在乳腺癌进展模型中，NF-κB对上皮-间质转化和转移至关重要

TGF-β在EMT期间诱导NF-κB活性。

根据TGF-β信号传导对EpRas细胞EMT的诱导至关重要的观察(19，20)以及TGF-β可以调节某些上皮细胞中NF-κB活性的报道(28)，我们试图测试TGF-β是否能影响EpRas和EpRasXT细胞中的NF-κB活性。为了描述用TGF-β1刺激后NF-κB DNA结合活性的变化，我们在TGF-α1存在的情况下培养EpRas和EpRasXT细胞，并用EMSA监测NF-kb B DNA-结合活性的水平。在EpRas细胞中，我们在30分钟内观察到NF-κB DNA结合活性的3-4倍诱导，而在Ep拉斯特细胞中我们观察到TGF-β无反应（图​（图2A）。2A） ●●●●。EpRasXT细胞的结果并不令人惊讶，因为细胞本身会产生TGF-β。此外，用NF-κB依赖的荧光素酶报告子（3xκB.luc）瞬时转染EpRas和EpRasXT细胞。用TGF-β1刺激EpRas细胞导致在2-8小时内NF-κB转录激活活性增加约2倍（图​（图2B），2B） ，而在EpRasXT细胞中没有发现增加（数据未显示）。因此，TGF-β刺激导致EpRas细胞中功能活性NF-κB的诱导，而不影响EpRasXT细胞中NF-κB活性的增加。

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图2

TGF-β诱导EpRas细胞NF-κB活性。(A类)用TGF-β1（5 ng/ml）刺激EpRas和EpRasXT细胞达指定时间。使用NF-κB特异性探针（上面板）和八聚体特异性探针作为对照，对全细胞提取物（6μg）进行EMSA。(B类)NF-κB转录活性。用3xκB.luc或β-珠蛋白-TATA报告子构建瞬时转染EpRas细胞三次。转染后20小时，用TGF-β1（5 ng/ml）处理细胞达到指定时间。然后，测定提取物的荧光素酶活性，并根据Renilla荧光素酶的表达进行归一化。显示3xκB.luc和β-珠蛋白-TATA的比率。未刺激的空载体感染的EpRas细胞的表达水平被用作参考荧光素酶活性，并被任意设置为1。平均值和标准偏差代表了两个独立的实验，共进行了三次。条形图表示标准偏差。

NF-κB对EMT至关重要。

为了研究IKK／IκBα／NF-κB信号模块在EMT和转移调控中的作用，我们利用逆转录病毒基因转移在EpRas细胞中表达该通路的显性干扰突变体。使用表达反式-显性（TD）IκBα蛋白（TD-IκBβ，其中位于32和36位的丝氨酸残基突变为丙氨酸残基，形成不可降解的阻遏物），是一种组成活性（CA）IKK-2蛋白（CA–IKK-2，其中激活环中的两个丝氨酸残端突变为磷酸谷氨酸残基），或空矢量控制。当逆转录病毒共同作用增强GFP时，免疫荧光显微镜观察到稳定感染的细胞。通过Western blot检测TD-IκBα和CA–IKK-2在φNX产生系细胞和稳定感染的EpRas细胞中的表达（图​（图3，三、A和B）。该分析显示，与内源性蛋白相比，突变蛋白的过度表达很强。如之前在另一个细胞系统中观察到的(29)，高水平外源性TD-IκBα的存在导致内源性IκBβ表达减少，很可能是由于NF-κB活性受到抑制。EMSA分析EpRas细胞中TD-IκBα和CA–IKK-2表达对NF-κB DNA结合活性的影响。在感染TD-IκBα的EpRas细胞中，未观察到NF-κB DNA结合活性，无论细胞是未受刺激还是受TGF-β刺激（图​（图3C），三C） 、TNF-α或PMA（未显示数据）。相比之下，感染CA–IKK-2的细胞在未刺激状态下表现出2到3倍的DNA结合活性（与未刺激的EpRas对照细胞相比），并且与TGF-β处理的EpRas对照细胞相比较，在TGF-α刺激后，NF-κB活性的诱导大约高出2倍。用3xκB.luc瞬时转染这些细胞和随后的荧光素酶检测显示，与未经刺激或TGF-β处理的EpRas对照细胞相比，感染CA–IKK-2的未经处理的Ep Ras细胞的荧光素酶活性诱导为3到4倍，用TGF-，分别是。相反，在用TGF-β治疗前后，表达TD-IκBα的EpRas细胞中NF-κB转录活性几乎被完全抑制（图​（图3D）。三D） ●●●●。此外，对与EMT相关的NF-κB调节的靶基因子集的RT-PCR分析（表​（表1）1) (18)在TGF-β诱导的EMT前后用EpRas突变体进行。该分析表明基质金属蛋白酶-13，MCP-1型、和胆囊收缩素在没有TGF-β的情况下，在CA–IKK-2–表达EpRas细胞中MCP-1型，这甚至与EpRasXT细胞中的表达水平相当），并且在TGF-β的存在下这些基因的表达略强(胆囊收缩素和基质金属蛋白酶-13)而在TD-IκBα表达细胞中，这些基因的表达和TGF-β诱导的上调几乎完全被阻断（图​（图3E）。三E） ●●●●。基于这些结果，NF-κB激活了转化生长因子β诱导的EMT基因程序中的至少一部分基因。

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图3

EpRas细胞中NF-κB活性的调节。(A类和B类)优势干扰突变体在ΦNX产生细胞中的表达水平(A类)和稳定感染的EpRas细胞(B类)通过全细胞提取物的Western blot分析，使用IκBα和IKK特异性抗体CA-IKK-2、内源性IKK-2（与CA–IKK-2结合）、TD-IκBβ和内源性IκBα进行测定。使用p65/RelA特异性抗体评估等负荷(B类，底部面板）。(C类)EMSA使用NF-κB特异探针（上面板）和八聚体特异探针（下面板）作为负载控制，对稳定感染的EpRas突变体的提取物进行分析，这些提取物未经处理（-）或用TGF-β（5 ng/ml）刺激2小时（+）。显示了量化的相对DNA结合水平。(D类)用3xκB.luc或β-珠蛋白TATA报告基因构建体瞬时转染稳定感染的细胞，一式三份。24小时后，用TGF-β（5 ng/ml，持续4小时）处理细胞（+）或不处理细胞（-）。根据Renilla荧光素酶的表达（如图所示​图2B）。2B） ●●●●。显示3xκB.luc和β-珠蛋白-TATA的比率。未刺激空载体转染的EpRas细胞的表达水平用作参考，并任意设置为1。条形图表示标准偏差。(E类)用TGF-β（5 ng/ml）刺激EpRas突变体和EpRasXT细胞达到指定的时间，并进行RT-PCR分析，以检测其转录表达基质金属蛋白酶-13，MCP-1型，胆囊收缩素、和β-肌动蛋白，如方法中所述。C、 控制（水）；空的EpRas细胞感染空载体控制。

然后，我们询问NF-κB活性的这种调节是否影响EpRas细胞进行EMT的能力。在允许上皮极化的多孔支架（过滤器）上，感染空载体（如未感染细胞）的EpRas细胞显示出完全极化的上皮表型，上皮标记物E-cadherin的基底外侧质膜表达，但间充质标记物vimentin不表达（图​（图4，4，A–D）。用TGF-β处理这些EpRas细胞5天后，产生了纺锤形、波形蛋白阳性的细胞链，这些细胞仅弱表达E-钙粘蛋白（图​（图4，4、A、B和D）。在不含TGF-β的TD-IκBα表达细胞中，与EpRas对照细胞相比，未观察到表型变化或标记表达变化（图​（图4，4，A–D）。然而，在用TGF-β治疗后，由于细胞死亡，这些TD-IκBα-过表达且NF-κB活性被阻断的EpRas细胞中有相当一部分迅速从多孔支架上脱落。其余的细胞几乎完全不能进行EMT（图​（图4A）。4A） ●●●●。TGF-β处理的TD-IκBα表达的EpRas细胞缺乏纺锤状间充质细胞链，这些细胞在感染病毒的空EpRas对照培养物中大量存在（图​（图4，4、A和B）。同样的细胞未能上调波形蛋白，并保留了高水平的E-cadherin，E-cadherin部分重新分布到细胞质，这表明极性有所丧失（图​（图4D）。4D） ●●●●。令人惊讶的是，即使在没有TGF-β的情况下，CA–IKK-2–过度表达的EpRas细胞NF-κB活性也能以相当高的速度进行EMT（图​（图4，4、A和B）。细胞在多孔支架上生长6天后，我们观察到梭形E-钙粘蛋白阴性和波形蛋白阳性细胞链，它们覆盖了总表面积的10%以上（图​（图4，4、A、B和D）。当我们通过Western免疫印迹分析这些细胞的大量培养物时，我们观察到E-cadherin水平显著降低（图​（图4C）。4C） ●●●●。与这些观察结果一致，我们注意到TGF-β处理后CA–IKK-2表达细胞的EMT较对照EpRas细胞增强，如胞质（去极化）或无E-cadherin表达的纺锤形细胞百分比更高以及波形蛋白表达强（图​（图4，4、A、B和D）。重要的是，当CA-IKK-2和TD-IκBα转基因导入V12S35Ras细胞时，获得了非常相似的结果。这些细胞代表另一个单基因转化细胞系，该细胞系独立于原始EpH4细胞生成，并由不同致癌Ras的效应突变体转化，该效应突变体诱导ERK/MAPK过度激活，但不诱导PI3K信号(17). 我们观察到TD-IκBα表达细胞中的EMT受到抑制，并且在CA–IKK-2–表达V12S35Ras细胞中没有TGF-β的情况下，自发EMT的发生率相当高，发生频率甚至高于CA–IK-2–表示EpRas细胞（参见补充图1；补充材料可从http://www.jci.org/cgi/content/full/114/4/569/DC1). 因此，NF-κB在EMT调节中的作用并不局限于单个细胞系。

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图4

表达TD-IκBα的EpRas细胞不能进行EMT，而CA–IKK-2的表达在缺乏TGF-β的情况下驱动EMT（多孔支架分析）。表达空载体对照、TD-IκBα或CA–IKK-2的EpRas细胞在有（+）或无（-）TGF-β（5 ng/ml；第2-7天）的多孔支架上培养7天。(A类)显示培养细胞的照片；带有纺锤状间充质细胞的区域用红色虚线表示。原始放大倍数，×100。(B类)量化由间充质干细胞覆盖的多孔支架上的面积，作为相对于粘附细胞覆盖的总面积的百分比（培养物显示为A类; 第6天）。(C类)表达空载体、TD-IκBα或CA–IKK-2且未经TGF-β处理的EpRas细胞中的E-cadherin水平通过E-cadherin-特异性抗体的Western blot分析测定（E-Cad；上面板）。随后用p65/RelA特异性抗体（下面板）剥离和重制印迹，以证明负载量相等。(D类)如图所示，在存在或不存在TGF-β（5 ng/ml；第2-7天）的情况下，将细胞在多孔支撑物上培养7天。如方法所述，用DAPI反染DNA（蓝色）对细胞进行E-cadherin或vimentin免疫染色（红色）。间充质细胞、E-钙粘蛋白阴性细胞和波形蛋白阳性细胞的区域用白色虚线勾勒出来，对应于A类（红色虚线）。原始放大倍数，×400。

用于分析上皮细胞行为和可塑性的更具生理学意义的培养系统是三维无血清I型胶原凝胶培养(15). 在这些培养物中，完全极化的EpRas对照细胞形成管状和肺泡结构，管腔较大（图​（图5A）。5A） ●●●●。这些细胞显示E-cadherin的基底外侧膜（极化）表达，但没有波形蛋白表达（图​（图5C）。5C） ●●●●。添加TGF-β1后，EpRas对照细胞进行EMT，如纺锤形和迁移表型、E-钙粘蛋白丢失和治疗6天后波形蛋白的从头表达所示（图​（图5，5、A和C）。未经处理的TD-IκBα细胞与对照的EpRas细胞相似，它们形成上皮结构（管腔的管状结构），并显示基底侧E-cadherin染色，无波形蛋白表达。尽管存在这种相似性，TD-IκBα上皮结构看起来更紧密，尺寸更小（图​（图5，5、A和C）。用TGF-β治疗后，表达TD-IκBα的EpRas细胞形成的上皮结构保留了E-cadherin的表达（图​（图5C），5C） ，但迅速解体（图​（图5，5、A和C）。只有极少数结构（约0.5%）在分解前形成无序的细胞链（数据未显示）。相反，未经处理的表达CA–IKK-2的细胞NF-κB活性增加，形成了两种结构。而大部分带有管腔的上皮管状结构是明显的（图​（图5A），5A） ，大量结构由无序的细胞链组成，具有纺锤状细胞形态，类似于TGF-β处理的对照EpRas细胞（图​（图5，5、A和B）。有趣的是，在与对照组EpRas细胞相似的上皮结构中（E-cadherin阳性和vimentin阴性），有很大比例的CA–IKK-2表达缺失或下调，如低水平的协同调节GFP表达所示（图​（图5C，5C、 底部）。相反，未经处理的CA–IKK-2表达细胞产生的间充质结构为E-cadherin阴性，表达vimentin，并显示出较强的GFP染色，表明转基因表达较高（图​（图5C）。5C） ●●●●。因此，即使在没有TGF-β的情况下，高水平的CA–IKK-2表达似乎也能促进EMT。正如预期的那样，TGF-β治疗诱导剩余的上皮细胞CA–IKK-2表达的EpRas细胞快速形成间叶结构，表达波形蛋白，但不表达E-cadherin（图​（图5，5、A和C）。我们还确定了强NF-κB激活剂（如TNF-α）是否会诱导EMT。事实上，我们在TNF-α处理的EpRas胶原凝胶培养物中观察到少量表达波形蛋白的间充质结构，即使在没有TGF-β的情况下也是如此（补充图2）。总之，活化的NF-κB通路加上Ras足以引起EMT，而抑制NF-κ的B活性可以阻止EMT，导致胶原蛋白中形成的结构解体。

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图5

EpRas细胞中表达的TD-IκBα可预防EMT，而CA–IKK-2在缺乏TGF-β的情况下可诱导EMT（胶原凝胶分析）。将表达空载体对照、TD-IκBα或CA–IKK-2的EpRas细胞接种到胶原凝胶中，允许其形成结构3-5天，不进行诱导处理（-），或通过添加TGF-β（+）诱导其进行EMT 5-6天。(A类)左柱，不含转化生长因子-β培养7天；中柱，无TGF-β培养5天，加上TGF-α处理（5 ng/ml）1天；右柱，无TGF-β培养5天，加上TGF-？治疗（5 ng/ml）5天。图中显示了具有管腔（黄色箭头）或扩张弦的代表性管状结构以及具有间充质形态的侵袭性细胞束（白色箭头）的照片。原始放大倍数，×100。(B类)间充质结构的量化（参见中的白色箭头A类对于CA–IKK-2，–TGF-β培养），在没有TGF-。下图，n个表示所分析的胶原蛋白凝胶的数量。条形图表示分析单个胶原蛋白凝胶时获得的标准偏差。(C类)对胶原凝胶结构进行染色，以检测上皮标记物E-cadherin（第一和第二列）或间充质标记物vimentin（第三和第四列）。最下面一行，左起第二行（CA–IKK-2–表达细胞，–TGF-β）：E-cadherin染色结构的GFP表达（绿色）。插图，左起的第三个面板，中间一行（TD-IκBα-表达细胞，+TGF-？）：E-钙粘蛋白染色的分解结构。插图，右起的第二个面板，最下面一排：波形蛋白染色结构的GFP表达（绿色）。原始放大倍数，×400。

NF-κB对于保护TGF-β诱导的细胞凋亡和直接促进EMT都是必需的。

先前的实验表明，NF-κB在与Ras联合诱导EMT时，至少可以部分替代TGF-β。接下来，我们讨论了NF-κB抑制与EMT预防相关的机制性后果。由于我们观察到TGF-β治疗后TD-IκBα表达结构的快速分解，我们评估了它们在这些条件下的凋亡反应。允许EpRas对照细胞以及表达TD-IκBα和CA–IKK-2的衍生物在胶原凝胶中形成器官型结构3天。然后用TGF-β诱导他们进行EMT或不治疗。经TGF-β处理的TD-IκBα表达的EpRas结构显示凋亡导致细胞解体，如原位TUNEL染色所示（图​（图6A）。6A） ●●●●。如图所示​图6B，6B、 大约55%的细胞为TUNEL阳性，因此在TGF-β治疗6天后出现凋亡。此外，即使在没有TGF-β的情况下，TD-IκBα细胞与对照EpRas细胞相比，诱导凋亡的能力也略有提高（4.5%对0.6%），这可能解释了胶原凝胶中表达TD-I kbα的细胞形成的上皮结构较小的原因。最后，表达CA–IKK-2的EpRas细胞显示出较低的凋亡水平，与EpRas对照细胞相当。然后我们询问是否观察到表达TD-IκBα的EpRas细胞在接受EMT时失败（图​（图44和​和5）5)这完全是由于抑制了这些细胞中NF-κB的抗凋亡功能。将EpRas对照细胞和表达TD-IκBα的衍生物培养在多孔支架上。用25μM细胞透性caspase抑制剂苄氧羰基-Val-Ala-Asp-氟甲基酮（Z-VAD-FMK）处理表达TD-IκBα的EpRas细胞，强烈抑制这些细胞（在多孔支架和胶原凝胶上）中TGF-β诱导的凋亡；图​图6B），6B） ，达到与EpRas对照细胞相当的水平（数据未显示）。重要的是，用TGF-β刺激4天后，在这些Z-VAD-FMK处理的TD-IκBα表达的EpRas细胞中既没有观察到间充质结构（如TGF-​（图6，6、C和D）。值得注意的是，由于TGF-β治疗后出现大量凋亡细胞，在表达TD-IκBα的EpRas培养物中检测到小面积的不规则结构（数据未显示）。Z-VAD-FMK阻断细胞凋亡时未观察到这些现象。总之，Ras转化的细胞需要NF-κB信号传导，以保护其免受EMT过程中TGF-β诱导的细胞凋亡的影响。此外，NF-κB作为EMT程序的直接调节器发挥着额外的作用，因为阻断凋亡并不能恢复表达TD-Iκβα的EpRas细胞对TGF-β进行EMT反应的能力。

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图6

抑制EpRas细胞中的NF-κB活性可导致细胞凋亡并防止EMT。(A类)将表达空载体对照、TD-IκBα或CA–IKK-2的EpRas细胞接种到胶原凝胶中，让其形成结构3天，并用TGF-β治疗6天或不治疗。胶原培养物进行原位TUNEL染色（红色）和DAPI染色（蓝色，表示活细胞）。图中还显示了TUNEL染色前拍摄的同一实验胶原蛋白凝胶的光学显微镜图像。箭头表示TUNEL阳性核。插图，右中面板：另一个具有TUNEL阳性核的结构。原始放大倍数，×200。(B类)根据胶原凝胶结构定量TUNEL阳性细胞A类在三到六个随机选择的区域中，对至少300个细胞的细胞核进行TUNEL染色。使用2到3个胶原蛋白凝胶的平均值计算凋亡指数和标准偏差。在2–3个胶原凝胶（每个凝胶至少300个细胞）中评估的每种细胞类型的凋亡细胞平均百分比显示在条形图上。(C类)表达空载体对照或TD-IκBα的EpRas细胞在有或无25μM Z-VAD-FMK（Z-VAD；第0-5天）和/或TGF-β（5 ng/ml；第1-5天）的多孔支架上培养5天。间充质链覆盖的多孔支架上面积的量化显示为与粘附细胞覆盖的总面积的百分比（在第4天，经过或不经过TGF-β治疗3天后）。(D类)在有或无TGF-β（5 ng/ml；第1-5天）的情况下，在多孔支架上培养所示细胞（有或无25μM Z-VAD-FMK；第0-5天）5天。在多孔支持物上培养5天后，对细胞进行E-钙粘蛋白或波形蛋白（红色）的免疫染色加上DNA（蓝色）的DAPI复染。原始放大倍数，×400。

抑制间充质EpRasXT细胞NF-κB活性可导致EMT逆转。

接下来，我们研究了NF-κB活性的干扰是否也会影响已完成EMT的间充质EpRasXT细胞。EpRasXT细胞再次被表达TD-IκBα或CA–IKK-2的逆转录病毒或GFP-空对照载体稳定感染。通过Western blot分析评估的转基因表达如图所示​图7A。7A.EMSA在未经治疗和TNF-α或PMA刺激的表达TD-IκBα的EpRasXT细胞中显示出NF-κB DNA结合活性的完全抑制。在未经处理的细胞中，CA–IKK-2的表达仅导致NF-κB活性中度（不到2倍）增强（图​（图7B）。7B） ●●●●。用3xκB.luc瞬时转染和随后的荧光素酶检测显示，在表达TD-IκBα的EpRasXT细胞中，NF-κB反式激活活性被强烈阻断，而感染CA–IKK-2的EpRasXT细胞的荧光素酶活性中度增加。

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图7

逆转录病毒表达的TD-IκBα和CA–IKK-2对EpRasXT细胞NF-κB活性的影响。(A类)在稳定感染的EpRasXT细胞中，通过使用IκBα-和IKK特异性抗体对全细胞提取物进行Western blot分析，确定显性干扰突变体与内源性表达野生型突变体的表达水平。显示了CA–IKK-2/内源性IKK-2（整合）、TD-IκBα和内源性IκBβ的蛋白带。通过剥离和重制带有p65/RelA抗体的印迹来评估平均负荷（底部面板）。(B类)未对稳定感染的EpRasXT细胞进行治疗（对照），或用TNF-α（TNF；40 ng/ml）刺激1小时，或用PMA（50 ng/ml）刺激1个小时。然后，用NF-κB特异性探针（上图）或Sp-1特异性探针（下图）作为负载对照来评估NF-κB DNA结合活性。(C类)中描述的EpRasXT衍生物中的NF-κB转录活性A类和B类通过荧光素酶分析测定，如图所示​图3D。三D.空载体转染的EpRasXT细胞的表达水平用作参考荧光素酶活性，并任意设置为1。平均值显示在条形图上方。

为了测试TD-IκBα是否能够逆转EMT，我们在多孔支架上培养表达TD-I激酶Bα、CA–IKK-2或对照载体的EpRasXT细胞。正如预期的那样，表达CA–IKK-2–和对照载体–的EpRasXT细胞显示出间充质、纺锤状表型，并表达高水平的波形蛋白，但没有E-cadherin（图​（图8，8、A和B）。然而，有趣的是，大量TD-IκBα表达细胞恢复到上皮表型，其中细胞形成紧密结构，在质膜上恢复了显著的E-cadherin表达，并且几乎完全失去了波形蛋白的表达，如免疫荧光所示（图​（图8A）8A） 和Western blot分析（图​（图8B）。8B） ●●●●。在不同培养条件下获得了类似的结果（数据未显示）。表达TD-ⅠκBα的EpRasXT细胞在多孔支架上培养时没有明显的细胞死亡迹象（例如，细胞核浓缩、细胞解体和从多孔支架上脱落）。膜联蛋白V染色（图​（图8C）8C） 以及TD-IκBα表达的EpRasXT细胞的细胞周期分析（数据未显示），这些细胞已恢复为上皮表型，表明恢复的上皮细胞仍然存活且健康。这些结果表明，NF-κB活性是维持经历EMT的Ras转化细胞的间充质表型所必需的。

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图8

抑制间充质EpRasXT细胞NF-κB活性可导致EMT逆转。表达空载体对照、TD-IκBα或CA–IKK-2的EpRasXT细胞在多孔支架上培养6天。(A类)对细胞进行E-钙粘蛋白（红色；左栏）或波形蛋白（红色；右栏）的免疫染色，并对DNA进行复染（蓝色；在顶部和中间面板中省略，右栏）。原始放大倍数，×200。(B类)用E-钙粘蛋白和波形蛋白特异性抗体分别通过Western blot分析测定E-钙黏蛋白和波状蛋白水平。随后用p65/RelA特异性抗体剥离和重制印迹，以显示相等的负载（底部面板）。(C类)感染TD-IκBα表达病毒或对照病毒的EpRasXT细胞生长在多孔支架上，以使TD-I k Bα细胞中的EMT逆转。通过annexin V染色和FACS分析鉴定凋亡细胞。

NF-κB是肿瘤进展的不同方面所必需的。

我们观察到NF-κB的抗凋亡作用在晚期肿瘤发生（EMT）中起着关键作用，这与文献中的许多报道一致。事实上，NF-κB正向调节过多的抗凋亡基因(30)在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌和卵巢癌以及某些形式的白血病和淋巴瘤中发现了构成性NF-κB活性（参考文献。2). 许多人类肿瘤衍生细胞系（包括霍奇金病的恶性Reed-Sternberg细胞）中NF-κB的抑制可诱导自发凋亡和/或使细胞对TNF-α或抗癌药物的杀伤敏感(30). 一些研究表明，抑制NF-κB导致肿瘤细胞对癌症治疗的敏感性增加，即诱导凋亡。例如，在小鼠异种移植模型中，将重组TD-IκBα传递到化疗耐药肿瘤，通过使其对拓扑异构酶I抑制剂CPT-11的化疗治疗敏感，从而诱导肿瘤退化(31，32). 我们的结果清楚地确立了NF-κB作为EMT基因程序的重要调节器的关键作用，该调节器超越了其在细胞凋亡保护中的既定功能。这是基于几条证据。首先，NF-κB的激活足以在相当比例的上皮性EpRas细胞中诱导EMT。其次，NF-κB的抑制导致EMT的阻断（在有效抑制细胞凋亡的条件下）。第三，NF-κB是TGF-β诱导基因程序中内源性基因子集激活的关键因素。最后，NF-κB阻断可以部分逆转EMT，从而产生存活的健康上皮细胞。

在这里，我们首次证明，据我们所知，NF-κB在Ras转化的乳腺上皮细胞EMT的诱导和维持中发挥因果作用，介导侵袭/转移肿瘤表型。这些发现为NF-κB在晚期乳腺肿瘤发生和转移中的作用提供了机制上的见解。我们分别观察到未刺激的EpRas和EpRasXT细胞中NF-κB的基线活性可检测到或进一步升高，这与证明乳腺癌中NF-κB因子组成型激活的报道一致(33，34). 抑制诱导人乳腺癌细胞凋亡的NF-κB活性(34)或导致致瘤性降低(35). 此外，小鼠乳腺肿瘤病毒c-rel公司–转基因小鼠发生不同组织学的迟发性乳腺肿瘤(36). 有趣的是，Romieu Mourez等人在研究中发现的一些肿瘤是梭形细胞癌，这是一种可能由EMT产生的肿瘤类型(12，22).

最近的研究表明，NF-κB调节参与肿瘤扩散和转移的多个基因的表达，包括编码MMPs、，白介素-8，血管内皮生长因子、和CXCR4系列(37，38). 我们已经报道了在EpRas细胞EMT期间诱导的几个NF-κB靶基因，如编码各种MMPs和组织蛋白酶家族成员、趋化因子/细胞因子、tenascin-C等（见表​表11和图​图3E），三E） ，可能有助于我们在研究中观察到的NF-κB依赖性转移能力。在人前列腺癌细胞中也有报道通过阻断NF-κB活性抑制转移(37)，在人类黑色素瘤细胞中(39)和在小鼠肺泡癌细胞中(40). 总之，我们的工作和其他人的工作清楚地表明了NF-κB信号在多肿瘤模型系统中肿瘤进展和转移的重要性。然而，值得注意的是，虽然NF-κB在许多细胞类型中有助于肿瘤发生，但其在角质形成细胞中的IκBα介导的抑制最近被证明是Ras介导诱导类似鳞状细胞癌的侵袭性表皮肿瘤所必需的(41). 然而，TGF-β信号通路在致瘤性Ras/IκBα肿瘤中的作用尚未得到研究。

用φNX产生细胞上清液逆转录病毒感染EpRas和EpRasXT细胞。

如前所述，EpRas和EpRasXT细胞被表达显性干扰突变体的亲本载体或逆转录病毒感染(29). 简言之，在感染前24小时，将EpRas和EpRasXT细胞接种在6孔板中，密度为2×105个细胞/孔，将φNX细胞接种在密度为3×106个细胞/10-cm的板中。对于感染，获取φNX细胞上清液，并通过0.45μm过滤器过滤，并向滤液中添加5μg/ml聚brene（Sigma-Aldrich，St.Louis，Missouri，USA）。此后，从EpRas和EpRasXT细胞中取出培养基，并用含有逆转录病毒的φNX细胞上清液替换。培养板在750℃下离心克2h后，去除上清液并用培养基替换。然后，48小时后，通过荧光显微镜（Improvision，Heidelberg，Germany）监测感染效率，并用浓度为1500μg/ml（EpRas）和1700μg/ml的zeocin筛选感染细胞。

NF-κB分析。

如前所述，进行了用于监测显性干扰NF-κB突变体的蛋白质表达水平的Western免疫印迹分析(29)使用针对IκBα（sc-371；圣克鲁斯生物技术，美国加利福尼亚州圣克鲁斯）、IKK-2（sc-7607；圣克鲁兹生物技术）和RelA（sc-372；圣克鲁茨生物技术）的抗体。

用EMSA测定NF-κB DNA结合活性。采用“冻融”方法制备全细胞提取物，并按照前面所述进行EMSA(29). 在所有情况下，将全细胞提取物与含有Igκ增强子共识NF-κB位点、八聚体特异性位点（5′-ATGCAAAAT-3′）或Sp-1特异性位点（5’-ATCGATCGGGGGCGAG-3′）的放射性标记双链寡核苷酸在室温下孵育20分钟，然后通过天然4%聚丙烯酰胺凝胶电泳从游离寡核苷酸中分离出形成的DNA蛋白复合物。

通过稳定转染EpRas和EpRasXT亲本和逆转录病毒转染的克隆以及3xκB荧光素酶报告子（3x kb B.luc）和β-珠蛋白-TATA，以及随后的荧光素素酶活性测定，测量NF-κB反式激活活性的调节。简而言之，在单纯疱疹病毒胸苷激酶启动子的控制下，用10μg 3xκB.luc报告质粒和100 ng胸苷激酶Renilla荧光素酶报告子转染细胞。通过在无血清培养基中以1:2.5的比例（lipofectamine 2000；Invitrogen，Carlsbad，California，USA）将DNA和脂质体混合物培养细胞4小时，进行转染。在开始转染后的20–28小时，用Lumat LB 9507光度计（德国巴德·威尔德巴德Berthold Technologies）测定荧光素酶活性。

半定量RT-PCR。

如前所述提取总RNA并进行半定量RT-PCR(29). 鼠标基质金属蛋白酶-13用引物5′-CACTCCAAGGACCAGGCCC-3′（正）和5′-GCTGAGGGGCAGGCCAGAA-3′（反义；28个周期）扩增；鼠标MCP-1型用引物5′-CGGCTGGAGCATCCACGTGTG-3′（正）和5′-GTCTGACTCCTTCTTGGG-3′扩增（反义；28个周期）；鼠标胆囊收缩素用引物5′-CGCAGCCGGTCCCTGCAGAA-3′（正）和5′-CACATCCCATAGTCCCGG-3′（反义；28个周期）扩增；和小鼠β-肌动蛋白用引物5′-GGTCAGAGACTCCTATGTG-3′（正义）和5′-AGAGCAACATAGCAGCTTC-3′（反义；28个周期）扩增。

在多孔支持物上生长的细胞的标记分析。

细胞接种在多孔支架上（细胞培养插入物；孔径为0.4μm；BD，加利福尼亚州圣何塞，美国），EpRas细胞密度为0.5×105个细胞/孔，Ep拉斯特细胞密度为1×105个/孔。在一些实验中，以指定的浓度培养细胞（见图​图6C）6C） 广谱半胱天冬酶抑制剂Z-VAD-FMK（美国明尼苏达州明尼阿波利斯研发系统公司）。每隔一天，每次更换培养基时都会提供新鲜抑制剂。细胞培养5-7天，然后对其中一个细胞进行免疫荧光染色（参考文献中详细描述）。17)用多克隆兔抗E-钙粘蛋白（610182；1:500稀释；BD）、单克隆抗鼠波形蛋白（Vim-13.4；V-2258；1:500；Sigma-Aldrich）和Cy3-结合驴抗鼠IgG作为二级抗体（1:1000稀释；Jackson ImmunoResearch Laboratories），或在含有20 mM HEPES、25%甘油、，0.42 M氯化钠，1.5 mM氯化镁₂和0.2 mM EDTA，并使用E-cadherin、vimentin和RelA特异性抗体进行Western免疫印迹分析（如上所述）。免疫荧光染色采用DAPI（0.1 ng/ml）进行核复染。使用Metamorph软件（EpRas cells；Universal Imaging Corp.，Philadelphia，Pennsylvania，USA）在蔡司Axioplan 2（美国纽约州桑伍德蔡司）上使用MicroMAX相机（美国新泽西州特伦顿Roper Scientific）或荧光显微镜（Improvision）采集数字图像使用OpenLab 3.0.2和3.0.3软件（EpRasXT单元；Improvision）。

胶原蛋白凝胶培养、标记物分析和凋亡检测。

如前所述，对EpRas细胞及其衍生物进行无血清三维培养(17，19). 2-5天后将TGF-β1（5 ng/ml；R&D Systems）添加到培养物中，然后每隔一天与新鲜培养基一起提供，共5-7天。如Janda等人所述，进行原位免疫荧光分析以分析E-cadherin和vimentin表达的三维结构(17). 使用以下抗体：多克隆兔抗E-钙粘蛋白（610182；1:500稀释；BD）、单克隆抗小鼠波形蛋白（Vim-13.4；V-2258；1:500稀释；Sigma-Aldrich）和Cy3-缀合的山羊抗小鼠IgG作为第二抗体（1:3000稀释；Jackson ImmunoResearch Laboratories）。在所有情况下，DAPI（0.1 ng/ml）用于核复染。

对于TUNEL分析，根据制造商的说明，将胶原蛋白凝胶固定在PBS中4%的多聚甲醛中，用PBS洗涤三次，并用原位细胞死亡检测试剂盒TMR红（2156792；美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏诊断公司）对凋亡细胞核进行染色。DAPI（0.1 ng/ml）用于核复染。

使用Micromorph软件，在蔡司Axioplan 2上使用MicroMAX相机采集免疫荧光染色和TUNEL染色胶原凝胶的数字图像。为了量化TUNEL分析，对每个胶原凝胶中至少三个区域的300多个细胞进行计数，并从两个胶原凝胶中测定平均凋亡指数。

膜联蛋白V染色。

表达TD-IκBα或空载体的XT细胞在孔径为0.4μm（BD）的细胞培养插入物上生长4天。细胞从滤纸上刮下，在冰镇PBS中洗涤两次，然后以1×106个细胞/ml的密度重新悬浮在结合缓冲液（BD）中。然后，用5μl藻红蛋白结合的膜联蛋白V（BD。

我们感谢M.Jechlinger提供EpRas和EpRasXT细胞；B.Anic和G.Litos提供了出色的技术援助；K.Stangl和P.Garin-Chesa为组织学提供帮助；分子病理研究所生物光学系支持免疫荧光显微镜；以及K.Scharffetter-Kochanek、P.Petzlbauer、C.Hoeller、S.Maschler和M.Herlyn的科学讨论和有用评论。这项工作的部分资金来自奥地利基因组研究（GEN-AU）项目（M.A.Huber）和德国科学基金会（DFG SFB497/B1 to B.Baumann；SFB451/A9 to T.Wirth）。