糖尿病。 2013年4月； 62(4): 1270–1281.
活化AMPK分解Bcl-2–Beclin1复合物增强糖尿病患者心脏自噬并保护心肌细胞凋亡 俄克拉何马州俄克拉荷马市俄克拉荷玛大学健康科学中心医学系分子医学科。
2012年4月24日收到； 2012年9月30日验收。
摘要 糖尿病心肌病与抑制心脏自噬有关，激活AMP-activated protein kinase（AMPK）可恢复糖尿病小鼠的心脏自吞噬并预防心肌病，尽管机制尚不清楚。 我们假设AMPK诱导的自噬通过抑制心肌细胞凋亡改善糖尿病心肌病，并在糖尿病小鼠和高糖处理的H9c2心肌成肌细胞中检测AMPK对Beclin1和Bcl-2之间相互作用的影响，Bcl-2是自噬和凋亡之间的转换。 H9c2细胞暴露于高糖降低AMPK活性，抑制Jun NH 2 -末端激酶1（JNK1）–B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）信号传导，并促进Beclin1与Bcl-2的结合。 相反，二甲双胍对AMPK的激活刺激了JNK1–Bcl-2信号传导，并破坏了Beclin1–Bcl-2复合物。 AMPK的激活使心脏自噬正常化，减弱了高糖诱导的培养H9c2细胞凋亡。 这种作用通过抑制自噬而减弱。 最后，糖尿病小鼠长期服用二甲双胍，通过激活JNK1–Bcl-2通路并分离Beclin1和Bcl-2，恢复了心脏自噬。 自噬的诱导可防止糖尿病小鼠心脏细胞凋亡，改善心脏结构和功能。 我们的结论是，Bcl-2与Beclin1的分离可能是通过AMPK激活预防糖尿病心肌病的重要机制，AMPK活化可恢复自噬并保护心肌细胞凋亡。
糖尿病心肌病是一种以心室功能障碍为特征的临床疾病，在许多没有冠心病或高血压的糖尿病患者中发生( 1 , 2 )。 越来越多的研究表明，高血糖是糖尿病心肌病发展的核心，它触发了一系列下游信号，导致心肌细胞凋亡、心室扩张和心脏功能障碍( 三 )。 为了支持这一观点，在糖尿病患者中观察到糖尿病诱导的心肌细胞死亡( 三 )和链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病动物( 4 )。 然而，发病机制仍不清楚。
自噬是溶酶体中细胞质成分的大量降解和再循环的高度保守过程( 5 )。 在心脏中，结构性自噬是维持心脏结构和功能的稳态机制( 6 )。 然而，过度诱导自噬可能破坏细胞溶质和细胞器，释放凋亡相关因子，导致细胞死亡和心脏功能障碍( 7 , 8 )。 因此，自噬似乎同时调节细胞存活和细胞死亡。 新出现的证据表明，自噬和凋亡途径之间存在相互作用。 例如，抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤2（Bcl-2）通过与Beclin1结合来抑制饥饿诱导的自噬，这种结合有效地将Beclin 1与Beclin和空泡分选蛋白（VPS34）形成的核心激酶复合物隔离开来，后者是一种III类磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）， 这是诱导自噬所必需的( 9 )。 最近我们证明，在糖尿病动物中，自噬的抑制与心脏细胞凋亡的增加有关( 10 , 11 ); 然而，自噬的诱导是否在糖尿病心肌病的发展中起到保护作用尚不清楚。
AMP-activated protein kinase（AMPK）是一种保守的细胞能量传感器，在维持能量平衡中起着重要作用( 12 )。 此外，AMPK还调节许多其他细胞过程，如细胞生长、蛋白质合成( 13 , 14 )，凋亡( 15 , 16 )和自噬( 17 , 18 )。 在心脏中，AMPK负责在低流量缺血期间激活葡萄糖摄取和糖酵解，并在限制与缺血和再灌注相关的凋亡活动中发挥重要作用( 19 )。 此外，局部缺血对AMPK的激活也刺激自噬并保护其免受局部缺血损伤( 18 )。 从机制上讲，AMPK似乎通过ULK1（酵母自噬相关基因1的哺乳动物同源物[Atg1]的磷酸化和激活来诱导自噬( 20 , 21 ); 然而，AMPK在糖尿病心肌病发展过程中调节自噬和凋亡之间转换的分子机制尚待确定。
在本研究中，我们试图确定自噬是否在糖尿病心肌病发展过程中对细胞死亡起保护作用，并探索AMPK激活调节该病自噬和凋亡之间转换的机制。 我们发现，激活AMPK通过破坏Beclin1和Bcl-2之间的相互作用恢复心脏自噬，并保护心脏细胞凋亡，最终导致糖尿病小鼠心脏结构和功能的改善。
研究设计和方法 动物。 实验使用了来自杰克森实验室（马萨诸塞州巴尔港）的雄性FVB病毒小鼠。 连续5天腹腔注射STZ（50 mg/kg）使8周龄小鼠成为糖尿病小鼠，而对照小鼠则注射溶媒（柠檬酸缓冲液，pH 4.5）。 注射后一周，通过将尾血应用于血糖仪测量血糖，如前所述( 22 , 23 )。 血糖水平>350 mg/dL的小鼠被视为糖尿病小鼠。 将糖尿病小鼠随机分为服用或不服用二甲双胍（饮用水中200mg/kg/天）4个月。 此外，8周龄的对照FVB和过度表达AMPK（DN-AMPKα2）显性负性（DN）α2亚基（D157A）的心肌特异性转基因小鼠；田荣博士馈赠，华盛顿大学西雅图分校）( 24 )如上所述用STZ和二甲双胍治疗。 治疗4个月后，使用之前描述的隔离缓冲灌注心脏制剂测量左心室（LV）功能( 23 , 25 )。 俄克拉荷马大学机构动物护理和使用委员会审查并批准了所有动物方案。
细胞培养和治疗。 H9c2心肌成肌细胞保存在添加10%FBS的Dulbecco改良Eagle’s培养基中，并在5%CO的湿化环境中培养 2 /37°C时95%空气。 当达到50–60%的汇合时，将细胞与对照（5.5 mmol/L）或高糖（30 mmol/L）培养基培养，培养时间如前所述( 21 , 22 )。 渗透性对照组（考虑中等高渗）暴露于含有葡萄糖（5.5 mmol/L）的正常培养基中的甘露醇（24.5 mmol/L.）。
免疫沉淀和蛋白质印迹。 H9c2细胞和心脏在裂解缓冲液中均质，并使用Bradford分析测定蛋白质含量。 总裂解物用特异性抗体进行免疫沉淀。 如前所述，免疫沉淀物或细胞裂解物进行蛋白质印迹( 26 , 27 ).
免疫组织化学和凋亡分析。 如前所述进行免疫组织化学( 11 , 28 )。 使用细胞死亡检测试剂盒（印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）通过TUNEL染色测量心脏切片和培养的H9c2细胞的凋亡。 为了量化培养的H9c2细胞中的细胞凋亡，使用Annexin-V-FLUOS染色试剂盒（Roche Applied Science）分析细胞凋亡。 治疗后，收集H9c2细胞，并用Alexa 488结合的Annexin V和碘化丙啶（PI）标记15分钟。 凋亡细胞（膜联蛋白V + /PI公司 − 细胞）在FACScan流式细胞仪（BD，San Jose，CA）中检测到。
AMPK活性测定。 如前所述，在～20 mg心脏组织中测量AMPK活性( 29 , 30 )，使用SAMS肽作为底物。
自噬空泡的可视化。 H9c2细胞以5× 4 每个孔的细胞数，让其粘附在平板上过夜，然后感染绿色荧光蛋白（GFP）-轻链3（LC3）腺病毒。 转染24小时后，将细胞与氯喹（CQ；5μmol/L）在正常或高糖培养基中孵育16小时。 使用倒置荧光显微镜（Olympus America，Meliville，NY）获得荧光图像。 通过量化每个样本每个细胞的自噬体平均数量来测量自噬。 每个样本至少计数100个细胞。
结果 高糖抑制培养的H9c2心肌成肌细胞的自噬。 我们首先确定高糖是否改变H9c2细胞的自噬。 在自噬过程中，细胞溶质微管相关蛋白LC3-I被脂化并转化为LC3-II，后者被转运到自噬体膜( 31 )。 因此，LC3-I向LC3-II的转化和GFP-LC3的积累提供了测量自噬体的有效方法( 31 )。 H9c2细胞用 天 -最终浓度为20或30 mmol/L的葡萄糖持续48 h，用5.5 mmol/L处理细胞 天 -以葡萄糖为对照。 为了排除高渗的影响，用5.5 mmol/L处理细胞 天 -葡萄糖加24.5 mmol/L甘露醇48小时，不会影响AMPK活性和自噬（数据未显示）。 LC3-II蛋白水平在20mmol/L时开始下降，在30mmol/L下下降约三倍( ).
AMPK的激活可防止H9c2细胞中高糖（HG）对自噬的抑制。 A类 ：用不同浓度的葡萄糖处理H9c2细胞48小时，用抗LC3B抗体通过Western blot分析细胞裂解物( n个 = 6; * 对 < 0.05, † 对 与对照组相比<0.01（续）。 B类 ：H9c2细胞暴露于HG（30 mmol/L）指定时间，并通过Western blotting检测细胞裂解液中的LC3-II蛋白水平( n个 = 6; * 对 <0.05与Con）。 C类 ：H9c2细胞在有或无CQ（5μmol/L）的情况下用HG处理48 h，并用Western blot测定细胞裂解液中LC3-II的表达( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 与CQ相比<0.05）。 D类 和 E类 用编码GFP-LC3的腺病毒感染H9c2细胞24小时。然后用HG、CQ（5μmol/L）或HG加CQ处理细胞48小时。用倒置荧光显微镜检测GFP-LC3。 D类 ：GFP-LC3染色的代表性显微摄影。 E类 ：通过计数细胞中的GFP-LC3点来量化自噬( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 与CQ相比<0.05）。 F类 ：用HG、二甲双胍（Met；1 mmol/L）、HG加Met或HG/Met/CQ处理H9c2细胞48小时。使用P-AMPK（Thr172）、P-ACC（Ser79）和LC3B抗体通过Western blot分析细胞裂解物( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 与HG相比<0.05，† 对 <0.05 vs.HG/Met）。 G公司 和 H（H） ：转染GFP-LC3的H9c2细胞用HG、Met、HG+Met或HG/Met/CQ处理48小时。用倒置荧光显微镜检测GFP-LC3。 G公司 ：GFP-LC3染色的代表性显微照片。 H（H） ：通过计数细胞中的GFP-LC3点来量化自噬( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.05 vs.HG/Met）。 我 ：用对照siRNA（C-siRNA）或AMPK-siRNA（AMPK-si）转染H9c2细胞48小时。细胞在HG培养基中孵育，用或不用Met（1 mmol/L）处理48小时。用AMPK和LC3B抗体对细胞裂解物进行Western blot分析( n个 = 3; * 对 <0.05 vs.C-siRNA，† 对 <0.05 vs.HG/C-siRNA， 对 <0.05 vs.HG/Met/C-siRNA）。 J型 ：将感染GFP或CA-AMPK腺病毒的H9c2细胞在HG培养基中培养48 h。将细胞裂解物进行Western blot检测LC3的表达( n个 = 3; * 对 <0.05与GFP，† 对 <0.05 vs.GFP/HG， 对 <0.05与仅CA-AMPK相比， Ş 对 与GFP/HG/Met相比<0.05# 对 <0.05 vs.CA-AMPK/HG）。
接下来，我们确定了在高糖环境中自噬抑制的时间进程。 H9c2细胞暴露于高糖下12–48小时。24小时后观察到LC3-II蛋白水平显著降低，并且这种影响在整个研究期间持续存在( )。 为了研究高糖对自噬流量的影响，在溶酶体和自噬体融合抑制剂CQ存在或不存在的情况下，用高糖处理H9c2细胞( 32 )。 在正常葡萄糖条件下，服用CQ可增加LC3-II的积累。 这种增加被高糖治疗减弱( )。 免疫荧光分析表明，葡萄糖水平升高降低了GFP-LC3点状染色的数量和分布，表明自噬体形成减少。 在正常葡萄糖条件下，CQ处理增加了GFP-LC3斑点的数量和分布。 值得注意的是，在高糖环境下，这种增加被抑制，表明葡萄糖水平升高会降低自噬流量( ).
AMPK的激活使H9c2细胞在高糖条件下的自噬活性正常化。 二甲双胍通过激活AMPK诱导自噬( 11 )。 为了探讨这种激酶在糖尿病心肌病发展过程中调节自噬和凋亡的机制，我们首先检测了二甲双胍对AMPK的激活是否会诱导自噬。 高糖抑制AMPK活性，如AMPK和乙酰辅酶A羧化酶（ACC）磷酸化降低所估计，LC3-I向LC3-II的转化降低( )。 在正常葡萄糖条件下，二甲双胍可激活AMPK并增强LC3-II的积累。 二甲双胍治疗后AMPK活性的恢复恢复了高糖处理的H9c2细胞的自噬能力( )。 在这种情况下，服用CQ导致LC3-II积累进一步增加。 免疫荧光分析显示，高糖降低了GFP-LC3点状染色的数量和分布，而二甲双胍的作用则相反。 向经高糖处理的细胞中添加二甲双胍和CQ会导致GFP-LC3点的数量和分布增加。 综上所述，这些数据表明二甲双胍可以在高糖环境中恢复自噬流量( )。 AMPK对自噬的影响是通过遗传方法进一步评估的。 在基础条件下，用AMPK小干扰RNA（siRNA）转染细胞可降低LC3-II蛋白水平。 重要的是，二甲双胍治疗恢复了转染对照siRNA的细胞的自噬能力，但在转染AMPK-siRNA的细胞中没有恢复( )。 相反，在H9c2细胞中转染组成型活性AMPK（CA-AMPK）腺病毒可提高LC3-II蛋白水平。 在高糖环境中，二甲双胍治疗在CA-AMPK腺病毒转染细胞中诱导的自噬多于GFP腺病毒转导细胞( )。 综上所述，我们的结果表明二甲双胍激活AMPK可刺激自噬。
AMPK激活可减弱高糖诱导的H9c2细胞凋亡。 接下来我们研究了AMPK的激活是否能阻止高糖诱导的H9c2细胞凋亡。 与正常葡萄糖和渗透控制条件相比，葡萄糖水平升高增加了TUNEL阳性细胞( )和凋亡标记物，如caspase-3和PARP的裂解( )。 流式细胞仪分析显示，高糖诱导的凋亡细胞死亡（11.7±2.2%）多于正常葡萄糖（3.6±1.2%）或渗透控制（3.9±1.1%）( )。 在暴露于高糖的细胞中，二甲双胍治疗阻止了AMPK和ACC磷酸化的降低( )，减少caspase-3和PARP的裂解( )减少凋亡细胞的数量( ).
AMPK激活抑制高糖（HG）诱导的H9c2细胞凋亡。 A类 和 B类 ：H9c2细胞暴露于5 mmol/L 天 -葡萄糖（对照），30 mmol/L 天 -葡萄糖（HG），或5.5 mmol/L 天 -葡萄糖加24.5 mmol/L甘露醇48小时，然后进行TUNEL染色( A类 )以及TUNEL阳性细胞的数量( B类 )量化了( n个 = 6; * 对 与对照组或甘露醇相比<0.05）。 C类 ：通过免疫印迹分析测定裂解caspase 3（C-Casp3）和裂解PARP（C-PARP）( n个 = 5; * 对 与对照组相比<0.05）。 D类 和 E类 ：采用FITC-膜联蛋白V/PI双染流式细胞术检测不同组H9c2细胞的凋亡率。 D类 ：膜联蛋白V/PI染色代表图。 E类 ：凋亡细胞计算为膜联蛋白V的比率 + /PI公司 − 单元格到总单元格( n个 = 5; * 对 与对照组或甘露醇相比<0.05）。 F类 ：H9c2细胞用或不用二甲双胍（Met；1 mmol/L）预处理1 h，然后用HG（30 mmol/L）处理48 h。通过AMPK和ACC磷酸化的Western分析测定细胞裂解液中AMPK的活化( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 与HG相比<0.05）。 G公司 ：通过Western blot分析检测细胞裂解物中C-Casp3和C-PARP的表达( n个 =5* 对 <0.05与对照组，† 对 与HG相比<0.05）。 H（H） ：使用膜联蛋白V/PI双染色通过流式细胞术评估细胞凋亡，凋亡细胞计算为膜联蛋白V的比率 + /PI公司 − 单元格到总单元格( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 与HG相比<0.05）。
AMPK激活-减弱高糖诱导的凋亡依赖于自噬。 为了确定自噬在糖尿病心肌病发展中的功能作用，我们评估了操纵H9c2细胞自噬活性后的细胞凋亡。 在正常葡萄糖条件下，二甲双胍治疗可增强LC3-II的积累( )LC3-I向LC3-II的转化被自噬抑制剂3-甲基腺苷（3-MA）阻断( 33 )。 在高糖环境中，二甲双胍可阻止LC3-II蛋白水平的降低； 然而，这种作用因服用3-MA而减弱( )。 此外，二甲双胍减弱了高糖对凋亡标记物（半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3和PARP的裂解）的增强作用，这种保护作用被3-MA治疗所抵消( ).
AMPK通过诱导自噬减轻高糖（HG）诱导的细胞凋亡。 A类 和 B类 ：H9c2细胞用3-MA（10μmol/L）预处理30 min，然后在有或无二甲双胍（Met；1 mmol/L）的情况下用HG（30 mmol/L.）处理48 h。用Western blot分析细胞裂解产物以确定LC3的表达( A类 )和凋亡标记物( B类 )包括裂解caspase-3（C-Casp3）和裂解PARP（C-PARP）( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.05 vs.HG/Met）。 C类 ：用对照siRNA（C-siRNA）或Atg7 siRNA（Atg7-si）转染H9c2细胞48小时。细胞在HG培养基中培养，并用或不用Met（1 mmol/L）处理48小时。用C-Casp3、C-PARP、LC3B和Atg7抗体对细胞裂解物进行Western blot分析。 D类 ：采用annexin V/PI双重染色的流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与annexinV的比值 + /PI公司 − 单元格到总单元格( n个 = 5; * 对 <0.05与对照/C-siRNA，† 对 <0.05 vs.C-siRNA/HG， 对 <0.05 vs.HG/Met/C-siRNA）。 E类 用编码GFP或Atg7的腺病毒感染H9c2细胞48小时，然后用或不用CQ（5μmol/L）处理16小时。用Western blot检测细胞裂解液中LC3的表达( n个 = 5; * 对 <0.05与GFP，† 对 与CQ/GFP相比<0.01）。 F类 ：将感染GFP或Atg7腺病毒的H9c2细胞在HG培养基中培养48 h。将细胞裂解物进行Western blot检测C-Casp3和C-PARP的表达( n个 = 5; * 对 与GFP相比<0.05，† 对 <0.05 vs.GFP/HG）。 G公司 ：采用annexin V/PI双重染色的流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与annexinV的比值 + /PI公司 − 单元格与总单元格之比( n个 = 5; * 对 <0.05与GFP，† 对 <0.05 vs.GFP/HG）。
排除3-MA的非特异性影响( 34 )，我们通过沉默Atg7基因来抑制自噬。 转染Atg7 siRNA不仅可以阻止LC3-I在基础条件下转化为LC3-II，还可以抑制二甲双胍增强的LC3-II积累( )。 重要的是，二甲双胍减少了转染对照siRNA细胞的凋亡细胞死亡和caspase-3和PARP的裂解，而在转染Atg7 siRNA的细胞中，这种保护作用减弱( ).
为了证实自噬对H9c2细胞生存是必要的，我们评估了过度表达Atg7腺病毒的H9c1细胞的凋亡。 Atg7的过度表达导致自噬流量增加，因为添加CQ后，在感染Atg7腺病毒的细胞中，LC3-II的积累量比感染GFP腺病毒的多( )。 此外，Atg7的过度表达减弱了高糖诱导的凋亡细胞死亡以及caspase-3和PARP的裂解( ).
激活的AMPK分离H9c2细胞中的Beclin1和Bcl-2。 报告称饥饿和Bcl-2同源结构域3分子模拟物通过Beclin1–Bcl-2复合物的解离刺激自噬( 9 , 35 )促使我们研究AMPK对Beclin1和Bcl-2相互作用的影响。 Beclin1的免疫沉淀，然后探测Bcl-2（或反向实验）表明，高糖增强了Beclin1和Bcl-2之间的联系，二甲双胍治疗破坏了这种相互作用( )。 再加上高糖水平降低了自噬流量，二甲双胍恢复了高糖处理的H9c2细胞的自噬，我们的数据表明，AMPK的激活可能通过Beclin1–Bcl-2复合物的解离刺激自噬。
AMPK激活JNK来调节Beclin1-Bcl-2的结合，诱导自噬，并减少凋亡细胞死亡。 A类 和 B类 ：H9c2细胞用或不用二甲双胍（Met；1 mmol/L）预处理1 h，然后在高糖（HG；30 mmol/L）培养基中培养48 h。Beclin1( A类 )或Bcl-2( B类 )从细胞裂解物中获得免疫沉淀（IP），并通过Western blot（IB）检测免疫沉淀中的Bcl-2或Beclin1( n个 = 4; * 对 <0.05与对照组【对比】，† 对 与HG相比<0.05）。 C类 ：H9c2细胞在二甲双胍（Met；1 mmol/L）存在或不存在的情况下用HG（30 mmol/L）处理24或36 h。 使用抗磷酸JNK1（Thr183/Tyr185）抗体通过Western blot检测JNK1的激活( n个 = 5; * 对 <0.05与Con，† 对 与HG相比<0.05）。 C类 , 正确的 ：在正常或HG下用二甲双胍（1 mmol/L）处理H9c2细胞36 h。通过Western blot测定JNK1磷酸化( n个 = 3; * 对 <0.05与Con，† 对 与HG相比<0.05）。 D类 ：用抗-Bcl-2抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后使用P-Bcl-2（Ser70）和Bcl-2抗体进行免疫印迹( n个 = 5; * 对 <0.05与Con，† 对 与HG相比<0.05）。 D类 , 正确的 ：在正常葡萄糖或HG条件下，用Met（1 mmol/L）处理H9c2细胞36小时。通过免疫沉淀和Western blotting测定Bcl-2的磷酸化( n个 = 3; * 对 <0.05与Con，† 对 与HG相比<0.05）。 E类 ：H9c2细胞用SP600125（SP；50μmol/L）预处理30 min，然后在HG（30 mmol/L）培养基中培养48 h，在有或无Met（1 mmol/L.）的情况下培养48 h。Western blot检测总JNK1和磷酸化JNK1。 此外，用抗Beclin1抗体对细胞裂解物进行免疫沉淀，用抗Bcl-2抗体对免疫沉淀进行免疫印迹( n个 = 5; * 对 <0.05与Con，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.01（相对于HG/Met）。 F类 ：通过Western blot分析LC3的表达( n个 = 5; * 对 <0.05与Con，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.01（相对于HG/Met）。 G公司 ：用LacZ或CA-JNK1质粒转染H9c2细胞24 h，然后在HG培养基中孵育36 h，Western blot检测JNK1。 细胞裂解物用抗Beclin1抗体进行免疫沉淀，然后用Western blotting检测免疫沉淀中的Bcl-2( n个 =5* 对 与LAZ/Con相比<0.05† 对 <0.05 vs.HG/LacZ）。 H（H） ：通过Western blot分析LC3的表达( n个 = 5; * 对 与LAZ/Con相比<0.05† 对 <0.05 vs.HG/LacZ）。 我 ：用SP（50μmol/L）预处理H9c2细胞30 min，然后用HG（30 mmol/L）在有或无Met（1 mmol/L）的情况下处理48 h。用抗-C-Casp3和抗-C-PARP抗体对细胞裂解物进行Western blot( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.05 vs.HG/Met）。 J型 ：用膜联蛋白V-PI双重染色流式细胞术检测细胞凋亡，并计算凋亡细胞与膜联蛋白V的比值 + /PI公司 − 单元格到总单元格( n个 = 5; * 对 <0.05与对照组，† 对 <0.05 vs.HG， 对 <0.05 vs.HG/Met）。
JNK1调节AMPK介导的Beclin1-Bcl-2复合物的分离、诱导自噬和抑制凋亡。 自Jun NH启动以来 2 -末端激酶1（JNK1）导致Bcl-2磷酸化( 36 , 37 )以及Beclin1–Bcl-2复合物的破坏( 38 )，我们首先分析了H9c2细胞中JNK1的磷酸化。 细胞暴露于高糖下24–36小时。24小时观察到JNK1磷酸化降低，36小时达到最低值。二甲双胍治疗阻止了这种降低( )。 与JNK1激活的改变一致，高糖降低了Ser70处的Bcl-2磷酸化，二甲双胍可抑制这种作用( ).
接下来，使用增益和损耗函数方法，确定了JNK1在调节Beclin1和Bcl-2之间相互作用中的作用。 在正常和高糖条件下，JNK1抑制剂SP600125降低了JNK1-磷酸化( )。 协同免疫沉淀实验表明，二甲双胍降低了正常葡萄糖培养基中Beclin1和Bcl-2之间的结合，而高糖则增强了这两种蛋白之间的结合。 服用SP600125可消除二甲双胍对Beclin1-Bcl-2复合物的影响，因为Beclin1和Bcl-2在这些条件下相关( )。 因此，二甲双胍增强的自噬作用减弱( )。 用CA-JNK1质粒转染H9c2细胞破坏了Beclin1和Bcl-2之间的联系，恢复了高糖条件下LC3-II的积累( )。 重要的是，SP600125对JNK1的抑制阻止了凋亡细胞数量的减少( )二甲双胍引起的凋亡标记物（即caspase-3和PARP的裂解）( )。 这些结果表明，激活JNK1–Bcl-2信号对AMPK诱导自噬以防止凋亡细胞死亡至关重要。
AMPK直接磷酸化JNK1。 接下来我们确定AMPK是否直接导致JNK1磷酸化。 如所示 二甲双胍以剂量依赖性的方式增加AMPK磷酸化，伴随着JNK1磷酸化的增加。 将纯化的重组AMPK与重组JNK1孵育，剂量依赖性地增加JNK1-磷酸化( )。 H9c2细胞暴露于升高的葡萄糖水平，抑制JNK1磷酸化，破坏AMPK和JNK1的相互作用。 一直以来，二甲双胍治疗抑制了干扰，表明AMPK与JNK1直接相互作用( ).
AMPK磷酸化JNK1。 A类 ：用指定浓度的二甲双胍（Met）处理H9c2细胞36 h。对细胞裂解物进行P-AMPK（Thr172）和P-JNK1（Thr183/Tyr185）的Western分析( n个 = 3; * 对 与对照组相比<0.05[续]）。 B类 ：用指定浓度的重组AMPK培养重组JNK1（500 ng）。 通过Western blotting测定JNK1的磷酸化( n个 = 3; * 对 与对照组相比<0.05）。 C类 ：H9c2细胞在正常葡萄糖和HG下用Met（1 mmol/L）处理36 h。 通过免疫沉淀（IP）和免疫印迹（IB）测定AMPK和JNK1的相互作用( n个 = 3; * 对 <0.05与对照组，† 对 与HG相比<0.05）。 D类 ：用对照siRNA（C-siRNA）或mTOR-siRNA（mTOR-si）转染H9c2细胞48 h，然后在HG（30 mmol/L）培养基中培养48 h。通过免疫沉淀和Western blotting检测Beclin1和Bcl-2的结合( n个 = 3; NS，不显著）。
我们最近报道，高血糖激活哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）信号通路并抑制心脏自噬，二甲双胍激活AMPK与抑制mTOR信号和恢复自噬有关( 11 )。 在这个实验中，我们进一步确定mTOR是否影响Bcl-2–Beclin1相互作用。 如所示 mTOR的抑制并没有破坏由葡萄糖水平升高引起的Beclin1和Bcl-2之间的联系。
二甲双胍通过破坏糖尿病心脏中的Beclin1-Bcl2复合物诱导自噬。 糖尿病诱导4个月后，糖尿病小鼠的血糖水平显著高于对照组（469±27 vs.108±5 mg/dL； 对 < 0.001, n个 =每组11个）。 二甲双胍不能使血糖正常化（451±28 mg/dL； n个 =9）在糖尿病小鼠中。 在FVB小鼠中，二甲双胍治疗增加了AMPK和ACC磷酸化( )，激活JNK1和Bcl-2，破坏Beclin1和Bcl-1之间的联系( )以及LC3-II蛋白水平升高( )。 与FVB对照组相比，糖尿病降低了AMPK和ACC的磷酸化( )二甲双胍治疗可恢复磷酸化水平( )。 高血糖降低了JNK1和Bcl-2的磷酸化，并增强了Beclin1与Bcl-2之间的相互作用。 慢性二甲双胍刺激JNK1和Bcl-2，导致Beclin1和Bcl_2解离( )。 因此，二甲双胍的服用增强了糖尿病小鼠的LC3-II蛋白水平( ).
AMPK的激活扰乱了Bcl-2–Beclin1的关联并恢复糖尿病心脏的自噬。 A类 ：使用P-AMPK（Thr172）和P-ACC（Ser79）抗体通过Western blot检测FVB（对照）、二甲双胍治疗的FVB、STZ治疗的STZ（STZ/Met）小鼠心脏组织中AMPK和ACC的磷酸化，并通过密度计进行量化( n个 =每组6人* 对 <0.05与Con，† 对 与STZ相比<0.05）。 B类 ：通过蛋白质印迹分析心脏组织中总的和磷酸化的JNK1的表达。 此外，用抗-Bcl-2抗体对心脏组织进行免疫沉淀（IP），然后使用P-Bcl-2（Ser70）、Beclin1和Bcl-2抗体通过免疫印迹（IB）检测免疫沉淀。 所示结果代表了三个独立的实验。 C类 ：心脏组织进行Western blotting，以使用特定抗体确定LC3的表达( n个 =每组5人* 对 <0.05与Con，† 对 与STZ相比<0.05）。 D类 ：心脏组织中AMPK活性的测定如 研究设计与方法 ( n个 = 5; * 对 <0.05与WT/Con，† 对 <0.05 vs.WT/STZ， 对 <0.05 vs.WT/STZ/Met）。 E类 ：FVB（WT）和DN-AMPKα2（DN）转基因小鼠接受或不接受STZ治疗。 通过Western blotting测定心脏组织中的LC3-II蛋白水平( n个 = 5; * 对 <0.05 vs.WT）。 F类 ：用或不用二甲双胍（Met）治疗糖尿病WT和DN小鼠，然后对这些小鼠的心脏匀浆进行Western blot检测LC3的表达( n个 = 5; * 对 <0.05与WT/STZ，† 对 <0.05 vs.WT/STZ/Met）。 G公司 ：通过蛋白质印迹检测FVB对照（Con）、STZ和STZ/Met小鼠心脏组织中Akt在Ser437的磷酸化，并通过密度计定量( n个 =每组6人* 对 <0.05与Con，† 对 与STZ相比<0.05）。
为了确定AMPK在体内心脏自噬调节中的作用，我们在FVB（WT）和DN-AMPKα2（DN）转基因小鼠中诱导糖尿病。 糖尿病诱导4个月后，糖尿病小鼠的血糖高于非糖尿病对照组（WT:477±21 vs.113±2 mg/dL， 对 < 0.001, n个 =每组8人； DN：483±15 vs.125±9 mg/dL， 对 < 0.001, n个 =每组9人）。 DN-AMPKα2的过度表达和STZ诱导的糖尿病抑制了AMPKα2的活性。 糖尿病并未导致DN心脏AMPKα2活性的进一步降低。 长期服用二甲双胍可恢复WT-STZ小鼠的AMPK活性，但在DN-STZ鼠中无此作用( )。 虽然DN小鼠的心脏表型正常，但其心脏LC3-II水平较低( )表明心脏自噬减少。 高血糖降低了WT和DN小鼠LC3-II的蓄积( )。 虽然二甲双胍未能使糖尿病小鼠的血糖水平正常化，但该治疗恢复了WT糖尿病小鼠的LC3-II蛋白水平。 值得注意的是，心脏中DN-AMPKα2的过度表达降低了二甲双胍对自噬的保护作用( )。 我们还确定了二甲双胍对AMPK的激活是否能改善胰岛素信号传导。 如所示 二甲双胍治疗可防止糖尿病患者Akt磷酸化降低。
AMPK增强的自噬激活与糖尿病小鼠心肌细胞凋亡减少相关。 接下来，我们确定了自噬诱导对体内心脏凋亡的影响。 在FVB小鼠中，二甲双胍治疗对TUNEL阳性细胞的数量以及caspase-3和PARP的裂解没有影响( )。 TUNEL染色显示，在对照小鼠心脏中很少发现TUNEL阳性细胞，但在糖尿病小鼠心脏中观察到大量TUNEL阴性细胞。 慢性二甲双胍治疗减弱了这种增加( )。 一致地，心脏匀浆的Western分析显示糖尿病小鼠心脏中caspase-3和PARP的裂解显著增加，二甲双胍治疗抑制了糖尿病小鼠凋亡标记物的增加( )。 在非糖尿病小鼠中，DN-AMPKα2的过度表达并没有增加这些凋亡标记物，与WT心脏相比，这种突变也没有夸大糖尿病DN心脏的凋亡( )。 二甲双胍可预防糖尿病WT小鼠caspase-3和PARP的断裂，但对糖尿病DN小鼠无此作用( ).
激活AMPK可防止糖尿病心脏细胞凋亡。 A类 ：TUNEL染色的代表性图像。 用TUNEL染色法标记对照组、二甲双胍处理的FVB（Met）、STZ处理的STZ（STZ）和二甲双胍-处理的STZ/Met（STZ/Met）小鼠心脏切片中的凋亡细胞。 B类 ：条形图中显示TUNEL阳性细胞的数量( n个 =每组6人* 对 <0.05与对照组，† 对 与STZ相比<0.05）。 C类 和 D类 心脏匀浆中裂解caspase-3（C-Caspa3）和裂解PARP（C-PARP）的西方分析( n个 = 5; * 对 与对照组相比<0.05，† 对 与STZ相比<0.05）。 E类 ：FVB（WT）和DN-AMPKα2（DN）转基因小鼠用或不用STZ处理，然后对心脏组织进行Western blot分析，以测定C-Casp3和C-PARP的表达( n个 =每组5个* 对 <0.05与WT，† 对 <0.05 vs.DN）。 F类 ：用或不用二甲双胍（Met）治疗糖尿病WT和DN小鼠，然后对心脏匀浆进行Western blot检测C-Casp3和C-PARP的表达( n个 = 5; * 对 <0.05与WT/STZ，† 对 <0.05 vs.WT/STZ/Met）。
二甲双胍恢复的自噬改善糖尿病小鼠的心脏结构和功能。 长期服用二甲双胍对I型胶原沉积没有影响( )和心脏功能( )在非糖尿病小鼠中。 与对照心脏相比，糖尿病心脏I型胶原沉积增加，二甲双胍治疗可减弱这种影响( )。 通过分析左室最大发展压力（计算dp/dt）来确定左室收缩和舒张功能 最大值 （单位时间内压力的最大变化）和dp/dt最小值（dp/dt 最小值 )。 与FVB对照小鼠相比，糖尿病小鼠的左心室压力显著降低( )和dp/dt 最大值 ( )。 慢性二甲双胍可恢复LV发展压力和dp/dt 最大值 ( )到野生型水平。 此外，dp/dt 最小值 与FVB对照组小鼠相比，糖尿病小鼠的左室舒张功能受损。 长期服用二甲双胍可以预防这种损伤( ).
二甲双胍改善糖尿病心脏的心脏纤维化和心脏功能。 A类 心脏组织中I型胶原的免疫组织化学染色。 对照组、二甲双胍处理的FVB（Met）、STZ处理的STZ（STZ）和二甲双胍-处理的STZ（Met/STZ）小鼠的心脏切片用I型胶原抗体染色，细胞核用苏木精复染。 B类 ：I型胶原染色区域的定量分析如条形图所示( n个 =每组6人* 对 <0.05与对照组，† 对 与STZ相比<0.05）。 C类 —— E类 ：通过Langendorff灌注分析确定对照组、STZ和STZ/Met小鼠LV发展压力和体积之间的关系。 STZ小鼠产生的压力降低，二甲双胍治疗可以预防这种抑制( C类 )。 二甲双胍改善LV dp/dt 最大值 ( D类 )和dp/dt 最小值 ( E类 )STZ小鼠( n个 =每组6个* 对 <0.05与对照组，† 对 与STZ相比<0.05）。
讨论 在当前研究中，我们证明高血糖抑制JNK–Bcl-2信号传导并促进Beclin1和Bcl-2之间的相互作用。 同时，高水平的葡萄糖诱导细胞凋亡并抑制心脏自噬。 AMPK的激活刺激JNK1，JNK1-介导Bcl-2磷酸化和随后的Beclin1-Bcl-2解离，导致心脏自噬的恢复和对心脏凋亡的保护。 因此，糖尿病小鼠的心脏结构和功能得到改善。 我们的研究结果表明，JNK1–Bcl-2信号通路的激活和随后Beclin1–Bcl2复合物的破坏可能是AMPK在糖尿病条件下调节自噬和凋亡细胞死亡途径之间转换的重要机制。
糖尿病心肌病的特征是肌肉质量减少、间质纤维化和心室功能受损。 由于成年心肌细胞很少增殖，心肌细胞的丢失最终会导致心脏功能受损。 在STZ诱导的糖尿病小鼠中，高血糖增加了TUNEL阳性细胞的数量以及caspase-3和PARP的裂解，这与I型胶原沉积增加以及心脏收缩和舒张功能受损有关。 长期服用二甲双胍（一种著名的AMPK激活剂）可防止凋亡细胞死亡，从而减少心脏纤维化并改善心脏功能。 更重要的是，糖尿病小鼠的心脏自噬受到抑制。 通过慢性二甲双胍治疗激活AMPK可防止糖尿病抑制的心脏自噬。 这些观察结果为心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病发展过程中的关键事件这一假说提供了有力证据。 这些发现还表明，自噬和凋亡细胞死亡途径之间的相互作用在糖尿病心肌病的发病机制中很重要。
尽管理论上自噬可能通过过度的自我消化和基本细胞成分的降解导致细胞死亡，但据报道，这一过程实际上可以保护细胞免受凋亡( 39 )。 例如，自噬增加通过抑制细胞凋亡，在营养缺乏或生长因子缺乏的情况下促进细胞存活( 40 , 41 )。 然而，最近的一项研究表明，高糖直接抑制新生大鼠心肌细胞的自噬流量，在这些细胞中，自噬的减少似乎是一种适应性反应，可以限制高糖诱导的心肌细胞损伤( 42 )。 据报道，新生心肌细胞的行为与成年心肌细胞有很大不同( 43 )。 特别是，在相对饥饿的围产期，新生儿心脏组织中的自噬上调( 44 )。 因此，自噬可能是保护性的，也可能是有害的，这取决于细胞类型和细胞环境。 在我们的研究中，二甲双胍增强自噬或过度表达Atg7蛋白可减轻高血糖诱导的凋亡细胞死亡、心脏纤维化和心脏功能障碍，但二甲双胍的这些保护作用在AMPKα2缺乏的小鼠中不存在。 这些数据表明，激活的AMPK诱导自噬是一种保护机制，可防止高血糖对心肌细胞的损伤。
抗凋亡蛋白Bcl-2和自噬蛋白Beclin1之间的相互作用被证明可以调节自噬和凋亡机制之间的转换( 38 )。 Beclin1是形成自噬囊泡所需的III类PI3K复合物的一部分，而Beclin 1的干扰可阻止自噬诱导( 45 )。 Beclin1是Bcl-2的一种相互作用蛋白( 46 )。 Bcl-2与Beclin1的结合通过将Beclin 1与III类PI3K隔离来抑制Beclin1-介导的自噬( 35 , 47 )。 在这里，我们观察到Beclin1和Bcl-2在高血糖处理的H9c2细胞和糖尿病动物心脏中的强烈相互作用。 用二甲双胍处理细胞和动物以激活AMPK，导致Beclin1和Bcl-2之间的联系中断，游离Beclinl与III类PI3K结合形成激酶复合物( 9 )对于诱导自噬至关重要。 自噬的诱导降解和再循环细胞质成分，选择性地清除受损的线粒体，起到细胞保护机制的作用。 此外，磷酸化的Bcl-2可以保持线粒体外膜的完整性，并阻止促凋亡蛋白释放到细胞质中( 48 , 49 )从而防止细胞凋亡。 因此，Bcl-2与Beclin1的分离可能是AMPK激活在糖尿病条件下恢复自噬并防止细胞凋亡的重要机制。
与饥饿破坏Beclin1和Bcl-2之间联系的发现一致，这取决于JNK1介导的Bcl-2在蛋白质多个残基上的磷酸化( 38 , 50 )，JNK1–Bcl-2信号也调节Beclin1和Bcl-2在糖尿病心肌病发展中的相互作用。 由于AMPK可以直接磷酸化JNK1，因此在高血糖存在下抑制AMPK会降低JNK1和Bcl-2的磷酸化，增强Beclin1和Bcl-2之间的相互作用，并抑制自噬活性。 二甲双胍激活AMPK或组成活性JNK1过度表达刺激JNK1-Bcl-2通路，导致Beclin1-Bcl-2复合物解离和自噬恢复。 这些作用被JNK1的抑制所阻断。 更重要的是，通过抑制JNK1抑制自噬可以防止高血糖水平诱导的凋亡细胞死亡，这表明JNK1–Bcl-2信号传导是AMPK促进糖尿病条件下心肌细胞存活的关键途径。
总之，我们证明AMPK激活通过调节自噬和凋亡机制之间的转换来减轻糖尿病心肌病。 这种效应归因于JNK介导的Bcl-2磷酸化和随后的Beclin1-Bcl-2解离。 我们的结果为自噬在糖尿病心肌病发展中的调节提供了新的见解，并提示自噬的特定调节，可能通过刺激AMPK，可能代表了治疗糖尿病患者心力衰竭的一种新方法。
致谢 本研究得到了以下来源的资助：美国国立卫生研究院（HL-079584、HL-080499、HL-074399、HL-0.89920、HL-096032和HL-110488至M.Z.以及1P20-RR-024215-01至Z.X.和M.Z.）、美国心脏协会科学家发展奖助金（Z.X）、， 以及俄克拉荷马州科学技术促进中心（Z.X.）。 M.H.Z.是美国心脏协会国家公认研究者奖的获得者。
没有报告与本文相关的潜在利益冲突。
C.H.研究了数据并准备了手稿。 H.Z.和H.L.研究了数据。 M.-H.Z构思了这个项目并撰写了论文。 Z.X设计了实验，分析了数据，并撰写了手稿。 Z.X.是这项工作的保证人，完全可以访问所有数据，并对数据的完整性和数据分析的准确性承担全部责任。
作者感谢田荣博士（华盛顿大学西雅图分校）提供DN-AMPKα2心肌特异性转基因小鼠。
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