前列腺癌生长、侵袭和药物反应研究的三维模型综合小组

摘要

介绍

二维（2D）单层细胞培养代表了上皮细胞和上皮癌的高度还原模型，因为人工塑料表面上的生理细胞外基质（ECM）丢失，并且血清浓度较高。因此，细胞失去了相关特性，如分化、极化、细胞间通讯和细胞外基质接触，而伤口愈合、炎症过程和过度增殖则被人为促进。在前列腺癌（PrCa）细胞系的单层培养中，未分化肿瘤干细胞通过基底细胞、瞬时扩增细胞和终末分化的激素敏感性腔细胞的稳态取决于细胞培养条件、钙和血清浓度[1]，[2]在体内仅能很好地代表肿瘤细胞生物学。缺乏相关的基底层（BL）、ECM沉积缺陷以及基质或肌上皮成分缺失[3]进一步促进了人工自然。因此，单层培养中最有效的小分子抑制剂是针对增殖和有丝分裂的化疗药物。这种不平衡导致了复方疗效在在体外和体内实验。与细胞-细胞相互作用、成熟、上皮-间充质转化（EMT）和癌症干细胞（CSC）有关的药物作用可能未被发现。3D架构和ECM都对药物疗效有很大影响[4]腺上皮癌细胞迅速适应不同的微环境，并能在调节增殖、分化和生存的替代途径之间动态切换。

耐药或化疗药物无效的发展也需要适当的细胞培养模型。耐药性通常归因于肿瘤干细胞（CSC）假说：抗有丝分裂癌药物可以避免缓慢增殖的肿瘤再生干细胞或祖细胞[5]–[7]最终重新构成肿瘤的质量。这可能与EMT相伴随[7]–[10]增加了转移潜能[8]因此，抗癌药物的研究进入了一个新阶段，研究人员越来越多地利用器官型模型系统来更直接地探索多细胞类有机物的药物靶点，这些有机物通常富含干细胞[11].适当在体外适用于CSC稳态、EMT、侵袭和转移分析的实验模型正日益与癌症药物研发相关。这些还应具有成本效益，并为高内容筛选提供足够的吞吐量。

20多年前，在纯化的ECM（如胶原蛋白、水凝胶或Matrigel）中培养腺上皮（癌）细胞[12]Matrigel代表一种重组的富含层粘连蛋白的基底膜，支持诸如细胞极性、细胞间和细胞-基质相互作用以及分化标记的重新表达等过程，即使在转化系中也是如此[13]乳腺和前列腺上皮细胞形成球形，称为乳腺球[14]或前列腺素[15]分别为。正常前列腺上皮细胞分化为极化良好的空心球体，这是功能性腺上皮细胞的标志。相同的微环境也支持细胞迁移、分支和形成特征性腺泡[16]，[17]相反，肿瘤细胞通常表现出有缺陷的分化程序，并形成结构紊乱的非典型球体，这在乳腺癌中最为明显[18]–[20]球体的基因表达模式被证明与3D培养中形成的特征表型相关[19]，[20]癌症的整体分化和侵袭潜能[21]，[22]与正常上皮细胞类似，PrCa细胞也可以主动侵入周围的基质凝胶，尽管它们的迁移模式不同于正常细胞分支中观察到的正常、集体片状或管状迁移模式。癌症侵袭的表型取决于ECM的组成和密度，可能有变形虫起泡、间充质成纤维细胞样运动和多细胞流或链迁移[23]，[24]自然，侵袭潜能还取决于PrCa细胞的遗传背景及其（通常受损）参与严格上皮细胞-细胞接触的能力。乳腺癌和其他上皮癌细胞形成圆柱形纺锤状细胞，具有收缩和伸长的潜能，支持通过周围ECM网的迁移。关于PrCa的了解要少得多。蛋白水解过程和蛋白酶（如组织蛋白酶）有助于入侵[25]、基质金属蛋白酶（MMPs[24])成纤维细胞分泌的可溶性因子或成纤维细胞自身的存在[26]，[27]以及其他因素，如纤维连接蛋白和赖氨酰氧化酶[26]在这方面，肿瘤细胞侵袭的3D模型[28]与细胞在塑料表面扩散和滑动的二维单层培养相比，它更能代表肿瘤的细胞动力学和结构。接受EMT和获得间充质迁移模式的可能性是另一个被假设为有助于乳腺和PrCa侵袭和运动的参数[29].

此外，尚不清楚PrCa球状体，尤其是在lrECM中生长时，是否显示CSC种群的富集（通常与EMT有关），或对化疗药物和电离辐射产生耐药性[30]，[31]至少，CSC或EMT的参与有望在LrECM中显示出与漂浮前列腺素和2D单层条件下截然不同的3D培养分化动力学[32]最后同样重要的是，肿瘤细胞侵袭的细胞培养模型目前仅限于几种广泛使用的、潜在的人工测定（transwell侵袭测定；划痕迁移测定）。由于入侵在3D条件下有着本质上的不同，任何具有代表性的3D入侵模型都代表了真正的新颖性[26、28和33]。

我们在这里报道了利用29个前列腺细胞系组成的小组开发微型3D细胞培养模型系统及其形态学特征。然后，通过全基因组转录组分析和系统生物学对选择的最具代表性的株系进行进一步表征，以确定对恶性PrCa细胞生长和侵袭至关重要的关键途径、信号分子、基因网络和假定药物靶点。此外，已经开发了生物信息学图像分析工具来量化动态表型特征，如侵袭结构、球体形状或药物反应。

材料和方法

结果

正常前列腺上皮细胞和PrCa细胞在Matrigel中形成特征性形态

正常前列腺和前列腺癌（PrCa）细胞系不能在纯富含胶原蛋白的细胞外基质中分化和形成多细胞结构(图S1). 在胶原蛋白中，正常细胞和肿瘤细胞都只形成松散的聚集物，细胞间接触不良或无接触，通常表现为成纤维细胞样的生长模式。相反，Matrigel强烈支持正常和PrCa球体的生长和分化。基质胶对所有测试的细胞系都有深远的影响，除了少数例外；支持相关多细胞结构的形成。Matrigel中球体的形成通常由单个细胞启动。Matrigel形成的球体通常分为四种形态类别[19]，[35](图1;图S2).

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图1

3D Matrigel培养中形成的球体的典型相位对比图像。

大多数结构分为圆形、块状、星状或葡萄柚状。一些细胞系在Matrigel中未能形成球形，但作为单个活细胞持续存在长达两周（单个表型）。大多数球状体在接种后第9-10天成像。PC-3球状体在第9天表现为圆形表型，在第13天发生向侵袭性/星状表型的变态。PC-3M在更早的时间点（第5-8天）也会发生同样的情况。

分枝/圆形表型

正常初级前列腺上皮细胞（PrEC）和非转化系，如RWPE-1和EP156T细胞在培养6–10天后形成圆形球体(图1). 正常的PrEC和体外永生化细胞系，如RWPE-1和PWR-1E细胞，同时形成分支腺泡和圆形球体结构，以大细胞聚集体的形式主动迁移到周围的ECM中(图2a-d). EP156T细胞无分枝结构或很少分枝结构。圆形结构通常形成坚固的基底层（BL），包裹球体和腺泡结构(图2，图S2，图3g–m). 令人惊讶的是，肿瘤细胞系DU145、PC-3和PC-3M细胞也形成了圆形且分化良好的极化球体(图2e)周围有一个完整的BL，通常含有管腔（PC-3；图3e+r). 此外，PC-3球体通常包含一个内部细胞团，使人想起PIN（前列腺上皮内瘤）中的结构。紧密连接蛋白如ZO-1（未显示）和F-actin的免疫染色(图3a-c)在正常细胞和肿瘤细胞形成的圆形球体中，细胞间的接触和细胞极化通常非常牢固。

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图2

对Matrigel中生长的各种前列腺细胞和细胞系进行相位对比和共焦激光扫描显微镜观察，说明了在几个非转化细胞系中典型观察到的分支表型与仅限于肿瘤细胞的星状/侵袭表型之间的表型差异。

A） RWPE-1细胞形成的分支结构的相位对比图，B）用层粘连蛋白B1抗体染色的RWPE-1形成的腺泡结构。C） 初级前列腺上皮细胞（PrEC）形成的分支或簇状结构。D） ●●●●。PWR-1E细胞形成的混合分枝和大量表型结构。E） 第9天，PC-3细胞形成圆形结构，用钙黄绿素活细胞染色。F） 第13天，圆形球体形态转变为侵入性结构。G） 第13天左右侵袭性PC-3结构的相位对照图像。H） 。用整合素β1活性形式（ITGB1）特异性抗体对PC-3丝状体进行染色，显示纺锤状细胞结构的致密装饰。

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图3

使用抗基底膜成分层粘连蛋白β1（LAMB1）、间充质标记物波形蛋白（VIM）和纤维连接蛋白（FN）的抗体，对在Matrigel中生长9或14天的球体结构进行代表性免疫细胞化学染色。

Alexa488标记的卵磷脂用于检测F-actin，Hoechst染色用于标记细胞核（蓝色）。RWPE1、DU145和PC3细胞显示EMT相关间充质标记物的表达，而与表型无关（PC-3细胞；第9天为圆形，第14天为星状）。

群体表型

大多数PrCa（LNCaP、22rV1、MDA-PrCa1、UM-SCP1、CWR-r1、LAPC-4）和两种在体外变形线（PWR-1E、RWPE-2）产生了大而不规则的球体，通常BL不完整或缺失，也缺乏中空内腔(图3d+k). PWR-1E是唯一能够分枝/腺泡形态发生的大规模表型细胞系(图2d). 管腔角蛋白KRT8和KRT18总是强烈表达(表S3). 与圆形球体相比，细胞间的接触、成熟和极化通常不太明显，这反映在通常呈肾形的不规则球体上(图1). 群体表型结构通常不显示lrECM的侵袭性；然而，在22rV1细胞系中持续观察到丝足或伪足的形成，偶尔在LNCaP和RWPE-2细胞系中观察到。在LNCaP球体中，经常观察到细胞在BL覆盖不完全的部位离开球体结构(图S2).

葡萄样表型

只有一个细胞系1013L持续形成松散的细胞簇，细胞与细胞之间的接触特别差，缺乏BL。LAPC-4细胞形成了块状和葡萄状结构。在这些细胞系中未观察到侵袭性。

星形“侵袭性”表型

体外转化的细胞系RWPE-2/w99、WPE-1/NB14和肿瘤细胞系ALVA-31和ALVA-41形成星状或侵袭性结构，其特征是纺锤状丝足(图2g)以及细胞链通过周围ECM的快速迁移。所形成的侵袭结构几乎都是多细胞的，呈链状侵入模式。仅偶尔观察到单个细胞的成纤维细胞样间充质浸润。这个在体外转化株RWPE-2、RWPE-2/w99和WPE1/NB14同时形成星状结构和圆形球体，表明这些细胞系的组成不均一。其中，RWPE-2/w99代表具有最一致星状表型的细胞系，并被选择用于进一步实验。永生前列腺基质细胞（WPMY-1）和肿瘤来源的原代基质细胞（未显示）也形成星形结构，但缺乏快速运动和侵袭性。

侵入式开关

PC-3和PC-3M细胞形成了圆形且分化良好的极化球体，但在3D中分别在10-13和6-8天左右发生了向侵袭形态的自发转化(图2e+f，补充入侵电影S1). 形态转化为星形侵袭表型的开始取决于细胞密度。注入新鲜培养基后，转化可能会暂时延迟，甚至部分恢复，但最终会继续进行，直到所有结构彻底转化，只有星状结构保留下来(图2g). 甚至在入侵之前形成的入侵结构和丝状伪足强烈表达层粘连蛋白受体整合素β1的活性形式，表明与细胞外基质的强烈接触是入侵过程的先决条件(图2h). 同时，转换结构的BL变得越来越模糊和瓦解(图3m). 间充质标志物波形蛋白VIM和纤维连接蛋白FN1的强表达(图3o–y)在非侵袭性RWPE-1（异质性）和DU145以及PC-3细胞中观察到，与星状表型无关。此外，PC-3和PC-3M细胞侵袭性转化后，VIM和FN1的表达没有增加(图3s+y)

“单一”表型

一些癌系（VCaP、DuCaP、NCI-H660和MDA-PCa2b）未能形成球状体，但以单细胞（“单一”或“单一表型”）的形式持续长达2周。有趣的是，所有这些细胞系的ETS转录因子融合事件或重排均为阳性（H660、VCaP和DuCaP中的TMPRSS2-ERG，MDA-PCa 2b中的平衡ETV1重排）。对Matrigel中VCaP细胞的基因表达分析表明，当细胞嵌入Matrige1中时，细胞可能会发生终末分化或衰老（数据未显示）。在Matrigel中TMPRSS2-ERG融合基因和增殖相关基因的表达降低。然而，VCaP和DuCaP在I型胶原凝胶中的生长不受限制；Col I中的基因表达模式有限（未显示）。

Matrigel引起的基因表达动态变化与正常、转化和侵袭特性相关

LrECM和球体的形成导致PrCa细胞的细胞生物学、蛋白质和mRNA基因表达发生根本性变化。2D和3D条件下约有3400 mRNA差异表达，但并非在所有细胞系和所有时间点上都一致。在一组细胞系中观察到三种普遍的基因表达改变模式(图4a+b). 通过qRT-PCR验证所选基因的表达改变(图4c). 如qRT-PCR所证实的，与阵列数据相比，差异表达的因素通常更大。GO分析和GSEA揭示了大多数簇的高度显著的丰富功能基因类别(表S4，第5章和S6系列).

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图4

与单层培养相比，在富含层粘连蛋白的ECM（Matrigel）中培养的细胞的mRNA基因表达改变的特征模式（比率3D/2D）。

A） Heatmap，说明了K-means算法生成的12个簇。簇1+2代表仅受正常细胞影响的基因（PrEC，EP156T）。簇6-8表示所有细胞系中对Matrigel 3D中3D细胞培养的反应中类似诱导或抑制的基因，无论表型或转化如何。簇9-12包含星状/侵袭型细胞系（ALVA31、PC3、PC3M、RWPE2/w99）的特征基因，或在圆形结构自发转化为星状结构期间诱导的基因（例如PC3、第13天和第15天）。B） 平均表达变化，说明集群内改变基因表达的中位数（深灰色）和变异（浅灰色）。C） 一组选定基因的QRT-PCR分析（黑色）和Illumina阵列数据（灰色），验证侵袭性PC-3细胞中表达增加。

a） 非转化细胞

对3D Matrigel培养反应的基因（簇1+2；图4a;表S4)仅限于非转化细胞，主要与ECM周转、脂质和二十烷酸/前列腺素代谢或细胞分化有关。这些基因集可能是正常球体成熟和腺泡分支所必需的，包括上皮分化、细胞迁移和腺泡形态发生的已知调节因子，如WNT5A[36]，[37]基底型细胞角蛋白如KRT5和KRT14。这些基因中有许多与基底上皮分化模式相关。相反，PrCa细胞优先显示管腔分化。

b） 基质对基因表达的广义影响

对lrECM反应均匀的基因集，无论细胞系、转化状态或球体形态如何，都可分为3个簇：簇7（受抑制）在线粒体和核糖体功能、mRNA处理和一般代谢过程中高度富集，表明总体生长减少，与单层培养相比，3D中细胞的代谢活性和增殖。同样，聚类8也显示出极显著性（p<10⁻⁵⁷)细胞周期、DNA合成、有丝分裂和增殖过程的富集，证实了lrECM导致细胞增殖的普遍降低。然而，平均褶皱变化(图4b)观察到这些基因在1.5到2倍之间；表明3D培养中的细胞继续复制，但与2D相比速度较慢。与PrCa系相比，lrECM中正常PrEC的持续增殖时间更长；这种作用也被描述用于原代乳腺上皮细胞[18]簇6富含与脂质/类固醇代谢相关的基因（p<10⁻¹¹)染色质修饰和表观遗传重编程（p<10）⁻⁷)这表明腺泡分化涉及到深刻的表观遗传变化。

c） 侵入性转换

星状表达或在圆形PC-3球体向星状结构的形态转化过程中诱导的基因集（簇9）在与细胞粘附、细胞-细胞接触、侵袭/转移和ECM周转相关的GO术语中富集（胶原蛋白、层粘连蛋白亚型、整合素ITGB2、ITGB4、ITGAV、ITGA1和ITGA10；表S4). 该簇还包含许多早期发育转录调控因子（CITED2、HEY1、SOX4、SOX9、FOXO3、HOXA13、HOXB13、qRT-PCR验证图4c). 簇11在侵袭性PC-3和分支RWPE-1细胞中均表现出强烈的基因诱导，主要包含干扰素诱导基因（OAS1、OAS2、MX1、IFI27、STAT1、STAT2等）。这可能表明IFNsα/β、STAT1/STAT2转录因子和炎症过程在非转化上皮细胞（RWPE-1）的侵袭和分支中具有双重作用。

主成分分析：细胞株mRNA基因表达特征与3D形态学相关

主成分分析（PCA，图5a)用于识别可区分正常/圆形球体（PrEC、EP156T和RWPE1）、质量球体（LNCaP和22rV1）和星状形态球体（ALVA31、PC3、PC3M、RWPE-2/w99）的最具特征的基因特征。基础角蛋白KRT5、KRT6A-C、KRT13、KRT14和KRT17代表了圆形球体最具代表性的基因，是体外永生系和正常前列腺上皮细胞的基础样表型的特征。内脏标记物，如角蛋白KRT8和KRT18仅表达较差(表S3)但炎症性趋化因子如白细胞介素1a和IL1b也具有特征性。相反，管腔分化相关和雄激素诱导基因，如NKX3-1、SYT4、KLK4、CK18和TMSL8，被确定为群体表型的最具特征性标记，代表了大多数PrCa细胞系。CTGF（结缔组织生长因子）或PLAT（组织型纤溶酶原激活剂）等基因是侵袭性细胞系PC-3或RWPE-2/w99最具特征性的基因；表明TGF-β信号转导、ECM主动重塑和间充质特性在侵袭过程中可能发挥作用[38]使用Ingenuity Pathway analysis（IPA）对与侵袭/星状表型最密切相关的基因进行进一步分析，产生了多个基因网络，包括一个阐明与AKT通路和通过各种G蛋白偶联受体（Gα_我蛋白）、趋化因子受体CXCR4、侵袭和血管生成相关神经毛蛋白（NRP1）和神经肽apelin（APLN）。其他相关基因包括细胞骨架蛋白zyxin（ZYX）和nebulette（NEBL）、ECM相关基因EFEMP2（含EGF的纤维样细胞外基质蛋白2）、嗜菱形蛋白（RHPN）和FAM107A，以及转录因子FOXO3和TCF4(图5b). 尽管侵袭性星状结构的基底层变得越来越模糊和解体，但侵袭性PC-3、PC-3M和ALVA31细胞继续分泌不同的层粘连蛋白。在3D培养的PC-3细胞早期，与正常上皮分化相关的层粘连蛋白-5（α3β3γ2）被重新诱导，而其他层粘连素亚基（α5，β2，γ1）在转化后被去新生表达(图5c)经免疫荧光验证(图5d，LAM-89泛素抗体）。

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图5

与2D单层相比，3D培养中改变的基因表达数据的功能分析。

A） 主成分分析（PCA），说明区分圆形、块状和星状形态的基因集。圆形表型细胞包括PrEC、EP156T和RWPE1。肿块表型以LNCaP和22rV1细胞为代表。星形细胞/侵袭性细胞包括ALVA31、PC3、PC3M和RWPE-2/w99。B） 入侵相关集群9-12的创新路径分析（IPA）(图4)，说明生成了13个网络中的2个。该网络以AKT和PI3-激酶途径为中心。颜色与圆形和侵入性球体之间观察到的差异表达因子相关（红色：诱导，绿色：抑制）。C） 热图，说明2D和3D培养中层粘连蛋白mRNA表达的改变。层粘连蛋白α5、γ1、β2和α3的表达在PC-3和PC-3M细胞的侵袭性转化中受到强烈诱导（13+15天）。D） 侵袭开始后各种层粘连蛋白的持续表达，如用检测各种α和β亚单位的人类特异性抗体（LAM-89）染色所示。

与球状体形成和侵袭相关的途径、关键调节蛋白和分子机制

与2D/单层培养相比，通过多种生物信息学方法的组合，包括主成分分析（PCA）、创新路径分析（IPA）、基因本体注释（GO）和基因集富集分析（GSEA），确定了形成圆形和块状球体的关键途径。

圆形和块状表型

与3D中圆形和块状球体的形成最相关的途径主要与脂质和类固醇代谢、前列腺素/二十烷酸以及基因表达的表观遗传调控有关。(表S5和S6系列)在确定的关键信号分子中，IGF1/IGF2受体、NFκB、促炎性趋化因子（IL-1α、TNFα和CCL2）以及AKT和PI3Kinase被认为是最突出的。NFκB1的表达（p50，p105）；IKKα、STAT1和p-STAT1（但不是STAT2）；与2D相比，球体中或Smad-3持续减少(图6a). 这种模式与抑制性IκBα和IκB-ε蛋白水平的暂时升高相一致(图6b)，在球体形成的第6-8天左右达到峰值。这表明对促炎过程和趋化因子/细胞因子（如CCL2）的严格控制，特别是在球体形成的早期阶段，但在侵入性结构中没有。phospo-GSK3β表达的裂解物阵列分析显示出非常相似的动力学（未显示），进一步支持在球体形成的关键阶段NFκB和Wnt信号通路的暂时抑制。

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图6

2D与3D培养中关键信号分子、磷酸蛋白和转录因子的表达改变。

A） 各种转录因子（AKT1、STAT1、STAT2、IKKα、NFkB1 p50、SMAD3）、雄激素受体（AR）和PCNA的蛋白质印迹分析。B） 和C）从二维培养的单层细胞或三维培养的球形细胞中分离的细胞裂解液中IkBα和IkBε（NF-kappaB抑制剂）的蛋白裂解物分析。D） 增殖标记物Ki-67和凋亡标记物PARP裂解物阵列分析。使用特异性抗体信号与总β-肌动蛋白信号的相对比率进行数据归一化，以便在细胞系、时间点和生长条件之间进行相对定量比较。

侵袭性/星状表型

入侵细胞中确定的核心通路(图7a，表S5和S6系列)与AKT和PI3激酶、整合素、层粘连蛋白、TGFβ、JAK/STAT和干扰素信号、刺猬信号和基质金属蛋白酶（MMP13）最显著相关。与2D条件（p-Ser308和p-Ser473）相比，在大多数肿块和侵袭性疾病中检测到pAKT1水平升高，但在正常球体中未检测到(图6a). 在侵袭性PC-3细胞中，这些蛋白的水平进一步增加。转录因子STAT1和STAT2的表达与干扰素诱导基因如IFITM1（干扰素介导的跨膜蛋白1）、OAS1或IFI27的共同作用表明侵袭细胞中JAK/STAT和干扰素α/β相关信号通路的激活(图7a、b+d)经免疫荧光验证(图7c)由于在强分枝RWPE-1和侵袭性RWPE-2/w99、ALVA31、PC-3或PC-3M细胞中，干扰素相关基因和途径的表达相似，我们假设这些机制在细胞运动中起一般作用。

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图7

PC-3细胞中观察到的动态基因表达变化的功能分析，这些变化与圆形到星形球体的形态转变相关。

A） 主成分分析PCA。箭头突出显示的基因与单层（2D）培养中的PC-3细胞或3D中的圆形（第4+8天）和星状表型（第13+15天）最相关。B） IPA基因网络分析显示侵袭细胞中STAT1/STAT2、干扰素α/β和NFκB信号之间的相互作用（颜色表示表达改变的因素；红色 =  感应，绿色 =  压抑）。C） 星形PC-3球体JAK1和STAT2蛋白表达的免疫染色。STAT2信号在侵袭性结构中最高，JAK1在外周细胞中最高。D） IPA：干扰素γ和α/β信号转导途径示意图，颜色对应基因表达的折叠变化。

靶向AKT、PI3Kinase和mTOR的化合物抑制球形细胞的侵袭

我们开发了小型化3D培养系统，该系统具有良好的显微镜格式（15个实验/板），辅以高含量的活细胞成像系统和定量图像分析软件，用于大规模3D复合物测试。根据IPA、DrugBank和Matador收集了100多种化合物(表S7)基于Ingenuity通路分析建议的特定靶基因或通路/关键信号分子。这些化合物首先针对PC3和PC-3M细胞形成的“星状”球体进行测试，以确定可能特异性阻断侵袭性肿瘤细胞的抑制剂(图8a+b). PC3细胞也在单层培养中处理(图8c). 然后针对更大的3D细胞系，包括非转化的EP156T和RWPE-1细胞，以及非侵袭性DU145、LNCaP和22rV1细胞，进一步测试确定的有效抑制剂(图S5). 靶向PI3-激酶（NU7026，APB2）和AKT通路（deguelin，API-2）的小分子抑制剂最有选择性地抑制侵袭，在2D单层培养中证明效果较差，。同样的抑制剂对正常细胞只有轻微或无影响。相反，大多数靶向mTOR和IGF1R途径的化合物同样抑制侵袭性和非侵袭性球体、3D中的正常细胞或单层培养物中的癌细胞。抑制刺猬信号传导的抑制剂（例如环胺）也抑制正常细胞和癌细胞的生长。相反，靶向NFκB、促炎性趋化因子和受体（IL-1α和CCL2）、TGFβ、p38或p42/44MAP激酶的抑制剂对侵袭细胞和正常细胞始终无效。令人惊讶的是，HDAC抑制剂和抗有丝分裂药物都无效，即使在之前显示的浓度下，单层培养也会导致细胞凋亡[42].

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图8

正常（EP156T）和侵袭性前列腺癌细胞（PC-3）的球体对药物NU7026的典型反应，NU7026是一种针对PI3-激酶的小分子抑制剂。

A） 经NU7027治疗的正常（EP156T）和侵袭性（PC-3）球体的活细胞成像。B） 使用靶向层粘连蛋白β1（绿色）和Alexa488-偶合卵磷脂（F-actin）的抗体，对NU7026处理的EP156T和PC-3球体进行免疫荧光。DAPI用于核染色。药物暴露阻断PC-3球体向星状表型的转化，但不影响正常球体的形成。仅车辆（0.1%二甲基亚砜）作为对照。C） 在单层培养中PC-3细胞对NU7026（72小时）缺乏反应（CTG，Cell Titer Glo分析）。D） 治疗组与未治疗组PC-3球体的大小（面积、总像素数）和附件数（侵袭性结构、像素中位长度）的量化。条形图表示标准误差。

讨论

我们已经确定了Matrigel中大量正常、非转化和前列腺细胞系的生长、分化和全基因组mRNA表达模式，涵盖了所有经典和许多新的PrCa细胞系[43]小型化和成本效益高的3D模型的开发使我们能够通过活细胞和共焦显微镜的结合实时和高分辨率监测前列腺素的生长、成熟、侵袭和运动。这些模型将有助于在3D中实现更高吞吐量的复合屏幕，从而可以定量测量腺泡结构的生长、大小、形状、细胞动力学和形态。最近的研究活动主要集中于干/祖细胞群在球体中的作用[39]，[44]，在中审阅[45]。除极少数例外[46]这些研究是指在非锚定条件下培养的前列腺素，与ECM无任何接触[47]相反，我们的分化相关模型基本上没有干细胞标记物的富集。很明显，lrECM主要支持分化，但我们感到惊讶的是，Matrigel即使在PrCa细胞系中也能启动正常样的上皮分化程序在体外三十多年的文化。这基本上证实了米娜·比塞尔20年前提出的概念，即背景，尤其是肿瘤环境至关重要，可能会有力地推翻[48]恶性基因型。然而，我们的实验数据表明，抑瘤表型也可能只是暂时的。

本研究的具体目的是详细分析正常和前列腺癌细胞的各种不同生长、迁移和侵袭模式，并识别可能特异性阻止侵袭行为的小分子抑制剂。这是首次描述极化上皮球体动态逆转为侵袭性细胞以及与此转化相关的基因共表达网络的研究。虽然细胞侵袭和运动传统上是通过Boyden小室、transwell或二维潜在修复分析进行分析的，但我们的系统提供了一个独特的系统来监测和调节器官型环境中的侵袭过程。球形细胞和侵袭性细胞中改变的基因表达特征证实了AKT和PI3-激酶途径在乳腺或前列腺生长中的重要性[39]，[49]–[51]然而，AKT和PI3K通路被证明对侵袭特别重要：大多数靶向这些通路的药物有效地阻止了侵袭过程，但在2D条件下效果较差，通常对正常细胞的生长和分支影响最小。相反，无论细胞培养条件、ECM和微环境如何，mTOR、IGF1R和JAK/STAT通路似乎对正常细胞和肿瘤细胞的生长、分支和分化都至关重要。JAK/STAT信号的诱导，如许多干扰素诱导蛋白的表达所反映的，可能代表迁移细胞的一般特征，在分支细胞和恶性侵袭细胞中都可以观察到。炎症相关通路[52]似乎与生长或入侵无关。抑制NFκB通路的化合物在很大程度上是无效的，这与成熟球体中核因子κB1、IKKα的表达减少以及核因子kb抑制剂IκBα、IκBε和IκB-ζ增加的观察结果一致。此外，尽管在球体形成中诱导了促炎性化学因子（CCL2、IL-1α、TNFα）的表达，但以相应受体为靶点的化合物证明是无效的。除了MMP13的特异性抑制剂WAY-170523外，大多数抑制细胞周期进展/有丝分裂的药物、p38和p42/44 MAP激酶或基质金属蛋白酶（MMPs）对侵袭也无效[53].

在侵袭性PC-3和PC-3M细胞中观察到的侵袭模式可以最好地描述为流式或链式迁移[23]，[24]只有偶尔单个细胞会自行移动。侵入细胞瞬时形成并分解细胞间接触，同时沿着ECM的共同轨迹移动。整合素如ITGB2、ITGB4和ITGA10、一组胶原蛋白和许多其他细胞外蛋白的同时诱导表明动态细胞基质粘附和附着力在这类侵袭中的重要性。其中一些标记物在高级PrCa中的过度表达可能表明类似的机制和基因也在体内发挥作用。此外，推进迁移细胞可能需要动态肌动蛋白聚合-解聚循环和Rho/Rac介导的细胞突起控制[33]，[54]集体链侵袭与正常细胞分支腺泡形态发生中观察到的片状或管状运动截然不同，这是正常器官发育的标志，通常更具动态性。它也不同于2D文化中常见的变形虫或滑翔运动模式。

层粘连蛋白-5等上皮标记物的再表达[55]侵袭细胞中的紧密连接蛋白Cx43（GJP1）与前列腺的一些先前报道相矛盾[51]乳腺癌和卵巢癌[9]，[56]但这与流式侵袭中细胞间接触的动态形成和消解是一致的。可能需要特定层粘连蛋白来润滑和维护用作通过ECM侵入通道的履带。指导小组，称为“游击小组”，可提供总体方向和指导（参见[57]). 成纤维细胞是否可以作为引导细胞还有待阐明[27]在我们的模型中，引导细胞可以通过在侵袭开始之前形成的尖锐、细长和纺锤状的丝状伪足来识别。

除了上皮标记物在侵袭性细胞中的重新表达外，流式侵袭不被视为经历EMT的间充质细胞或上皮细胞的特征。传统上认为这些细胞以成纤维细胞样的方式迁移为单个细胞。尽管间充质标志物的表达表明EMT基因型，但我们无法确定明确的间充质侵袭相关表型。此外，侵袭性细胞缺乏显著的干细胞相关表达特征[58]并且没有获得CSC的属性（例如CD44+/CD24-）。相反，间充质标志物的表达是许多细胞系的共同特征，与恶性转化或侵袭性无关[59]在分支（RWPE-1）、圆形（DU145）和所有星状细胞（RWPE-2/w99、ALVA31、PC-3、PC-3M）中检测到间充质标记，但在具有显著管腔表型的mass-phenotype球体（例如LNCaP、22rV1）中未检测到间质标记。圆形、早期PC-3和PC-3M球体表达间充质标记物Vimentin和Fibronectin，即使在侵袭性转化后仍保持相同的表达水平。波形蛋白与上皮标记物如细胞角蛋白5和14或E-钙粘蛋白在圆形球体中共表达，其不干扰上皮极化和分化（DU145，PC-3）。β-catenin的核转位和相关Wnt通路的诱导，EMT的另一个特征[60]在侵袭细胞中未观察到。在与EMT相关的经典E-box结合转录因子中，只有TWIST1的表达[61]，[62]ZEB1与细胞株的侵袭潜能相关。这些基因都没有在细胞入侵时被进一步诱导。令人惊讶的是，Slug（SNAI2）的表达在侵袭过程中受到抑制，但在正常球体中强烈表达，这表明其在上皮分化而非EMT中起作用。

EMT作为一种发育机制可能参与正常的发育过程和侵袭性癌症，并且可能代表一个双向过程（EMT与MET）[63]在癌症中，EMT可能只是肿瘤细胞可塑性增加的一个标志，而不是提供侵袭特性的关键机制。经过EMT治疗的Meta-stable和表型灵活的癌细胞仍然能够分化为上皮细胞。这可能与血流中微小转移的存活、成功的组织定植和远处转移的形成特别相关[33]有趣的是，尽管缺乏E-cadherin和alpha-catenin，PC-3细胞仍然能够形成上皮细胞-细胞接触，显然使用的是替代机制，这可能并不局限于该细胞系。进一步研究上皮细胞向侵袭性细胞的动态转化（反之亦然）可能会对这些机制以及EMT的假定作用提供更全面的见解。最近的报告证实了EMT在不同细胞类型的混合片状和链状迁移模式中的可能作用[64]，[65]在我们的体外模型中鉴定的侵袭相关标志物和途径（AKT、PI3激酶、STAT1）的表达将在临床肿瘤样本中进一步研究，重点是高级别、转移和侵袭性癌症。

总之，我们的实验系统有助于研究模拟肿瘤形态学、生物化学和侵袭过程的极化上皮结构或球体在体外.我们和其他人[26]，[28]研究表明，3D中的乳腺和PrCa细胞系在许多与肿瘤细胞生物学相关的问题上具有代表性，但在单层细胞培养中却没有得到很好的解决。这些3D模型对于癌症药物的发现和靶点识别来说是有用的，并且更加可靠，尤其是在相关分析的再现性和量化得到适当解决的情况下。

我们的模型提供相对低成本、高吞吐量在体外用于癌症研究和药物发现的工具，允许实验探索复杂的细胞生物学问题，并可能部分减少或取代异种动物移植模型。因此，3D模型可以作为临床前药物开发管道的中间决策步骤，将用于铅鉴定的大规模高通量化合物筛选与基于异种动物移植的日益昂贵的验证研究联系起来。

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