对MICA和ULBP2的阻断抗体处理DIS衰老IMR-90细胞，并用NK92 NK细胞系培养这些细胞（图)或原代人类NK细胞（图)并评估细胞毒性程度。单独使用针对MICA或ULBP2的阻断抗体可将NK92介导的对衰老细胞的细胞毒性降低25%（p<0.05；图)然而，与同型对照抗体相比，MICA和ULBP2的联合抑制将NK92和原代NK细胞的细胞毒性降低到了一半以下（p<0.05；图). 为了评估NKG2D受体本身对衰老细胞识别的贡献，我们在与衰老细胞共培养之前，使用阻断抗体阻断NK细胞上的NKG2D受体。受体的阻断显著降低了NK92和原代NK细胞对衰老细胞的细胞毒性（NK92为80%，p＜0.001，原代NK为90%，p＜0.0001；图). 因此，阻断MICA、ULBP2及其受体NKG2D之间的相互作用可显著降低NK细胞介导的对衰老细胞的细胞毒性。
NKG2D受体-受体相互作用介导NK细胞对衰老细胞的识别生长和衰老（DIS）IMR-90成纤维细胞与NK92共同培养(一个)或原代NK细胞(B类)在存在不同阻断抗体的情况下，2小时后评估对衰老细胞的细胞毒性百分比。(C类，D类)使用特异性siRNA敲除MICA和ULBP2，并通过定量RT-PCR评估敲除效率。(E类)在敲除衰老或生长（对照）细胞中的MICA和ULBP2后，评估NK92细胞对衰老细胞的细胞毒性程度。以三个独立实验的S.E.M平均值表示的数据*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
为了使用独立的方法评估配体对NK细胞识别衰老细胞的影响，使用特定的siRNA混合物下调MICA和ULBP2的表达。定量RT-PCR证实，siRNAs诱导MICA和ULBP2至少75%的敲除（p<0.0001，图分别适用于MICA和ULBP2）。单独敲除MICA或ULBP2可将NK92介导的细胞毒性降低三分之一（p<0.05；图)而MICA和ULBP2的联合敲除完全阻断了NK细胞对DIS细胞的细胞毒性（p<0.0001；图). 因此，衰老细胞中MICA和ULBP2的表达对于NK介导的对这些细胞的细胞毒性是必要的。总的来说，这些发现表明NKG2D受体与干扰素的相互作用对于NK介导的衰老细胞的杀伤至关重要。
DNA损伤反应上调ULBP2的表达，但不上调MICA的表达
为了了解衰老细胞和NK细胞之间相互作用的调节，我们旨在支持在衰老诱导过程中促进NKG2D配体转录上调的机制。重要的是，我们观察到衰老细胞中MICA和ULBP2 mRNA转录水平与细胞表面膜蛋白表达水平之间的相关性（图。和图。). 因此，我们决定将研究重点放在调节衰老细胞中NKG2D配体mRNA表达的分子机制上。NKG2D配体可以上调以响应不同形式的细胞应激，包括DNA损伤[27，32]。DDR在衰老细胞中被激活，因此我们想了解此途径对MICA和ULBP2表达的调节作用。基因组应激后配体的上调可能是细胞进入衰老时维持的早期反应，也可能是后期发生的衰老特异性反应。为了区分这两种可能性，我们测定了九天内导致IMR-90、WI38和BJ细胞完全衰老表型的MICA和ULBP2的表达动力学。MICA的表达式（图)和ULBP2（图)在用100μM足叶乙甙处理增殖细胞后的第0、1、3、5、7和9天测定。在足叶乙甙治疗的24小时内，MICA的表达至少增加了两倍，并且在所有细胞株的9天内始终保持较高水平（p<0.001；图). 与非基因对照细胞相比，ULBP2的表达模式稍有不同，在最初的24小时内表达量增加了约三倍，随后减少，但在整个9天内持续上调约两倍（p<0.001）（图). 相比之下，用10μM足叶乙甙处理细胞，诱导短暂的DNA损伤和细胞周期阻滞，而不是细胞衰老，显示MICA的初始上调和半倍上调（p<0.05，图)ULBP2的两倍上调（p<0.001）。在第3天，与用10μM足叶乙甙治疗24小时后的生长细胞相比，ULBP2水平下降了50%（p<0.001，图)而MICA水平保持稳定。因此，短期DNA损伤可激活NKG2D配体的瞬时上调。
衰老细胞中MICA和ULBP2的表达稳定上调，而非静止细胞用足叶乙甙（100μM）处理生长中的IMR-90、WI38和BJ细胞，并通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。MICA的表达(一个)和ULBP2(B类)在治疗24小时后升高，并在整个指定时间点保持在较高水平。第0天的生长细胞作为对照。(C类)用低浓度足叶乙甙（10μM）处理生长细胞以诱导短暂生长停滞，并通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。(D类)IMR-90细胞生长汇合，并继续维持7天，直到细胞静止。与生长和衰老细胞相比，通过RT-PCR评估，静止诱导的细胞周期阻滞不足以提高MICA和ULBP2的表达。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
为了确定MICA和ULBP2的上调是对细胞周期阻滞的反应，还是对DNA损伤的反应，将IMR-90细胞生长到汇合状态，并将细胞再维持7天，通过接触抑制（一种不存在DNA损伤的生长阻滞状态）诱导静止。无增殖标记物Ki67的存在验证了沉默(图S3)以及在随后亚培养时重新进入细胞周期的能力。令人惊讶的是，与增殖对照组相比，静止的IMR-90细胞没有上调MICA或ULBP2的表达，而是下调ULBP2表达（50%，p<0.0001）（图). 因此，细胞周期阻滞本身并不导致NKG2D配体表达上调。
为了评估MICA和ULBP2表达的上调是否受到DDR的调节，在添加100μM足叶乙甙之前，用ATM抑制剂（KU60019）预处理增殖的IMR-90细胞一小时。治疗24小时后评估MICA和ULBP2的表达水平。
与仅用足叶乙甙处理的细胞相比，用ATM抑制剂预处理的细胞没有上调ULBP2的表达，而MICA仍然上调（p<0.0001；图). 为了评估MICA可能通过ATR或DDR的两个分支（包括ATM和ATR）来调节的可能性，我们使用咖啡因进行了实验，咖啡因是ATM和ATMR的抑制剂。咖啡因预处理阻止了ULBP2的上调，而MICA表达进一步上调（p<0.05；图). 为了确定已经确定为衰老的细胞中MICA和ULBP2表达的调节，DIS IMR-90成纤维细胞用ATM抑制剂处理24、48、72和96小时，并每天补充。ATM抑制导致24小时内ULBP2表达降低25%（p<0.001），在以后的时间点进一步降低（48、72和96小时分别为>50%、p<0.0001、p<0.05和p<0.000；图).
DDR对MICA和ULBP2表达的贡献(一个，B类)生长细胞在依托泊苷治疗（100μM）前用ATM抑制剂KU60019（10μM，A）或ATM/ATR抑制剂咖啡因（5mM，B）治疗1小时。24小时后，通过RT-PCR评估MICA和ULBP2的表达水平。(C类，D类)用KU60019（10μM）处理DIS IMR-90细胞24、48、72和96小时，并检测MICA的表达(C类)和ULBP2(D类)在每个时间点通过RT-PCR进行评估。数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
然而，在观察到的所有时间点，ATM抑制也进一步增加了MICA的表达（48小时和72小时p＜0.001，96小时p＜0.05；图). 因此，细胞衰老过程中ULBP2的上调似乎依赖于DNA损伤反应，而MICA的上调受独立于DNA损伤的机制控制。
ERK活性调节MICA和ULBP2的表达
细胞衰老过程中组成性激活的信号通路之一是ERK（图和[33]). 为了确定控制衰老细胞中免疫配体表达的其他分子调控因子，我们分析了ERK信号在调节NKG2D配体表达中的作用。ERK的磷酸化增加其活性，MEK是磷酸化并激活ERK的激酶。为了评估ERK信号对衰老细胞中NKG2D配体表达的影响，DIS和OIS IMR-90细胞在MEK抑制剂（PD184352）存在下维持48小时。Western blot分析证实在这种情况下ERK磷酸化受到抑制（图). 然后，我们评估了用PD184352或载体对照（DMSO）处理的衰老细胞和生长细胞中MICA和ULBP2的表达。在PD184352存在的情况下，未观察到MICA表达的变化，而DIS和OIS细胞中ULBP2表达显著降低（>50%）（DIS和IOS分别为p<0.0001和p<0.05；图). 同样，DIS WI38细胞中ERK的抑制导致ULBP2下调，而对MICA表达没有影响(图S4). 除PD184352外，还评估了另外两种MEK抑制剂（AZD6244和GSK1120212）在24、48、72和96小时内对衰老细胞中MICA和ULBP2表达的影响（图). 虽然这些MEK抑制剂在最初的24小时内导致MICA表达轻度升高，但在随后的时间点，它们导致MICA表达降低25%至50%，特别是在治疗后72小时和96小时（p<0.05；图). 这些抑制剂在24小时内使ULBP2降低20%，在以后的时间点进一步降低25%至60%（p<0.05；图). 排除配体表达在以后时间点减少的可能性是由于细胞死亡而不是ERK抑制就其本身而言，在每个时间点测定细胞活力。与二甲基亚砜处理的细胞相比，使用MEK抑制剂处理的细胞的细胞活力没有显著差异(图S5). 因此，ERK信号对衰老细胞中MICA和ULBP2的持续表达至关重要。
ERK活性调节DIS细胞中MICA和ULBP2的表达对DIS IMR-90细胞和生长细胞的裂解物进行Western blot分析，以评估衰老细胞中ERK1/2的磷酸化，并评估PD184352（10μM，48小时）对ERK1/2磷酸化的影响(一个). 作为对照，评估ERK和微管蛋白的总表达。(B类，C类)在对DIS抑制ERK活性48小时后测定MICA和ULBP2的表达水平(B类)和OIS(C类)单元格。另外两种MEK抑制剂（AZD6244和GSK1120212）也降低了ERK1/2磷酸化(D类和E类)通过RT-PCR评估，在指定的潜伏期内显著降低MICA和ULBP2的表达(F类和G公司). 通过RT-PCR评估，PD184352还显著降低了指示细胞因子的表达(H（H）). 数据以三个独立实验的S.E.M平均值表示。双尾t检验*P<0.05，**P<0.001，***P<0.0001。
除了NKG2D配体外，NK细胞对衰老细胞的免疫监视也受到其他免疫配体和衰老分泌体的调节，其功能是将免疫细胞吸引到衰老细胞的部位[14，25]。有趣的是，DIS IMR-90细胞中ERK的抑制下调了PVR，但没有下调ICAM-1(图S6)，两种与NK介导的细胞毒性有关的免疫调节剂[34，35]。此外，ERK抑制促进衰老分泌体成分（IL-6、IL-8、CXCL1、CXCL10和CCL2）表达的下调，这些成分可以作为免疫细胞的化学吸引剂（图). 这些发现表明，衰老细胞中的ERK活性通过调节NKG2D配体（特别是MICA和ULBP2）的表达以及趋化因子的表达，对其与NK细胞的相互作用至关重要。
NKG2D是NK细胞介导的衰老细胞免疫监测所必需的体内
作为对肝内组织损伤的反应，肝星状细胞（HSC）被激活并进行增殖扩张，这与细胞外基质（ECM）成分的沉积有关[36]。为了防止过度纤维化，活化的HSC经历衰老，随后被NK细胞清除[21]。我们想确定NKG2D受体-受体相互作用是否是NK介导的衰老细胞免疫清除所必需的体内肝纤维化。重要的是，小鼠Nkg2d-配体在WT小鼠的纤维化肝脏中被上调，并以Nkg2d依赖的方式介导活化HSC的NK杀伤，从而改善这些小鼠的肝纤维化[37]。为了评估这一点，我们在野生型（WT）和Nkg2d号淘汰赛(Nkg2d号−/−)连续12周注射CCl4的C57BL/6小鼠。为了评估纤维化进展，CCl4和载体治疗小鼠的肝脏切片用苏木精和伊红（H&E）染色（图). 在溶媒治疗的小鼠中未检测到纤维化，WT和Nkg2d号−/−老鼠。正如预期的那样，两种基因型CCl4治疗小鼠的肝脏显示出特征性的纤维化组织学（图). 纤维化的特征是HSC的激活和细胞外基质（ECM）的沉积。活化的HSC数量和沉积在纤维化瘢痕中的ECM数量是评估纤维化进展的标准[36]。因此，我们评估了WT和Nkg2d号−/−老鼠。通过天狼星红染色鉴定纤维化瘢痕，并使用全肝切片的形态计量分析进行量化。纤维瘢痕面积在Nkg2d号−/−小鼠与WT比较（p<0.05；图). 通过HSC标记物αSMA（α平滑肌肌动蛋白）在全肝裂解物中的表达来评估活化HSC的相对丰度。免疫印迹和RT-PCR分析显示，CCl4处理的αSMA的mRNA水平增加了两倍以上，其蛋白水平也相应增加Nkg2d号−/−肝脏与WT对照组相比（p<0.0001；图). 这些结果表明肝纤维化增加，HSC清除受损Nkg2d号−/−老鼠。
NKG2D受体促进衰老细胞清除并限制肝纤维化体内Nkg2千克击倒（Nkg2d−/−)用CCl处理WT小鼠4诱导纤维化。(一个)肝脏切片进行H&E和天狼星红染色。比例尺：100μm。(B类)纤维化区域的量化显示Nkg2d号−/−CCl后肝脏与WT的比较4治疗。(C类)αSMA是活化HSC的标志物，其表达通过全肝提取物的Western blot分析和(D类)定量RT-PCR。每个基因型有四只小鼠(C类). (E类)SA-β-gal染色确定WT和Nkg2d号−/−老鼠。比例尺：100μm。(F类)野生型和野生型小鼠肝脏的SA-β-gal染色的定量Nkg2d号−/−老鼠。每种基因型至少有6只小鼠用于定量分析B类和F类; 双尾t检验*P（P）<0.05, ***P（P）<0.0001.
为了确定NKG2D-配体相互作用是否影响衰老细胞的丰度，我们检测了Nkg2d号−/−和WTCCl后纤维化肝脏衰老标志物SA-β-gal4治疗。与我们之前的报告一致[21，23]，SA-β-gal阳性细胞主要存在于CCl患者的肝脏中4-治疗后的小鼠和纤维化瘢痕附近或内部的区域（图). SA-β-gal阳性细胞占据的组织区域的定量成像显示Nkg2d−/−与对照组小鼠相比，肝脏（p<0.05；图). 总之，这些发现表明NKG2D受体-受体相互作用对消除衰老细胞很重要体内缺乏NKG2D会损害衰老细胞的免疫清除，从而导致肝损伤后过度组织纤维化。
讨论
衰老细胞被NK细胞特异识别和清除[19，21，23，26，27]。在本研究中，我们研究了NK细胞识别衰老细胞的机制。我们发现，无论衰老诱导刺激如何，衰老细胞都上调NKG2D配体MICA和ULBP2的表达。调节衰老细胞中NKG2D配体表达的机制部分归因于DNA损伤反应和ERK活性的激活。发现MICA和ULBP2定位于细胞膜，在那里它们可以与NK细胞相互作用，介导对衰老细胞的有效杀伤。配体与NK细胞上NKG2D受体的相互作用是NK细胞识别衰老细胞所必需的在体外重要的是，NKG2D受体和相互作用对于有效消除衰老细胞至关重要体内从而抑制纤维化的发展。总之，我们的研究结果表明，衰老细胞上的NKG2D配体对于有效识别和消除衰老细胞是必要的在体外以及组织损伤期间体内.
NKG2D配体的表达增加，尤其是MICA和ULBP2，可能是人类衰老细胞的一般特征。许多其他研究表明，MICA和/或ULBP2在来自不同细胞类型的衰老细胞中的表达，即人类活化的星状细胞[21]，复制衰老的人脐静脉内皮细胞[38]和化疗诱导的衰老多发性骨髓瘤细胞[27]。此外，衰老细胞还获得独特的NKG2D配体表达谱，该谱由几个额外的NKG-2D配体组成，这是由于细胞类型（或细胞株）和衰老诱导机制之间的差异所致。NKG2D配体在小鼠体内的储备量巨大，与人类细胞相似，但根据序列比较，小鼠配体与人类配体并不同源[28，39]。值得注意的是，NKG2D配体存在于p53激活后衰老的小鼠细胞上，并参与这些细胞与NK细胞的相互作用[19，26]。除了在衰老细胞中表达外，NKG2D配体在与细胞应激有关的其他细胞环境中也上调，包括癌症、病毒感染细胞或DNA损伤后[24，25，28，39]。因此，这些配体的表达可能是衰老细胞利用的细胞一般应激反应的一部分。
NKG2D配体在衰老细胞中的表达独立于细胞周期阻滞，并由衰老细胞中平行激活的几种途径而不是单个途径调节。小鼠的研究结果证实了这一点，即静止的肝星状细胞不表达NKG2D配体RAE-1，而活化的星状细胞则表达高水平，这是一种与诱导该细胞类型的纤维化和衰老相关的细胞反应[21，37]。同样，衰老分泌体与细胞周期阻滞无关，并受DDR、p38、NF-κB、IL-1β和mTOR等相互关联的途径调控[1，40-46]。细胞衰老的各种触发因素导致持续DDR的激活，这可能导致我们观察到的NKG2D配体的上调。事实上，DNA损伤之前被证明可以诱导正常小鼠细胞和人类癌细胞中NKG2D配体的表达[27，32]。然而，与DDR并行的其他机制也可能调节配体的表达。例如，Ras可以诱导不依赖DDR的Nkg2d配体在小鼠细胞中的表达[47]。此外，一旦细胞衰老，I型干扰素有助于MICA和ULBP2的表达[48]。有趣的是，干扰素的表达也被DNA损伤剂诱导，因此通过进一步放大DNA损伤反应，有助于衰老诱导[49]。令人意外的是，ATM的抑制提高了MICA的表达，但降低了ULBP2的表达，这表明在衰老过程中，MICA受到DDR的抑制而不是激活。
衰老细胞中另一个活跃的途径是细胞外信号调节激酶1/2（ERK1/2）级联。ERK信号通路是调节增殖、生存和应激反应的中心信号通路[50]。然而，一些研究表明磷酸化ERK定位在衰老细胞中维持细胞质而非细胞核[51-53]。因此，ERK可以通过独立于转录调控的机制调节衰老细胞中NKG2D配体的表达。我们的研究结果表明，编码NKG2D配体的mRNA在衰老细胞中可能是稳定的，因此可以想象ERK通过下调miRNA活性来促进mRNA的稳定性。事实上，据报道，在肿瘤和巨细胞病毒感染后，MICA和MICB受到内源性miRNA的调节[39]。与ULBP2表达相比，ERK抑制后观察MICA表达同样下降所需的更长时间可能反映了两种配体之间mRNA稳定性调节的差异。除了调节NKG2D配体外，衰老细胞中的ERK信号调节趋化因子的表达，这些趋化因子可作为NK细胞和其他免疫细胞的趋化剂。这些细胞因子的表达也受DDR的调节[44]。这意味着衰老表型的多个成分负责与免疫系统的相互作用，通过DDR和ERK信号调节。重要的是要确定应激细胞的非细胞自主相互作用的其他方面，如细胞间蛋白转移[54]，也受这些途径的调节。
肝脏中衰老细胞的积累Nkg2千克组织损伤后的敲除小鼠证明了Nkg2d介导的识别对清除衰老细胞和预防过度纤维化的重要性。这些影响与价格1敲除小鼠，NK细胞的细胞毒能力受损[23]。除了NK细胞外，T细胞亚群也显示NKG2D受体[28，39]表明衰老细胞的免疫监视可能是NK细胞和T细胞的共同作用。T细胞在突变体表达诱导肝细胞衰老的免疫监视中发挥重要作用N-RAS公司[20]。然而，这种免疫监视途径依赖于抗原提呈，因此可能独立于NKG2D受体。参与衰老细胞免疫监测的另一个NKG2D独立免疫系统成分是巨噬细胞。因此，衰老细胞的免疫监测是一个复杂的程序，先天免疫系统和适应性免疫系统的结合负责从机体中正确清除衰老细胞。有效清除衰老细胞不仅对抑制纤维化和增强肿瘤抑制作用是必要的。虽然尚不清楚为什么衰老细胞会在晚年积累，但有人认为免疫系统的老化可能会导致衰老细胞的清除受损，从而促进其在组织内的积累[15，55]。NK细胞上NKG2D受体的表达似乎不随年龄变化，但据报道NK活性降低[55]。因此，衰老细胞的清除受损可能导致其在病理状态和衰老的组织中积聚。
我们的发现增加了一种新出现的概念，即衰老程序可能代表细胞状态的变化，这种变化与转化为免疫原性表型有关，通过免疫清除而不是凋亡来清除受损细胞。除了NKG2D配体的上调外，趋化因子的分泌或粘附分子的表达也是衰老细胞具有免疫原性的进一步例子。衰老细胞的免疫清除可能对再生能力依赖于非常驻干细胞群体的复杂生物体有益，因此有必要暂时保存组织结构。通过免疫清除作用消除短期损伤后的衰老细胞，具有抑制肿瘤和愈合伤口的生理功能。此外，低效清除可能导致组织中衰老细胞长期存在，这些细胞与促进癌症发展、衰老和与年龄相关的疾病有关[2，4，12]。因此，了解免疫系统消除衰老细胞的正常过程和机制，将有助于形成有关受损衰老细胞在晚年消除机制的推测。这种理解可能会导致新的治疗策略，增强免疫系统对衰老细胞的清除，以改善组织修复、癌症治疗和防止衰老细胞积聚的有害影响。
材料和方法
组织培养和细胞毒性试验
人类二倍体成纤维细胞、IMR-90和WI38（美国弗吉尼亚州马纳萨斯市ATCC）、人类包皮成纤维细胞BJ（美国弗吉尼亚洲马纳萨斯州ATCC）和原发性人类肝肌成纤维细胞（活化HSC）（西班牙德里奥-比兹凯亚Dominion Pharmakine）在标准条件下生长（DMEM添加10%FCS、1%L-谷氨酰胺和1%青霉素链霉素，并在37°C和7.5%CO下保存2). 用足叶乙甙（100μM，Sigma）处理生长细胞48小时，产生DNA损伤诱导的衰老细胞。去除足叶乙甙7天后，细胞被认为衰老。用mCherry-H-Ras逆转录病毒感染IMR-90细胞可实现癌基因诱导的衰老第12版或mCherry作为对照，如前所述[54]感染结束后9天，细胞被认为衰老。NK-92 NK细胞系（ATCC，Manassas，VA，USA）根据ATCC的说明进行培养。
体外如前所述，使用NK细胞系NK-92进行细胞毒性试验[21]。简单地说，生长或DIS IMR-90细胞在5×10的12孔板中培养5每口井；10×105随后将NK-92细胞添加到每个孔中。共同孵育2小时后，轻轻清洗NK-92细胞，并根据制造商的说明，使用Presto Blue（美国加州生命科技公司）对剩余粘附细胞进行定量，从而确定细胞毒性。
对于在体外对原始人类NK细胞（以色列耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院O.Mandelboim提供的礼物）进行细胞毒性试验，将靶细胞置于12孔板中，4×104每个孔的细胞数；1×105NK细胞（CD56的99%以上+;CD3（CD3）−[56]随后添加到每个油井中。共同培养2小时后，轻轻清洗原代NK细胞，并根据制造商的说明，使用Presto Blue（加利福尼亚州卡尔斯巴德市生命科技公司）对剩余粘附细胞进行定量，从而确定细胞毒性。
对于在体外用阻断抗体进行细胞毒性试验，将生长或衰老的细胞以2×10的比例放置在24孔板中5每个孔的细胞数。根据制造商的说明（美国明尼苏达州研发系统公司），使用针对MICA、ULBP2的阻断抗体以及同型对照物IgG2A和IgG2B的混合物处理生长和衰老细胞。简而言之，将指示浓度的封闭抗体添加到每孔200μl的10%完整RPMI（1%谷氨酰胺、1%非必需氨基酸、1%丙酮酸、1%pen-strep和10%FCS）中，并在37°C下培养40分钟。随后，5×105NK92细胞或原代NK细胞与处理的靶细胞共同培养。共同孵育2小时后，轻轻清洗NK92或原代NK细胞，并根据制造商的说明，使用Presto Blue（美国加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）对剩余粘附细胞进行定量，从而确定细胞毒性。当使用针对NKG2D的阻断抗体时，将NK92或原代NK细胞在α-NKG2D存在下预孵育40分钟，清洗，然后添加到生长和衰老细胞中。如上所述进行细胞毒性试验。
对于在体外使用针对MICA和ULBP2的siRNA进行细胞毒性试验。根据制造商的说明，使用Dharmafect 1试剂（均来自美国科罗拉多州拉斐特市Dharmacon）将靶向MICA、ULBP2和非靶向（对照）池的ON-TARGETplus SMARTpool小干扰RNA转染到生长中的IMR-90细胞中。转染后48小时，用100μM足叶乙甙（Sigma）处理细胞48小时。随后，使用针对MICA、ULBP2和非靶向（对照）池的siRNA进行第二次转染，以确保基因敲除9天，直到细胞完全衰老。然后，如上所述，使用NK-92细胞进行细胞毒性测定。
老鼠
Nkg2d−/−小鼠的发育和特征如前所述[57]。C57Bl6小鼠作为对照。对于纤维化诱导，小鼠每周接受两次治疗，腹腔注射1 ml/kg CCl4，持续6周，如所述[21]。对福尔马林固定石蜡包埋组织进行切片，并用苏木精-伊红染色以进行常规检查，或用天狼星红染色以显示纤维化沉积。为了分析相对纤维化区域和SA-β-gal活性，使用3D Histech全景MIDI数字幻灯片扫描仪（3DHISTECH Kft.，匈牙利布达佩斯）从多张幻灯片上采集图像。使用斐济软件计算相对纤维化面积[58]。将天狼星红总面积除以总分析面积，计算出相对纤维化面积。每个基因型至少分析7只小鼠。使用3D Histech HistoQuant软件（匈牙利布达佩斯3DHISTECH Kft.）定量SA-β-gal活性（每个基因型至少6只小鼠）。根据颜色检测SA-β-gal活性区域，并将其总面积除以总分析面积。
SA-β-半乳糖染色
在培养的肝组织或细胞的冷冻切片上检测SA-β-Gal活性。用0.5%的戊二醛将冷冻切片或细胞固定在PBS中15分钟，用添加1 mM MgCl的PBS清洗2pH5.5，在37°C下无一氧化碳染色5-6小时2在含有1 mM MgCl的PBS中2pH5.5、1mg/ml X-Gal和5mM铁氰化钾和亚铁氰化钠。切片用曙红复染。
基因表达的检测和修改
对于整个肝脏：使用标准RIPA缓冲液生成裂解物，并补充磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（均来自Sigma）。使用抗αSMA（Santa Cruz）、抗βTubulin（Sigma）免疫印迹法检测全肝裂解物中的蛋白表达。对于定量RT-PCR，使用NucleoSpin试剂盒（德国杜伦市马切里·内格尔）分离总RNA，并使用RevertAid H Minus第一链cDNA合成试剂盒（美国马里兰州格伦·伯尼市弗尔门塔斯）反向转录2μg。使用Fast SYBR Green Master Mix在StepOnePlus实时PCR系统（均为Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）中扩增cDNA样品。使用GAPDH的表达水平对αSMA的相对表达进行标准化。
对于细胞培养细胞：使用添加了磷酸酶抑制剂和蛋白酶抑制剂（均来自Sigma）的标准RIPA缓冲液生成裂解物。使用抗p-ERK（Sigma）、抗总ERK（西格玛）、β-管蛋白（Santa Cruz，CA，USA）和GAPDH（Millipore，MA，USA。使用NucleoSpin RNA II试剂盒（德国马谢里·纳格尔）从细胞中分离出总RNA。总之，使用MMLV逆转录酶（美国Promega）和随机六聚体引物（美国Amersham–GE Healthcare）逆转录1μg RNA。qRT-PCR在StepOnePlus仪器中使用SYBR Green Master Mix（美国应用生物系统公司）进行。ON-TARGETplus SMARTpool靶向MICA和ULBP2的小干扰RNA和非靶向（对照）RNA池用Dharmafect 1试剂转染到生长中的IMR-90细胞中（均来自美国科罗拉多州拉斐特市Dharmacon）。随后，通过足叶乙甙处理诱导细胞衰老。
为了抑制ERK活性，衰老细胞在10μM MEK抑制剂（PD184352（Sigma）、AZD6244（Axon Medchem，VA，USA）或Trametinib（GSK1120212）（Selleck Chemicals，Boston，US）存在下培养24、48、72或96小时，如图所示。为了抑制ATM活性，生长细胞在10μM KU60019（美国研发系统公司）的存在下孵育1小时或5mM咖啡因（西格玛），然后用100μM Etoposide处理24小时。如图所示，为了抑制衰老细胞中的ATM活动，添加10μM的KU60016（美国研发系公司）24、48、72和96小时。每天补充所有抑制剂。随后分离总RNA，并按照上述方法进行qRT-PCR。如有要求，可提供底漆清单。
图像流式细胞术
用TryplE（Gibco，Life Technologies，USA）收获衰老或生长的IMR-90，用DMEM收集，并在添加5mM EDTA的情况下离心。在用冷PBS清洗并通过网格转移后，在200μl FACS缓冲液（PBS中5%FCS）中用10μg/ml的αMICA或αULBP2在冰上标记细胞1小时。接下来的细胞用冷PBS清洗一次，并用次级α-小鼠抗体（美国Jackson Immunoresearch）在200μl的FACS缓冲液中以1:200的浓度在冰上荧光标记1小时。培养结束后，用冷PBS冲洗细胞两次，并用DAPI 1:10000在FACS缓冲液中再次悬浮，以标记死细胞。最后，在ImageStreamX系统中对细胞成像，并使用amnis IDEAS软件包进行分析。
免疫荧光（IF）
IMR-90、WI38和BJ细胞生长在0.1%明胶涂层的盖玻片上。随后，用人IgG阻断细胞，并与10μg/ml针对MICA、ULBP2和同种对照的抗体在4°C下共同孵育1小时。然后，用PBS清洗盖玻片，在室温下用抗鼠Alexa 549-共轭二级抗体在PBS中孵育1小时，再用PBS清洗，用1%PFA固定15分钟，然后在含有DAPI的PBS中再次清洗，并安装在DAKO安装介质中。使用蔡司Axioscope II荧光显微镜检测荧光，并使用简单的PCI软件进行图像采集。
统计分析
数据表示为平均值+S.E。使用Student t检验（双尾）进行统计评估，以测试对照结果和实验结果之间的差异。p<0.05的值被认为具有统计学意义。
致谢
我们感谢魏茨曼研究所的R.Seger慷慨分享他在ERK信号方面的专业知识，感谢耶路撒冷希伯来大学哈达萨医学院的O.Mandelboim为我们提供了初级人类NK细胞；Ziv Porat寻求成像流式细胞术的帮助，Krizhanovsky实验室的成员也参与了讨论。
脚注
基金
这项工作得到了玛丽·居里（Marie Curie）RG赠款、欧洲研究理事会（European Research Council）根据欧盟第七框架计划（FP7）和以色列科学基金会（Israel Science Foundation）向V.K.VK提供的资助。VK是生命科学领域卡尔和弗朗西斯·科恩（the Karl and Frances Korn）职业发展主席的任职者。
利益冲突声明
这份手稿的作者声明没有利益冲突。
参考文献
1Salama R、Sadaie M、Hoare M、成田M。细胞衰老及其效应程序。基因发育。2014;28:99–114. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 2Munoz-Espin D，Serrano M.《细胞衰老：从生理学到病理学》。Nat Rev Mol细胞生物学。2014;15:482–496.[公共医学][谷歌学者] 三。Burton DG，Krizhanovsky V.细胞衰老的生理和病理后果。细胞分子生命科学。2014;71:4373–4386. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 5Kuilman T，Michallou C，Mooi WJ，Peeper DS。衰老的本质。基因发育。2010;24:2463–2479. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 6Chuprin A、Gal H、Biron Shental T、Biran A、Amiel A、Rozenblatt S、Krizhanovsky V。ERVVE1或麻疹病毒诱导的细胞融合导致细胞衰老。基因发育。2013;27:2356–2366. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 7Mallette FA、Gaumont-Leclerc MF、Ferbeyre G。DNA损伤信号通路是肿瘤诱导衰老的关键介质。基因发育。2007;21：43–48。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Di Micco R、Fumagalli M、Cicalese A、Piccinin S、Gasparini P、Luise C、Schurra C、Garre M、Nuciforo PG、Bensimon A、Maestro R、Pelicci PG、d'Adda Di Fagagna F。癌基因诱导的衰老是由DNA超复制触发的DNA损伤反应。自然。2006;444:638–642.[公共医学][谷歌学者] 9Bartkova J、Rezaei N、Liontos M、Karakaidos P、Kletsas D、Issaeva N、Vassiliou LV、Kolettas E、Niforou K、Zoumpourlis VC、Takaoka M、Nakagawa H、Tort F等。肿瘤诱导衰老是DNA损伤检查点施加的肿瘤发生屏障的一部分。自然。2006;444:633–637.[公共医学][谷歌学者] 10成田集团M、成田公司M、克里扎诺夫斯基五世、努内兹集团S、奇卡斯集团A、赫恩集团SA、迈尔斯议员、洛维集团SW。高迁移率A组蛋白在细胞衰老和异染色质形成中的新作用。单元格。2006;126:503–514.[公共医学][谷歌学者] 11成田M、Nunez S、Heard E、成田M，Lin AW、Hearn SA、Spector DL、Hannon GJ、Lowe SW。Rb介导的异染色质形成和E2F靶基因在细胞衰老过程中的沉默。单元格。2003;113:703–716.[公共医学][谷歌学者] 12卵巢Y，Krizhanovsky V.衰老细胞：年龄相关疾病的特异性驱动因素。生物老年学。2014;15:627–642.[公共医学][谷歌学者] 13Naylor RM、Baker DJ、van Deursen JM。衰老细胞：衰老和年龄相关疾病的新治疗靶点。临床药理学和治疗学。2013;93:105–116. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Sagiv A，Krizhanovsky V.衰老细胞的免疫监测：衰老计划的光明面。生物老年学。2013;14：617–628。[公共医学][谷歌学者] 15Hoenicke L，Zender L。衰老细胞的免疫监测——在癌症和非癌症病理学中的生物学意义。致癌。2012;33:1123–1126.[公共医学][谷歌学者] 16Burton DG，Faragher RG公司。细胞衰老：从生长停滞到免疫原性转化。年龄（多德）2015;37:27. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 17成田M，Lowe SW。衰老来自年龄。自然医学。2005;11:920–922.[公共医学][谷歌学者] 18Serrano M、Lin AW、McCurrach ME、Beach D、Lowe西南。癌基因ras引起与p53和p16INK4a积累相关的细胞过早衰老。单元格。1997;88:593–602.[公共医学][谷歌学者] 19Xue W、Zender L、Miething C、Dickins RA、Hernando E、Krizhanovsky V、Cordon-Cardo C、Lowe SW。衰老和肿瘤清除是由小鼠肝癌中p53的恢复触发的。自然。2007;445:656–660. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Kang TW、Yevsa T、Woller N、Hoenicke L、Wuestefeld T、Dauch D、Hohmeyer A、Gereke M、Rudalska R、Potapova A、Iken M、Vucur M、Weiss S等。癌前肝细胞的衰老监测限制了肝癌的发展。自然。2011;479:547–551.[公共医学][谷歌学者] 21Krizhanovsky V、Yon M、Dickins RA、Hearn S、Simon J、Miething C、Yee H、Zender L、Lowe SW。活化星状细胞的衰老限制了肝纤维化。单元格。2008;134:657–667. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Jun JI，Lau LF（刘俊杰）。基质细胞蛋白CCN1诱导成纤维细胞衰老并限制皮肤伤口愈合中的纤维化。自然细胞生物学。2010;12：676–685。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Sagiv A、Biran A、Yon M、Simon J、Lowe SW、Krizhanovsky V。颗粒胞吐介导衰老细胞的免疫监视。致癌物。2013;32:1971–1977. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Iannello A，Raulet DH。自然杀伤细胞对不健康细胞的免疫监测。冷泉Harb Symb Quant生物。2013;78:249–257. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Bernardini G、Gismondi A、Santoni A.趋化因子和NK细胞：发育、贩运和功能的调节器。免疫学信件。2012;145:39–46. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Iannello A、Thompson TW、Ardolino M、Lowe SW、Raulet DH。衰老肿瘤细胞产生的p53依赖性趋化因子支持自然杀伤细胞对NKG2D依赖性肿瘤的清除。《实验医学杂志》。2013;210:2057–2069. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 27Soriani A、Zingoni A、Cerboni C、Iannitto ML、Ricciardi MR、Di Gialleornado V、Cippitelli M、Fionda C、Petrucci MT、Guarini A、Foa R、Santoni A。治疗药物对多发性骨髓瘤细胞上DNAM-1和NKG2D配体的ATM-ATR依赖性上调导致NK-cell敏感性增强，并与衰老表型相关。鲜血。2009;113:3503–3511.[公共医学][谷歌学者] 29Eagle RA、Trowsdale J.混杂与单一受体：NKG2D。Nat Rev免疫学。2007;7:737–744.[公共医学][谷歌学者] 30Soriani A、Fionda C、Ricci B、Iannitto ML、Cippitelli M、Santoni A。化疗有效上调NKG2D和DNAM-1配体作为多发性骨髓瘤的治疗靶点。肿瘤免疫学。2013;2：e26663。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 31Chahroudi A、Silvestri G、Feinberg MB。使用荧光半胱天冬酶底物测量T细胞介导的细胞毒性。方法。2003;31:120–126.[公共医学][谷歌学者] 32Gasser S、Orsulic S、Brown EJ、Raulet DH。DNA损伤途径调节NKG2D受体的天然免疫系统配体。自然。2005;436:1186–1190. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 33Deschenes-Simard X、Gaumont-Leclerc MF、Bourdeau V、Lessard F、Moiseeva O、Forest V、Igelmann S、Mallette FA、Saba-El-Leil MK、Meloche S、Saad F、Mes-Masson AM、Ferbeyre G。通过促进选择性蛋白降解，ERK/MAPK途径的肿瘤抑制活性。基因发育。2013;27:900–915. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 34Stanietsky N，Mandelboim O。控制NK细胞毒性的成对NK细胞受体。FEBS信函。2010;584:4895–4900.[公共医学][谷歌学者] 35Chan CJ、Martinet L、Gilfillan S、Souza Fonseca Guimaraes F、Chow MT、Town L、Ritchie DS、Colona M、Andrews DM、Smyth MJ。受体CD96和CD226在调节自然杀伤细胞功能方面相互对立。自然免疫学。2014;15:431–438.[公共医学][谷歌学者] 36Puche JE，Saiman Y，Friedman SL。肝星状细胞与肝纤维化。综合生理学。2013;三:1473–1492.[公共医学][谷歌学者] 37Radaeva S，Sun R，Jaruga B，Nguyen VT，Tian Z，Gao B。自然杀伤细胞通过杀伤NKG2D依赖和肿瘤坏死因子相关凋亡诱导的配体依赖方式中活化的星状细胞来改善肝纤维化。胃肠病学。2006;130:435–452.[公共医学][谷歌学者] 38Kim TW，Kim HJ，Lee C，Kim HY，Baek SH，Kim JH，Kwon KS，Kin JR。用退火控制引物系统鉴定人脐静脉内皮细胞中的复制衰老相关基因。Exp Gerontal公司。2008;43:286–295.[公共医学][谷歌学者] 39Stern-Ginossar N，Mandelboim O。NKG2D配体调控的综合观点。免疫学。2009;128:1–6. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 40Lasry A，Ben-Neriah Y.衰老相关炎症反应：衰老和癌症展望。趋势免疫。2015;36:217–228.[公共医学][谷歌学者] 41Laberge RM、Sun Y、Orjalo AV、Patil CK、Freund A、Zhou L、Curran SC、Davalos AR、Wilson Edell KA、Liu S、Limbad C、Demaria M、Li P等。MTOR通过促进IL1A翻译调节促肿瘤衰老相关分泌表型。自然细胞生物学。2015;17:1049–1061. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 42Freund A，Patil CK，Campisi J.p38MAPK是衰老相关分泌表型的一种新型DNA损伤反应独立调节因子。EMBO J。2011;30:1536–1548. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 43Chien Y、Scuoppo C、Wang X、Fang X、Balgley B、Bolden JE、Premsrirut P、Luo W、Chicas A、Lee CS、Kogan SC、Lowe SW。NF对衰老相关分泌表型的控制-{kappa}B促进衰老，增强化疗敏感性。基因发育。2011;25:2125–2136. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 44Rodier F、Coppe JP、Patil CK、Hoeijmakers WA、Munoz DP、Raza SR、Freund A、Campeau E、Davalos AR、Campisi J。持续性DNA损伤信号触发衰老相关炎症细胞因子分泌。自然细胞生物学。2009;11:973–979. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 45Kuilman T、Michallou C、Vredeveld LC、Douma S、van Doorn R、Desmet CJ、Aarden LA、Mooi WJ、Peeper DS。癌基因诱导衰老通过白细胞介素依赖性炎症网络传递。单元格。2008;133:1019–1031.[公共医学][谷歌学者] 46Acosta JC、O’Loghlen A、Banito A、Guijarro MV、Augert A、Raguz S、Fumagalli M、Da Costa M、Brown C、Popov N、Takatsu Y、Melamed J、d'Adda di Fagagna F等。通过CXCR2受体的趋化因子信号传导增强衰老。单元格。2008;133:1006–1018.[公共医学][谷歌学者] 47Liu XV，Ho SS，Tan JJ，Kamran N，Gasser S.Ras激活诱导Raet1家族NK受体配体的表达。免疫学杂志。2012;189:1826–1834.[公共医学][谷歌学者] 48Katlinskaya YV、Carbone CJ、Yu Q、Fuchs SY。1型干扰素有助于清除衰老细胞。癌症生物治疗。2015;16:1214–1219. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 49Yu Q、Katlinskaya YV、Carbone CJ、Zhao B、Katlinski KV、Zheng H、Guha M、Li N、Chen Q、Yang T、Lengner CJ、Greenberg RA、Johnson FB等。DNA损伤诱导的I型干扰素促进衰老并抑制干细胞功能。单元格代表。2015;11:785–797. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 50Wortzel I，Seger R.ERK级联：不同亚细胞器官中的不同功能。基因与癌症。2011;2:195–209. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 51Deschenes-Simard X、Kottakis F、Meloche S、Ferbeyre G.ERKs在癌症中的作用：朋友还是敌人？癌症研究。2014;74:412–419.[公共医学][谷歌学者] 52Gaumont-Leclerc MF、Mukhopadhyay UK、Goumard S、Ferbeyre G.PEA-15被腺病毒E1A抑制，并在ERK核输出和Ras诱导的衰老中发挥作用。生物化学杂志。2004;279:46802–46809.[公共医学][谷歌学者] 53Lorenzini A、Tresini M、Mawal-Dewan M、Frisoni L、Zhang H、Allen RG、Sell C、Cristofalo VJ。Raf/MEK/ERK和PI3K/Akt（PKB）通路在成纤维细胞衰老中的作用。Exp Gerontal公司。2002年；37:1149–1156.[公共医学][谷歌学者] 54Biran A、Perelmutter M、Gal H、Burton DG、Ovadya Y、Vadai E、Geiger T、Krizhanovsky V。衰老细胞通过细胞间蛋白转移进行通信。基因发育。2015;29：791–802。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 55Hazeldine J，Lord JM。老龄化对自然杀伤细胞功能的影响以及对老年人健康的潜在影响。老龄化研究综述。2013;12:1069–1078. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 56Hanna J、Wald O、Goldman-Wohl D、Prus D、Markel G、Gazit R、Katz G、Haimov-Kochman R、Fujii N、Yagel S、Peled A、Melboim O。侵袭性滋养层细胞的CXCL12表达诱导CD16−人类自然杀伤细胞的特异性迁移。鲜血。2003;102:1569–1577.[公共医学][谷歌学者] 57Zafirova B、Mandaric S、Antulov R、Krmpotic A、Jonsson H、Yokoyama WM、Jonjic S、Polic B。在NKG2D缺陷小鼠中，改变NK细胞发育并增强NK细胞介导的对小鼠巨细胞病毒的耐药性。豁免权。2009;31:270–282. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 58Schindelin J、Arganda-Carreras I、Frise E、Kaynig V、Longair M、Pietzsch T、Preibisch S、Rueden C、Saalfeld S、Schmid B、Tinevez JY、White DJ、Hartenstein V等。斐济：生物图像分析的开源平台。自然方法。2012;9:676–682. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 
