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.2010年5月3日；5（5）：e10431。
doi:10.1371/journal.pone.0010431。

前列腺癌生长、侵袭和药物反应研究的三维模型综合面板

哈姆梅村 1, 约翰内斯·维塔宁, 拉米·梅克尔, 安蒂·哈波宁, 约翰·帕特里克·姆平迪, 马蒂亚斯·克努提拉, 佩卡·科霍恩, 约基·洛特宁（Jyrki Lötjönen）, 奥利·卡利奥尼埃米, 马蒂亚斯·尼斯
附属公司

前列腺癌生长、侵袭和药物反应研究的三维模型综合面板

哈姆梅村等。 公共科学图书馆一号. .

摘要

来自正常组织和癌组织的前列腺上皮细胞在三维（3D）培养中生长为球形，是研究正常和癌相关上皮分化模式的有希望的体外模型。我们开发了迄今为止最全面的3D微型前列腺细胞培养模型面板（n=29），包括许多非转化的和目前最可用的经典前列腺癌（PrCa）细胞系。本研究的目的是分析三维PrCa模型的形态发生特性，比较二维和三维培养物的表型、基因表达和代谢，并评估其与临床前药物发现、疾病建模和基础研究的相关性。初级和非转化前列腺上皮细胞，以及一些PrCa系，形成分化良好的圆形球体。这些显示出强烈的细胞-细胞接触、上皮极化、中空腔，并被完整的基底层（BL）覆盖。然而，大多数PrCa线形成了大的、分化差的球体，或侵入性强的结构。在PC-3和PC-3M细胞中，分化良好的球体形成，然后自发转化为高度侵袭性细胞。这些细胞系可能先前经历了上皮-间充质转化（EMT），这种转化被来自细胞外基质（ECM）的信号暂时抑制，有利于上皮成熟。脂质和类固醇代谢的诱导、表观遗传重编程和ECM重塑代表了对3D培养的普遍适应，而与转化和表型无关。相反，PI3-激酶、AKT、STAT/干扰素和整合素信号通路在侵袭性细胞中特别激活。针对PI3-激酶的特定小分子抑制剂在3D中比在2D单层培养或正常细胞生长中更有效地阻止侵袭性细胞生长。我们的细胞模型小组涵盖了广泛的表型可塑性，支持研究不同的细胞迁移模式和肿瘤形态，并将有助于抗癌和抗转移化合物的预测测试。

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数字

图1
图1。3D Matrigel培养中形成的球体的典型相位对比图像。
大多数结构分为圆形、块状、星状或葡萄柚状。一些细胞系在Matrigel中未能形成球形，但作为单个活细胞持续存在长达两周（单个表型）。大多数球状体在接种后第9-10天成像。PC-3球体，在第9天表现为圆形表型，在第13天发生侵袭/星状表型变态。PC-3M在更早的时间点（第5-8天）也会发生同样的情况。
图2
图2。对Matrigel中生长的各种前列腺细胞和细胞系进行相位对比和共焦激光扫描显微镜观察，说明了在几个非转化细胞系中典型观察到的分支表型与仅限于肿瘤细胞的星状/侵袭表型之间的表型差异。
A） RWPE-1细胞形成的分支结构的相位对比图，B）用层粘连蛋白B1抗体染色的RWPE-1形成的腺泡结构。C） 初级前列腺上皮细胞（PrEC）形成的分支或簇状结构。D） ●●●●。PWR-1E细胞形成的混合分枝和大量表型结构。E） 第9天，PC-3细胞形成圆形结构，用钙黄绿素活细胞染色。F） 第13天，圆形球体形态转变为侵入性结构。G） 第13天左右侵袭性PC-3结构的相位对照图像。H） ●●●●。用整合素β1活性形式（ITGB1）特异性抗体对PC-3丝状体进行染色，显示纺锤状细胞结构的致密装饰。
图3
图3。使用抗基底膜成分层粘连蛋白β1（LAMB1）、间充质标记物波形蛋白（VIM）和纤维连接蛋白（FN）的抗体，对在Matrigel中生长9或14天的球体结构进行代表性免疫细胞化学染色。
Alexa488标记的卵磷脂用于检测F-actin，Hoechst染色用于标记细胞核（蓝色）。RWPE1、DU145和PC3细胞显示EMT相关的间充质标记物的表达，与表型无关（PC-3细胞；第9天为圆形，第14天为星状）。
图4
图4。与单层培养相比，在富含层粘连蛋白的ECM（Matrigel）中培养的细胞的mRNA基因表达改变的特征模式（比率3D/2D）。
A） Heatmap，说明了K-means算法生成的12个簇。簇1+2代表仅受正常细胞影响的基因（PrEC，EP156T）。簇6-8表示所有细胞系中对Matrigel 3D中3D细胞培养的反应中类似诱导或抑制的基因，无论表型或转化如何。簇9-12包含星状/侵袭型细胞系（ALVA31、PC3、PC3M、RWPE2/w99）的特征基因，或在圆形结构自发转化为星状结构期间诱导的基因（例如PC3、第13天和第15天）。B） 平均表达变化，说明集群内改变基因表达的中位数（深灰色）和变异（浅灰色）。C） 一组选定基因的QRT-PCR分析（黑色）和Illumina阵列数据（灰色），验证侵袭性PC-3细胞中表达增加。
图5
图5。与2D单层相比，3D培养中改变的基因表达数据的功能分析。
A） 主成分分析（PCA），说明区分圆形、块状和星状形态的基因集。圆形表型细胞包括PrEC、EP156T和RWPE1。肿块表型以LNCaP和22rV1细胞为代表。星形/侵袭性细胞包括ALVA31、PC3、PC3M和RWPE-2/w99。B） 入侵相关集群9-12的灵巧路径分析（IPA）（图4），说明了13个生成的网络中的2个。该网络以AKT和PI3-激酶途径为中心。颜色与圆形和侵入性球体之间观察到的差异表达因子相关（红色：诱导，绿色：抑制）。C） 热图，说明2D和3D培养中层粘连蛋白mRNA表达的改变。层粘连蛋白α5、γ1、β2和α3的表达在PC-3和PC-3M细胞的侵袭性转化中受到强烈诱导（13+15天）。D） 侵袭开始后各种层粘连蛋白的持续表达，如用检测各种α和β亚单位的人类特异性抗体（LAM-89）染色所示。
图6
图6。2D与3D培养中关键信号分子、磷蛋白和转录因子的表达改变。
A） 各种转录因子（AKT1、STAT1、TAT2、IKKα、NFkB1 p50、SMAD3）、雄激素受体（AR）和PCNA的Western blot分析。B） 和C）从二维培养的单层细胞或三维培养的球形细胞中分离的细胞裂解液中IkBα和IkBε（NF-kappaB抑制剂）的蛋白裂解物分析。D） 增殖标记物Ki-67和凋亡标记物PARP裂解物阵列分析。使用特异性抗体信号与总β-肌动蛋白信号的相对比率进行数据归一化，以便在细胞系、时间点和生长条件之间进行相对定量比较。
图7
图7。PC-3细胞中观察到的动态基因表达变化的功能分析，这些变化与圆形到星形球体的形态转变相关。
A） 主成分分析PCA。箭头突出显示的基因与单层（2D）培养中的PC-3细胞或3D中的圆形（第4+8天）和星状表型（第13+15天）最相关。B） IPA基因网络分析显示侵袭细胞中STAT1/STAT2、干扰素α/β和NFκB信号之间的相互作用（颜色表示表达改变的因素；红色 =  感应，绿色 =  压抑）。C） 星形PC-3球体JAK1和STAT2蛋白表达的免疫染色。STAT2信号在侵袭性结构中最高，JAK1在外周细胞中最高。D） IPA：干扰素γ和α/β信号转导途径示意图，颜色对应基因表达的折叠变化。
图8
图8。正常（EP156T）和侵袭性前列腺癌细胞（PC-3）的球体对药物NU7026的典型反应，NU7026是一种针对PI3-激酶的小分子抑制剂。
A） 经NU7027治疗的正常（EP156T）和侵袭性（PC-3）球体的活细胞成像。B） 使用靶向层粘连蛋白β1（绿色）和Alexa488-偶合卵磷脂（F-actin）的抗体，对NU7026处理的EP156T和PC-3球体进行免疫荧光。DAPI用于核染色。药物暴露阻断PC-3球体向星状表型的转化，但不影响正常球体的形成。仅使用载体（0.1%二甲基亚砜）作为对照。C） 在单层培养中PC-3细胞对NU7026（72小时）缺乏反应（CTG，Cell Titer Glo分析）。D） 治疗组与未治疗组PC-3球体的大小（面积、总像素数）和附件数（侵袭性结构、像素中位长度）的量化。条形图表示标准误差。
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