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.2009年1月9日；284(2):1018-30.
doi:10.1074/jbc。M807823200。 Epub 2008年11月9日。

前列腺癌降钙素-降钙素受体轴促侵袭作用的钙粘附素转换和β-catenin信号激活

吉里什·沙阿 1, 安巴拉根·穆拉利德兰, 米坦·戈库尔甘地, 卡迈尔·索恩, Shibu Thomas公司
附属公司

前列腺癌降钙素-降钙素受体轴促侵袭作用的钙粘附素转换和β-catenin信号激活

吉里什·沙阿等。 生物化学杂志. .

摘要

降钙素是一种神经内分泌肽，其受体位于良性前列腺的基底上皮，但位于恶性前列腺的分泌上皮。降钙素和降钙素受体mRNA的丰度与原发性前列腺癌Gleason分级呈正相关。此外，降钙素通过环腺苷酸依赖性蛋白激酶介导的作用增加多个前列腺癌细胞系的致瘤性和侵袭性。这些作用包括增加基质金属蛋白酶和尿激酶型纤溶酶原激活剂的分泌，增加前列腺癌细胞的侵袭。前列腺癌细胞系中降钙素-降钙素受体自分泌环的激活导致细胞间粘附丧失，紧密连接和粘附连接不稳定，关键的整合膜蛋白内化。此外，降钙素-降钙素受体轴的激活诱导前列腺癌细胞的上皮-间充质转化，其特征是钙粘附素开关和间充质标记物波形蛋白的表达。激活的降钙素受体磷酸化糖原合成酶激酶-3是WNT信号通路中细胞溶质β-连环蛋白降解的关键调节因子。这导致细胞内β-连环蛋白的积累，其在细胞核中的移位，以及β-连环素反应基因的反式激活。这些结果首次确定了降钙素-降钙素受体轴对前列腺癌细胞的作用，这些作用导致细胞-细胞连接不稳定、上皮-间充质转化和WNT/β-catenin信号的激活。结果还表明，环AMP依赖性蛋白激酶在降钙素受体诱导的细胞-细胞连接失稳和WNT-β-catenin信号的激活中起着关键作用。

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数字

图1。
图1。
CT-CTR轴和细胞间粘附。 A中，相位对比度亚流PC细胞系的显微照片（×100）显示细胞细胞的变化CT/CTR表达调控引起的致密化模式。面板a、，空载体转染PC-3M细胞（PC-3M-V）；面板b，计算机断层扫描下调的PC-3M细胞（PC-3M-CT-);面板c，CTR公司下调的PC-3M细胞（PC-3M-CTR-);面板d，PC-3型空载体（PC-3-V）转染细胞；面板e，PC-3细胞强制CTR（PC-3-CTR）；面板f，单元格之间的距离每个细胞系的三个不同克隆a–e表示为单位为nm±S.En个= 20.*,第页< 0.001;双向方差分析（活动CT-CTR轴与非活动CT-CTR轴）。B、，亚流培养物的相衬显微照片（×100）PC-31-CTR细胞急性给予50 n米不同时间的CT时期。用50n个米对于面板a，0分钟；面板b，1小时；和面板c，8小时。地下一层表示平均细胞间距nm每个时间点的±S.En个= 36.*,第页< 0.005; 单向方差分析和Newman-Keuls检验。C、，PC细胞按照“实验程序。”腺泡结构的相位对比图（×100）在第14天被捕。面板a，LNCaP矢量控制（LNCaP-V）；面板b，增强CT表达的LNCaP细胞（LNCaP CT）；面板c，PC-3M病媒控制（PC-3M-V）；面板日期：，CT下调PC-3M细胞（PC-3M-CT-);面板e、，CTR下调PC-3M细胞（PC-3M-CTR-).
图2。
图2。
CT-CTR轴对TER和细胞旁通透性的影响。 A中，PC-3M-V、PC-3M-CTR单层-、PC-3-V和PC-3-CTR让细胞极化，并在3天后测量TER值电镀。结果为平均TER±S.E(n个= 3). 数据为由三个单独的实验汇编而成。*,第页< 0.05与各自的对照组显著不同（单向方差分析和纽曼-凯尔斯试验）。B、，PC-31-CTR细胞单层培养暴露于50 n米电镀后24小时CT。测量了TER值CT治疗后5分钟至8小时。结果为平均TER±S.E。(n个=3）标准化为每个PC-31-CTR细胞的对照单层时间点。数据来自三个单独的实验。*,第页<0.05与各自的对照组显著不同（单向方差分析和Newman-Keuls检验）。C、，极化PC-31-CTR细胞使用载体、CT（50 n米)，m-PKI（100n个米)或m-PKI+CT。在几个时间点测量他们的TER添加药剂后。D、，极化单层培养PC-3M-V、PC-3M-CTR-用50n个米CT 4 h。然后用TRITC-dextran（500μl的1 mg/ml溶液）。1小时后，100μl培养基从下腔提取，并使用分光光度计，530nm激发，590nm发射。*,第页<0.05与各自的对照组显著不同（单向方差分析和Newman-Keuls检验）。E、，极化PC-31-CTR细胞使用载体、CT（50 n米)，m-PKI（100n个米)或m-PKI+CT。通过与试剂孵育1小时后TRITC-提取物的扩散。结果表示为平均值±S.E(n个= 4).*,第页<0.05与对照组有显著差异（单向方差分析和纽曼-凯尔斯测试）。
图3。
图3。
结合蛋白的免疫荧光定位。汇流的允许在Transwell过滤器上生长的PC-31-CTR细胞单层极化4天。然后用50 n米CT用于60分钟，然后在-20°C下用甲醇固定10分钟ZO-1、E-cadherin和β-catenin的免疫荧光染色，拍摄了400张照片。焦点调整到基底外侧飞机。左侧面板目前的车用细胞；和正确的面板用CT处理细胞。
图4。
图4。
结合蛋白定位，免疫印迹。汇流的用细胞溶质裂解缓冲液对PC亚系单层进行30分钟的裂解收集Triton X-100可溶部分。然后细胞在膜中溶解裂解缓冲液以获得Triton X-100不溶性部分。蛋白质印迹分析对于ZO-1，在加载40μg Triton X-100可溶性蛋白和20μg TrionX-100不溶性蛋白质。β-肌动蛋白和α-微管蛋白分别为加载控件。实验被重复了三次。A中，Triton X-100不溶物结合蛋白的Western blot分数。B、，Triton®声波风廓线仪连接蛋白的蛋白质印迹X-100可溶部分。C、，结合蛋白的Western blot急性中毒后Triton X-100不溶性和Triton X-100-可溶性组分用CT刺激PC-31细胞。PC-31-CTR细胞的融合单层受血清饥饿和50n处理米周期为1、4、，和8小时。首先用胞质裂解缓冲液处理细胞30分钟收集细胞溶质部分。然后细胞在膜溶解中被溶解缓冲区。ZO-1、E-cadherin和β-catenin的Western blot分析为在加载40μg细胞溶质蛋白和20μg膜蛋白。α-管蛋白和β-肌动蛋白分别被加载控制。实验被重复了三次。D、，PC细胞系波形蛋白免疫反应的Western blot。汇流的裂解PC亚系的单层并进行SDS-PAGE和Western之后按照“实验程序”中的描述进行印迹分析装载80μg裂解蛋白。α-管蛋白为负荷对照。实验被重复了三次。车道1，LNCaP；车道2，PC-3-CTR；车道3，PC-3M；车道4，PC-3M-CT公司+;车道5，PC-3M-CTR公司-;车道6，PC-3；车道7，PC-3M-CT型-.
图5。
图5。
蛋白质斑点的密度定量 图4.这个在Bio-Read密度计上扫描开发的免疫印迹。数据来自合并三个斑点，并将其表示为平均值±S.En个=三。A中，蛋白质印迹定量图4，一个和B、，以Triton X-100可溶性/Triton的比率表示X-100不溶性水平的ZO-1和β-连环蛋白。B、，定量图4中的蛋白质斑点，一个和B、，以N-钙粘蛋白/E-钙粘蛋白的比率表示。C、，波形蛋白印迹的定量图4D类.
图6。
图6。
肿瘤异种移植物中E-和N-cadherin的免疫荧光。肿瘤中的E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白免疫阳性细胞被鉴定用免疫荧光法检测两组异种移植物。A中，异种移植物PC-3M-V、PC-3M-CTR-检测PC-3-V和PC-3-CTR细胞系E-cadherin和N-cadherin免疫反应（4个切片/异种移植）。六从肿瘤异种移植物上采集400张显微照片（每个标本）四种不同的动物。B、，免疫阳性细胞数量和对每个显微照片中的总细胞（DAPI阳性）进行计数。结果是表示为平均值±S.E(n个= 24).C、，小鼠PC-3M异种移植物用表达扰乱siRNA（SV）或CTR siRNA（CTR-)如早期研究所述(25). 每个的四个部分检测这些异种移植物的E-钙粘蛋白和N-钙粘蛋白免疫反应性。从四个肿瘤异种移植物中采集了6×400张显微照片不同的动物。D、，免疫阳性细胞数和总细胞数对每一张显微照片中的（DAPI阳性）进行计数。结果如下所示平均值±S.E(n个= 24).
图7。
图7。
CT-CTR轴对β-连环蛋白易位的影响。 A中，允许在跨阱过滤器上生长PC-31-CTR细胞的融合单层极化4天。用50 n米CT 8小时，并在-20°C下用甲醇固定10分钟β-catenin免疫染色，在×400处捕获图像。顶部和中间面板显示β-catenin定位在0（0）和8 h用载体处理PC-31-CTR膜(抄送8)，而底部面板显示β-catenin在处理后转位到PC-31-CTR细胞的细胞核带CT 8小时(CT8公司).B、，CT对β-catenin的影响易位。PC-31 CTR细胞的汇合单层缺乏血清然后用50 n处理米持续0、1、4和8小时。首先用细胞溶解缓冲液处理细胞30分钟以收集Triton X-100可溶部分。然后对剩余的细胞进行处理用膜裂解缓冲液得到Triton X-100不溶性缓冲液。核能从四块单独的钢板中提取部分，用CT处理一段时间进行β-catenin的Western blot分析在加载40μg细胞溶质蛋白和20μg细胞膜和核蛋白。α-;微管蛋白、β-肌动蛋白和TATA结合蛋白(TBP（待定）)是膜、细胞质和细胞核的负荷对照分数。实验被重复了三次。C、，CT对TCF/LEF启动子活性的影响。PC-31-CTR细胞为接种到6孔板中并转染pGL3-OT-核糖核酸酶/pRL-TK质粒或pGL3-OF-luciferase/pRL-TK质粒。然后培养细胞在完全培养基中培养48小时，然后将其缺血清16小时然后用不同浓度的CT（0-500）处理细胞n个米)对裂解液进行荧光素酶活性分析。这个结果以相对光单位表示(RLU（RLU）)归一化后具有雷尼利亚荧光素酶活性。实验重复了三次分开的时间。结果表示为平均值±S.E。
图8。
图8。
PKA在CT-刺激TCF/LEF启动子反式激活中的作用活性和GSK3β磷酸化。 A中，PC-31-CTR细胞为接种到6孔板中并转染pGL3-OT-核糖核酸酶和pRL-TK质粒。然后将细胞在完全培养基中培养48小时，之后，将其进行16小时的血清饥饿处理。然后用任一车辆(C)，50牛顿米CT（连续油管）(计算机断层扫描)，PKA抑制剂(R（右）第页)-cAMP公司(Rp-cAMP)（1米米)，或1米米(R（右）第页)-cAMP+50牛顿米计算机断层扫描(计算机断层扫描+Rp-cAMP)对裂解产物进行分析，以确定荧光素酶活性。结果以相对光单位表示(RLU（RLU）)用标准化后雷尼利亚萤光素酶活性。实验被重复了三次。结果表示为平均值±S.E。*,第页<0.05（单向方差分析和纽曼-凯尔斯试验）。B、，等同于一个除了(R（右）第页)-cAMP被另一种特异性PKA抑制剂取代m-PKI（200牛顿米).C、，等同于一个，除(R（右）第页)-cAMP被PKA抑制剂H89（3μ米).D、，CT-模拟PC-3-CTR的条件培养基细胞激活TCF介导的转录。PC-31-CTR细胞接种于6孔板，并用pGL3-OT萤光素酶和pRL-TK质粒转染。然后将细胞在完全培养基中培养48小时，然后将这些细胞与对照细胞进行孵育介质(厘米)或用48小时后采集的条件培养基培养的PC-31-CTR细胞未经或经50 n处理米CT.平均值给出了五个独立实验的折叠诱导。*,第页<0.05（学生）t吨测试。E、，PC-31-CTR细胞用50n处理米CT扫描0、1、2和4小时。细胞溶解已收集。对phopho-GSK-3β进行Western blot分析加载40μg/lane总蛋白后。α-管蛋白用作装载控制。实验被重复了三次。F、，用载体处理PC-31-CTR细胞(C)，50牛顿米计算机断层扫描(计算机断层扫描), 2 μ米移动PKI(公钥基础设施)，和带有2μ米m-PKI+50牛顿米CT（连续油管）(公钥基础设施+计算机断层扫描)用于4h.加载后进行磷酸化GSK-3β的Western blot分析从每个治疗组收集40μg蛋白质。α-微管蛋白用作加载控件。实验分三次重复进行次。
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