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分子生物学细胞。2008年11月；19(11): 4651–4659.
数字对象标识：10.1091/桶。E08-03-0312号
预防性维修识别码：PMC2575160型
PMID：18768752

一个Atg4B突变体阻碍LC3副产物的脂质氧化并导致自噬体闭合缺陷

藤田直男，*† Mitsuko Hayashi-Nishino公司，‡§ 福本裕美，* 大本弘子，* 山本秋树，‡ 野田毅，*和吉森田松（Tamotsu Yoshimori）通讯作者*‖
苏雷什·苏布拉马尼，监控编辑器
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摘要

在自噬过程中，一种泛素样分子LC3/Atg8与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，并与形成自噬体相关。在哺乳动物细胞中，多个Atg8同源物（称为LC3副产物）的存在阻碍了LC3副物脂质化的遗传分析。在这里，我们表明Atg4B（一种处理前LC3副logue的蛋白酶）的非活性突变体的过度表达抑制LC3副Logue的自噬降解和脂质氧化。抑制作用是由游离LC3副产物在与Atg4B突变体的稳定复合物中的隔离引起的。在突变过表达细胞中，Atg5-和ULK1-阳性中间自噬结构积累。这些膜结构的长度与对照细胞相当；然而，有相当一部分人没有被关闭。这些结果表明，LC3副产物的脂质化参与了哺乳动物细胞自噬体形成的完成。这项研究也为今后各种各样的自噬研究提供了强有力的工具。

简介

大细胞自噬，这里称为自噬。它是一种细胞内过程，其中细胞溶质和细胞器被隔离在双膜结合结构中，称为自吞噬体，自噬体将其内容物输送到溶酶体/液泡中进行降解。除了自噬作为饥饿反应在细胞内物质循环中的生理作用外，越来越多的证据表明自噬参与其他细胞过程，包括细胞分化、组织重塑、生长控制、对不利环境的适应和细胞免疫(Cuervo，2004年；莱文和克林斯基，2004年；水岛，2007年；吉森，2004). 自噬体的形成方式与其他膜运输过程中的囊泡形成不同，如内吞作用和分泌途径(野田佳彦等。, 2002). 在自噬过程中，一个扁平的膜囊，即哺乳动物中的所谓隔离膜，从头生成，伸长并包围货物形成自噬体。

LC3（哺乳动物Atg8同源物）蛋白是一种参与自噬的泛素样分子。合成后，前体LC3的C末端22残基立即被蛋白酶Atg4去除，生成LC3-I形式。LC3-I/Atg8的C末端羧基通过酰胺键与磷脂酰乙醇胺（PE）的头部胺结合，通过一系列泛素化反应，涉及E1（Atg7），E2（Atg3）和E3（蛋白质复合物，包括Atg5、Atg12和Atg16L；市村真一等。, 2000；花田等。, 2007；葛田等。, 2008). LC3（LC3-II）和Atg8-PE的脂化形式与自噬体膜有关(卡贝亚等。, 2000；基里萨科等。, 2000). LC3的脂化过程是可逆的，因为Atg4蛋白酶也可以催化LC3/Atg8的反向修饰反应，称为去脂化(卡贝亚等。, 2004；基里萨科等。, 2000). 事实上，大多数LC3/Atg8在自噬的最后阶段（即自噬体和溶酶体之间的融合）或之前从膜中释放出来(木村等。, 2007；基里萨科等。, 1999).

在酵母中，Atg8被认为具有扩张自噬体膜的功能(中川县等。, 2007；谢等。, 2008). Atg8-PE可导致体外小泡的半融合，这一特性可能与自噬体形成的膜膨胀步骤有关(中川县等。, 2007). 在哺乳动物中，包括LC3、LC3A、LC3B、GABARAP、GATE16和Atg8L在内的多种Atg8同源物（称为LC3副logue）的存在阻碍了LC3副Logue脂质化的遗传分析(谷多等。, 2006；吴等。, 2006).

在哺乳动物细胞中，已经报道了四种Atg4同源物：Atg4A/自噬素-2、Atg4B/自噬素-1、Atg4 C/自噬蛋白-3和自噬蛋白-4(马里诺等。, 2003). 其中，Atg4B对LC3副录具有广泛的特异性(赫梅拉尔等。, 2003；卡贝亚等。, 2004；谷多等。, 2004). 人类Atg4B是一种半胱氨酸蛋白酶，其活性催化三联体由Cys74、His280和Asp278组成(苏加瓦拉等。, 2005；库马诺米杜等。, 2006).

在这里，我们发现蛋白酶活性缺陷型Atg4B突变体的过度表达强烈抑制自噬体的形成。通过机理分析，我们表明过量的非活性Atg4B阻断LC3副产物的脂质化，从而抑制自噬。我们相信这项研究不仅证明了LC3副基因在自噬中的作用，而且还为抑制自噬提供了一个强有力的工具，这将在未来的广泛研究中发挥作用。

材料和方法

试剂和抗体

细胞培养试剂购自Invitrogen（Carlsbad，CA）。使用了以下抗体：兔多克隆抗鼠LC3(卡贝亚等。, 2000); 抗人Atg5(水岛等。, 2001); 抗鼠Atg16L(水岛等。, 2003); 抗p62抗体（宾夕法尼亚州普利茅斯会议BIOMOL研究实验室）；反GABARAP（MBL，日本名古屋）；反GATE16（MBL）；抗单体红色荧光蛋白，与草莓（MBL）反应；小鼠单克隆抗GFP（克隆7.1和13.1；印第安纳波利斯罗氏）；抗c-myc（克隆9E10；Gentaur Molecular Products，日本神户）；抗α-微管蛋白（克隆B5-1-2；西格玛，密苏里州圣路易斯）。Wortmannin（Calbiochem，La Jolla，CA）在Me中制备为100μM储备2所有其他试剂均购自Sigma-Aldrich。

DNA工程、重组腺病毒和重组逆转录病毒

编码单体红色荧光蛋白（mStrawberry）的质粒是Roger Y.Tsien博士（加利福尼亚大学圣地亚哥分校；沙纳等。, 2004). 绿色荧光蛋白（GFP）-LC3、Myc-LC3-HA（血凝素）、Myc-LC3的表达载体G120A型-HA和mStrawberry之前已有描述(卡贝亚等。, 2000；水岛等。, 2001；木村等。, 2007). 构建mStrawberry-Atg4BC74A号质粒，从小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）基因组DNA中克隆Atg4B cDNA，并使用工程BamHI和KpnI位点插入pmStrawberry-C1；点突变（C74A或C74S）是使用QuikChange定点突变系统（Stratagene，La Jolla，CA）引入的。为了构建抗人LC3 shRNA-plasmid，我们合成并退火了两个寡核苷酸，5′-GATCCGCTGAGATCGATCAGAGATACTGACTGATCGATCGACGATCGATCTCAGTTTGGAAAA-3′和5′-AGCTT TTCCAAAAACTGAGATCAGTTCTCTCGAAATGAACTGATCG ATCTCAGCG-3′，并且在BamHI/HindIII位点将双链片段亚克隆到pRNA-H1/neo载体（GenScript，Piscataway，NJ）中。为了生产重组腺病毒，与mStrawberry、mStrawberry-tagged-Atg4B相对应的cDNA重量，-Atg4BC74A号，或-Atg4BC74S公司亚克隆入pENTR 1A质粒（Invitrogen）。通过使用LR克隆酶的Gateway系统（Invitrogen）将pENTR-1A中的cDNA插入物转移到pAd/CMV/V5-EST载体（Invitrogen）。根据制造商的说明，使用ViraPower腺病毒表达系统（Invitrogen）制备重组腺病毒。pMRX-IRES-puro和pMRX-IR ES-bsr由S.Yamaoka博士（日本东京医学和牙科大学）捐赠；Saitoh公司等。, 2003). 为了生产重组逆转录病毒，与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）-LC3、EGFP-Atg5或mStrawberry-Atg4B相对应的cDNAC74A号转移到pMRX-IRES-puro或pMRX-IR ES-bsr。如前所述制备重组逆转录病毒(Saitoh公司等。, 2003).

细胞培养、质粒转染和腺病毒感染

Plat-E细胞由T.Kitamura博士（东京大学；森田等。, 2000). MCF7、293A、NIH3T3和Plat-E细胞在补充有10%胎牛血清（2 mM）的DMEM中生长我-谷氨酰胺和适当的抗生素237°C培养箱。为了达到营养目标，细胞在Hanks平衡盐溶液（HBSS；Invitrogen）中培养1或2小时。根据制造商的方案，使用LipofectAMINE 2000试剂（Invitrogen）进行瞬时转染。在含有500μg/ml G418、1μg/ml嘌呤霉素或10μg/ml蓝菌素的生长培养基中选择稳定的转化子。腺病毒感染情况如下：感染前一天，～2×105将细胞置于六孔板中，并在37°C的CO中培养过夜2孵化器。将培养基替换为含有重组腺病毒的1.5 ml培养基。培养16h后，用1.5 ml培养基替换含有腺病毒的培养基。在额外培养24小时后，将细胞用于实验。

西方印迹法

用冰镇PBS冲洗细胞，刮取细胞，并在4°C下离心收集。细胞在含有2%Triton X-100、1 mM苯甲基磺酰氟和蛋白酶抑制剂混合物（Roche；苏等。, 2006). 细胞裂解物在15000×克在4°C下持续15分钟，收集上清液。样品通过SDS-PAGE分离并转移至聚偏二氟乙烯膜。用0.1%吐温20/TBS中的1%脱脂牛奶封闭膜，并用一级抗体孵育。使用辣根过氧化物酶结合二级抗体（The Jackson Laboratory，Bar Harbor，ME）和鲁米诺溶液（1.25 mM鲁米诺，65 mM Tris-HCl，pH 8.0，0.2 mM香豆酸和0.01%H）检测免疫反应带2O（运行）2).

荧光显微镜

在盖玻片上培养的细胞用4%的多聚甲醛固定在PBS中。样品在荧光激光扫描共聚焦显微镜、FV1000（日本东京奥林巴斯）或配备汞灯和冷却电荷耦合器件相机的奥林巴斯IX81显微镜（Cool Snap HQ；亚利桑那州图森市Roper Scientific）下进行检查，在SlideBook软件（Intelligent Imaging Innovations，Denver，CO）的控制下。

凝胶过滤

如前所述进行凝胶过滤分析(水岛等。, 2003). 简单地说，293A细胞在均质缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl和蛋白酶抑制剂鸡尾酒；罗氏）中通过1 ml注射器和23号针头重复传代（～15次）进行均质。匀浆以10000×离心克持续10min，上清液进一步以100000×克持续60分钟。在Superose 6色谱柱（威斯康星州沃基沙市GE Healthcare）上通过尺寸排除色谱分离所得上清液（胞浆部分）。

散装蛋白质降解试验

细胞接种在24孔培养皿中并培养过夜。第二天，将细胞换成含有14C-缬氨酸（1.5μCi/ml）并孵育过夜。将细胞交换到chase培养基中（补充有10%FBS和10 mM未标记缬氨酸的DMEM），并进一步孵育4 h，以去除短命蛋白的贡献。追逐期结束后，将细胞交换到含有10mM缬氨酸的生长培养基或含有10mM戊氨酸的HBSS中以诱导自噬。培养2小时后，收集培养基，并通过闪烁计数分析三氯乙酸（TCA）可溶部分。在冰镇RIPA缓冲液（25 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.1%SDS，1%Triton X-100，1%脱氧胆酸盐，5 mM EDTA，蛋白酶抑制剂鸡尾酒）中溶解细胞；（罗氏）分离TCA不溶部分并通过闪烁计数进行分析。为了确定长期蛋白质降解的速率，将培养基中TCA可溶部分的计数除以细胞中等效的TCA不可溶计数。

电子显微镜

如前所述进行常规电子显微镜检查(吉森等。, 2000)除NIH 3T3细胞用1%OsO后固定外41%K4铁（CN）6和0.1M磷酸盐缓冲液，pH 7.4，持续1小时。如前所述，还进行了使用金增强方法的免疫电子显微镜检查(罗等。, 2006).

统计

图中所示的所有值均用SD表示。统计显著性（p值）由学生的t吨测试。

结果

Atg4B过度表达抑制自噬通量与其催化活性无关

据报道，处理LC3副产物的蛋白酶Atg4B的过度表达会对LC3的膜定位和PE结合产生负面影响(谷多等。, 2004). 在我们的实验系统中，Atg4B过度表达后未观察到GFP-LC3点(图1A） ●●●●。这种负面影响的一个可能机制是过量的Atg4B有效地将LC3与PE解偶联，并减少膜定位的LC3。为了验证这一假设，无活性的Atg4B突变体（Atg4BC74A号或Atg4BC74S公司)由于催化半胱氨酸残基（Cys74）突变而缺乏蛋白酶活性的蛋白过度表达。出乎意料的是，这两个突变体在LC3的膜靶向和PE结合方面表现出与野生型Atg4B相似的效果(图1，A和B），表明负效应与去共轭活动无关。

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表达Atg4B的细胞C74A号表现出自噬降解受阻。（A） 稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞被携带mStrawberry（Mock）、mStrawberry-Atg4B的腺病毒感染重量（WT）或mStrawberry-Atg4BC74A号（C74A）并孵育40 h。然后将细胞在HBSS中培养2 h，固定，并使用荧光显微镜进行观察。棒材，10μm。（B） 用携带GFP（−）、3x标记的野生型Atg4B（WT）、Atg4B的腺病毒感染PC12细胞C74A号（CA）或Atg4BC74S公司（CS）。细胞在生长或饥饿培养基中培养，用每种抗体通过Western blotting检测裂解产物。顶部面板，防旗；中间面板，抗LC3；底部面板，抗α-微管蛋白。（C） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4BC74A号（附件4BC74A号)在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼蛋白（W）的HBSS中培养2 h。使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗p62、抗LC3和抗α-微管蛋白。（D） 稳定表达空载体（Mock）或抗LC3 shRNA（LC3 KD）的293A细胞在HBSS中培养2h并收集。使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗LC3、抗GABARAP和抗α-微管蛋白。（E） mStrawberry-Atg4B模型C74A号-表达（Atg4BC74A号)或LC3-敲除（LC3-KD）293A细胞在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼蛋白（W）的HBSS中培养2 h。按照材料和方法.

接下来，我们检查了Atg4B的作用C74A号293A细胞自噬通量的过度表达。据报道，p62/SQSTM1是自噬的选择性底物(比约科伊等。, 2005；水岛和吉森，2007年)，我们通过监测内源性p62蛋白水平来研究自噬降解。在稳态下，Atg4B中的p62水平C74A号过度表达的细胞比模拟细胞高很多，这表明自噬清除的组成缺陷(图1C） ●●●●。在模拟细胞中，营养饥饿导致自噬，导致p62蛋白水平略有下降；100nM的沃特曼蛋白阻断了这一过程，沃特曼是磷脂酰肌醇3-激酶的抑制剂，可以阻断自噬活性(布洛马特等。, 1997). 在Atg4B中未观察到类似的减少C74A号-过度表达细胞(图1C） ●●●●。然后，我们在模拟细胞中监测营养素饥饿后的长期蛋白质降解，这些细胞稳定表达mStrawberry-Atg4BC74A号和稳定表达抗LC3 shRNA的细胞(图1D） ●●●●。在模拟和LC3敲低的细胞中，营养饥饿会提高长寿命蛋白质的降解，而wortmannin会阻断这种降解(图1E） ●●●●。这表明LC3缺乏对自噬通量几乎没有影响。这可能是由于存在LC3 Paralogue，例如GABARAP，可能具有冗余功能。另一方面，在稳定表达mStrawberry-Atg4B的细胞中C74A号，长效蛋白的降解被显著抑制(图1E） 表明自噬缺陷。

Atg4B过度表达C74A号通过固定LC3抑制PE结合

接下来我们评估了PE结合途径中的哪一步受Atg4B的影响C74A号突变体。在LC3/Atg8共轭反应中，Atg12-Atg5共轭物和Atg16L形成800-kDa超络合物（简称Atg16L络合物；水岛等。, 2003)通过将E2（Atg3）-LC3中间体招募到结合位点发挥类似E3的作用(花田等。, 2007；葛田等。, 2008). 在稳定表达mStrawberry-Atg4B的293A细胞中C74A号，Atg12-Atg5共轭物的形成不受影响(图2A） ●●●●。为了检测稳定表达mStrawberry-Atg4B的模拟293A或293A细胞的Atg16L复合物、细胞溶质部分的大小C74A号用大小排阻色谱分离，并用抗Atg5或抗Atg16L抗体进行免疫印迹。如所示图2B、 mStrawberry-Atg4B没有改变Atg16L复合物的分子量C74A号过度表达。从这些结果中，我们得出结论，Atg16L复合物的形成不受Atg4B过度表达的影响C74A号.

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Atg4B的影响C74A号Atg16L复合体过度表达。（A） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4BC74A号（附件4BC74A号)在生长培养基或HBSS中培养2小时，并使用每种抗体进行蛋白质印迹。从顶部面板，抗RFP、抗Atg5、抗LC3、抗α-微管蛋白。抗RFP抗体与mStrawberry反应。（B） 稳定表达空载体或mStrawberry-Atg4B的293A细胞的细胞溶胶部分C74A号用体积排阻色谱法分离。使用所示抗体对组分进行蛋白质印迹。显示了分子质量标准的位置。Vo，空隙率。

LC3副产物被合成为一种必须被Atg4裂解的形式，以暴露参与共轭的甘氨酸残基。这一初始加工步骤可能会被过量的非活性Atg4B竞争性抑制，导致无法暴露甘氨酸残留。为了确定切割是否受到抑制，我们使用了Myc-LC3-HA结构，其中HA标签融合在LC3的C末端。这种结构使我们能够通过监测大小轻松区分前LC3和LC3-I(卡贝亚等。, 2000). 如所示图3A、 阴性对照Myc-LC3G120A型-HA蛋白未经处理。然而，在稳定表达mStrawberry-Atg4B的293A细胞中均检测到Myc-LC3-IC74A号在模拟牢房里。这一结果表明，前LC3处理不受Atg4B过度表达的影响C74A号.

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过量Atg4B之间形成稳定络合物C74A号和LC3阻止访问Atg7。（A） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4BC74A号（附件4BC74A号)用Myc-LC3-HA（WT）或Myc-LC3转染G120A型-HA（GA）。转染后36小时，细胞在生长培养基或HBSS中培养2小时，并进行Western blotting。从顶部面板，抗RFP、抗Myc和抗α-微管蛋白。（B） 用携带3xFlag标记的野生型Atg4B（WT）、Atg4B的腺病毒感染PC12细胞C74A号（CA）或Atg4BC74S公司（CS）。孵育40小时后，用抗Flag M2缀合的琼脂糖珠对细胞裂解物进行免疫沉淀。使用每种抗体通过蛋白质印迹检测共免疫沉淀的分子。从顶部面板，反旗帜、反LC3和反GATE16。显示了总细胞裂解物（输入）和免疫沉淀蛋白（IP）。（C） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4BC74A号（附件4BC74A号)如图所示，转染GFP-LC3和Myc-Atg7。转染后36小时，使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗myc、抗GFP和抗α-微管蛋白。

GFP-LC3通常在细胞质和细胞核内检测到，当它不形成点状突起时。GFP-LC3的核定位可能取决于GFP的性质，因为使用抗LC3抗体对内源性LC3进行的间接免疫荧光分析没有显示核定位模式(小松等。, 2005). 有趣的是，在Atg4B过度表达的细胞中，GFP-LC3斑点形成受到抑制，GFP-LC 3信号仅在细胞质中检测到(图1A） ●●●●。核GFP-LC3的缺失表明它被过量的Atg4B捕获，而Atg4B只定位于细胞质中。为了支持这一假设，我们确定Atg4B及其非活性突变体与LC3副产物形成稳定的复合物。3xFlag-Atg4B突变体有效地拉下LC3-I和GATE16-I(图3B） ●●●●。因此，LC3-Atg7中间体的形成应通过过表达Atg4B来抑制C74A号为了证实这一点，我们使用了突变E1（Atg7C567S型)活性位点半胱氨酸残基被丝氨酸取代的酶。该突变体稳定高分子量LC3-Atg7C567S型中间产物，因为酶和底物之间形成稳定的酯键，而不是不稳定的硫酯键(谷多等。, 2001). 虽然在模拟293A细胞中检测到LC3-Atg7中间产物，但在稳定表达mStrawberry-Atg4B的293A电池中未检测到该中间产物C74A号(图3C） ●●●●。我们还观察到，在野生型Atg4B和Atg4B中未检测到LC3-Atg7中间产物C74A号突变，过度表达细胞（补充图S1）。这些结果表明，Atg7-LC3中间产物的形成是被Atg4B过度表达抑制的步骤。

附件4BC74A号突变体以剂量依赖的方式抑制LC3脂质化(图4A） ●●●●。积累的数据表明，抑制作用的原因是过量的Atg4B突变体对LC3旁系同源物的螯合。如果是这样，抑制作用应取决于Atg4B与LC3副产物的分子比。为了测试这个模型，我们在稳定表达mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞中表达GFP标记的LC3副产物C74A号正如预期的那样，外源性LC3或其他LC3副产物以剂量依赖的方式抑制了Atg4B突变体对LC3脂质氧化的抑制作用(图4B和补充图S2）。总的来说，我们得出结论，过量的Atg4B对LC3副产物的隔离C74A号阻止LC3副产物进入Atg7并导致自噬降解缺陷。

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外源性LC3以剂量依赖的方式抑制Atg4B突变体对LC3脂质氧化的抑制作用。（A） NIH3T3细胞感染不同数量的携带mStrawberry-Atg4B的逆转录病毒C74A号筛选出稳定的转化子。将稳定细胞在HBSS（饥饿）中培养1 h，并使用每个抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗Atg4B、抗RFP、抗LC3和抗α-微管蛋白。（B） 稳定表达mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号感染不同数量的携带GFP-LC3的逆转录病毒，然后选择双稳定的转化子。亲本NIH3T3细胞和稳定的转化子在HBSS（饥饿）中培养1 h，并使用每个抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗GFP、抗LC3和抗α-微管蛋白。

LC3 Paralogues参与关闭隔离膜

由于Atg4B突变体隔离LC3副logue，过度表达该蛋白的细胞为分析LC3副Logue在自噬体形成中的作用提供了一个有用的系统。为此，我们利用NIH3T3细胞，由于细胞质分布良好，适合对自噬膜进行形态学分析。在该细胞系中还观察到Atg4B突变体过度表达对LC3副产物PE结合的抑制作用和LC3的膜靶向作用(图4，补充图S3和S4A）。此外，mStrawberry-Atg4B中p62小体的数量显著增加C74A号–表达细胞（补充图S4C）。在野生型细胞中，分离膜被检测为点状GFP-Atg5信号。当隔离膜伸长并融合形成自噬体时，Atg5从膜上分离。因此，GFP-Atg5只能在新生的自噬体上检测到，而不能在完全形成的自噬体上检测(水岛等。, 2001). 在GFP-Atg5和mStrawberry-Atg4B的细胞系中C74A号在营养丰富和饥饿条件下，点状GFP-Atg5信号的数量增加(图5、A和B）。通过使用抗Atg16L抗体进行免疫染色，我们获得了类似的结果（补充图S4B）。Atg16L复合物的膜定位依赖于磷脂酰肌醇3-激酶(葛田等。, 2008；水岛等。, 2001). mStrawberry-Atg4B中的点状GFP-Atg5信号C74A号–与对照细胞一样，表达细胞也通过沃特曼处理分散(图5、A和B）。用延时视频显微镜测量GFP-Atg5结构在对照细胞中的平均寿命为～5分钟，但在Atg4B中延长至～20分钟C74A号-过度表达细胞（补充电影S1和S2，以及图5C） ●●●●。

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Atg4B的影响C74A号GFP-Atg5阳性膜结构过度表达。（A和B）稳定表达GFP-Atg5或同时表达GFP-Attg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼（W）的HBSS中培养1小时，然后固定。通过共焦激光扫描显微镜（FV1000，奥林巴斯）（A）从间隔0.3μm的连续光学切片获得三维图像堆栈。棒材，10μm。GFP-Atg5点在100多个细胞中计数。所示值为平均值±SD（B）。（C） 稳定表达GFP-Atg5或同时表达GFP-Attg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号在HBSS中生长1 h，并通过延时视频显微镜直接观察。对50多例患者测量了每一GFP-Atg5点的持续时间。所示数值为平均值±标准差。

为了进一步表征Atg5阳性膜结构，我们检测了Atg9L1的定位，它是酵母Atg9（一种参与自噬体形成的膜蛋白）的哺乳动物同源物(山田等。, 2005). 据报道，在哺乳动物细胞中，Atg9L在反式-高尔基网络和高尔基(年轻等。, 2006). 如补充图S5A所示，在存在或不存在Atg4B的情况下，Atg9L1没有显示出与GFP-Atg5的高度共定位C74A号表明Atg4B中的缺陷C74A号-过度表达的细胞与Atg9L定位无关。然后我们分析了不协调的51样激酶1（ULK1）的定位，ULK1是酵母Atg1的哺乳动物同源物，Atg1是一种也参与自噬体形成的蛋白激酶(陈等。, 2007；哈拉等。, 2008). 在对照细胞中，myc-TEV-Flag标记的ULK1与GFP-Atg5共定位（补充图S5B）。在表达Atg5结合缺陷突变体的Atg5敲除细胞中130克，小新月状Atg5阳性膜室积聚(水岛等。, 2001). 在Atg5敲除的MEF细胞中表达GFP-Atg5K130R型，ULK1也被招募到该结构中（补充图S6）。据报道，ULK1和GABARAP（LC3副录）之间存在物理交互作用(冈崎等。, 2000); 因此，Atg4B有可能C74A号过度表达导致ULK1定位缺陷。然而，在Atg4B中观察到ULK1和Atg5的共定位C74A号-过度表达的细胞（补充图S5B），表明GFP-Atg5-缺乏LC3-PE的阳性结构含有ULK1。

接下来，我们在超微结构水平上检查了Atg5阳性结构。在模拟细胞中，隔离膜(图6B） ，自噬体(图6电子显微镜观察到许多以高电子密度信号为特征的自溶体样结构(图6A） ●●●●。除自溶体外，细胞内还有其他电子致密结构，因此，如果没有特定标记物，某些结构，如两性体或自溶体，就无法绝对区分(Eskelinen，2008年). 因为LC3是自噬体和自溶体的唯一特异性标记，其膜定位被Atg4B严重抑制C74A号过度表达（补充图S4A），我们无法进一步解释电子致密结构。因此，我们计算了分离膜和双膜自噬膜。与模拟细胞相比，许多隔离膜(图6、G和H）和自噬体样结构(图6在稳定过度表达Atg4B的细胞中观察到C74A号(图6、F和K）。因为我们观察了细胞的横截面，所以有时很难确定自噬体样结构是否真的闭合。然而，Atg4B中完全开放结构与总自噬结构的比率明显较高C74A号-表达细胞比模拟细胞(图6五十） ●●●●。我们还观察到，GFP-LC3的过度表达降低了过量Atg4B引起的自噬结构数量的增加以及开放结构与总自噬构筑物的比率（补充图S7）。尽管模拟和mStrawberry-Atg4B之间开放自噬膜的长度没有显著差异C74A号–过度表达细胞，Atg4B中封闭自噬膜的长度C74A号-过度表达的细胞比模拟细胞的长度略短(图6M） ●●●●。Atg4B中开放自噬膜与封闭自噬膜的长度之比C74A号-过度表达的细胞明显高于模拟细胞(图6N） 表明该缺陷存在于自噬体形成的晚期。最后，为了将这些结构与荧光显微镜相关联，我们进行了免疫电子显微镜。表达GFP-Atg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号在HBSS中生长1 h，并使用抗GFP抗体通过金增强免疫金电子显微镜检查GFP-Atg5的定位。如所示图6O、 在Atg4B中，伸长相对较好的分离膜对GFP-Atg5呈阳性C74A号-过度表达的细胞。这些证据表明，LC3副序列参与哺乳动物细胞自噬体形成的完成。

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Atg4B自噬膜的超微结构分析C74A号-过度表达的细胞。稳定表达空载体（Mock）（A–E）或mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号（F–J）在HBSS中培养1h，固定，并进行常规电子显微镜分析。（B–E）模拟细胞中的典型自噬结构；隔离膜（B）、自噬体（C–E）。（G–J）mStrawberry-Atg4B中的典型自噬结构C74A号-表达细胞；隔离膜（G和H）、闭合双膜结构（I和J）。图中显示了电子致密结构（黑色箭头）、闭合自噬膜（白色箭头）和开放自噬薄膜（白箭头）的示例。条形，500 nm。（K） 模拟和mStrawberry-Atg4B中自噬结构的数量C74A号-表达细胞。▩, 开放自噬结构；■, 封闭的自噬结构。数据是代表性实验的三倍平均值±SD。（五十） 开放结构与总自噬结构的比率。数据是代表性实验的三倍平均值±SD*p<0.05。（M） 模拟和mStrawberry-Atg4B中自噬膜的长度C74A号-表达细胞。▩, 开放自噬结构；■, 封闭的自噬结构。对于自噬膜的长度测定，使用ImageJ版本1.40(http://rsb.info.nih.gov/ij/). 所示值为平均值±标准差。每个结构至少检查了20个样本*p<0.05；NS，不显著。（N） 模拟和mStrawberry-Atg4B中开放与闭合自噬结构的长度之比C74A号-表达细胞*p<0.05。（O） 同时表达GFP-Atg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞C74A号在HBSS中生长1小时并固定。使用抗GFP抗体通过金增强免疫金电镜检查GFP-Atg5的定位。条形，500 nm。

讨论

我们发现，Atg4B的过度表达对自噬具有抑制作用，而不依赖于其在哺乳动物细胞中的脱脂活性。非活动Atg4BC74A号突变体通过将LC3副产物隔离在稳定的络合物中，特异性地阻断LC3副反应的脂质化，从而阻断Atg7-LC3反应。有趣的是，Atg4B酶对其产物、加工的LC3旁系同源物具有高亲和力。这与无活性泛素去结合酶的过度表达形成鲜明对比，这种酶以显性负向的方式发挥作用，提高其底物泛素结合蛋白的水平(Hang和Dasso，2002年；锂等。, 2002). 在酶反应过程中，Atg4和LC3副产物应结合，但一旦发生裂解，蛋白质应解离以进行下一步，即Atg7-LC3反应。可能需要一个未知因子将LC3与Atg4分离，而Atg4过度表达可能会导致该因子的限制。

细胞内过度表达Atg4BC74A号尽管这些膜的长度与对照细胞中自噬体膜的长度相当，但大量自噬结构并没有闭合(图6M） ●●●●。这一观察结果与Atg5阳性膜结构积累并延长寿命的结果相吻合(图5)根据之前的报告，一旦自噬体形成完成，Atg16L复合物就会分离(水岛等。, 2001). 在表达GFP-Atg5的Atg5敲除细胞中K130R型突变体，其中未发生Atg12-Atg5结合，GFP-Atg5K130R型信号在膜结构中的停留时间也更长。这些细胞具有不完整的Atg16L复合物，缺乏Atg12，而在Atg4B中C74A号过度表达的细胞，Atg16L复合物是完整的。因此，在自噬体形成完成后，从膜上释放Atg16L复合体的触发因素似乎不在Atg16L复合体内。

有趣的是，自噬体的形成在Atg4B中进行到了相对较晚的阶段C74A号-过度表达细胞；形成自噬体样结构。此外，ULK1以类似于在对照细胞的分离膜中观察到的方式被募集到结构中（补充图S5）。自噬体完成的明显缺陷是每个伸长膜的末端闭合。这并不一定排除Atg8在酵母自噬体膜扩张中的作用(谢等。, 2008)，因为我们只观察了末端表型，不能排除伸长速度较慢的可能性。Atg8-PE可导致体外小泡半融合(中川县等。, 2007). 一种可能性是，LC3副logue通过融合哺乳动物细胞膜来完成自噬体的形成。有趣的是，在atg8Δ酵母中，电子显微镜也检测到了自噬体样结构，但在低频率下(基里萨科等。, 1999). Atg8缺失仍有可能不完全阻碍自噬体膜的扩张。

我们不认为我们观察到的表型是由于LC3副logue功能的不完全抑制所致，因为在Atg3（Atg8同源物的一种特定E2酶）敲除的MEF细胞中也观察到了自噬体样结构，其中LC3副Logue的PE结合有缺陷（Keiji Tanaka博士和Dr。小松Masaaki，个人沟通）。通过利用Atg4B的非活性突变体，我们可以排除野生型Atg4B过度表达可能带来的次要影响，例如过度脱脂。因此，我们观察到的表型可能反映了LC3旁系同源物的物理隔离和缺乏。

一种可能提供重要信息的策略是人工抑制自噬。事实上，沃特曼宁或3-甲基腺嘌呤等药物的治疗被广泛用于自噬研究，但这些药物有副作用。RNA干扰介导的基因敲除是一种潜在的方法；然而，几乎完全抑制了自动液位计基因需要完全抑制自噬，而这通常很难实现(细川等。, 2006；吉村等。, 2006). 基因敲除的使用自动液位计基因是完全抑制的替代选择，但可用的细胞类型受到限制。对于Atg4BC74A号过度表达，似乎可以完全抑制任何类型细胞的自噬。一些研究表明，Atg12-Atg5结合物除了自噬之外还有其他作用(皮奥等。, 2005；优素福等。, 2006；竹下等。, 2007). 然而，目前报道的Atg5-或Atg7-缺陷细胞不能区分Atg12-Atg5结合物的自噬和非自噬功能，因为这两种细胞类型都缺乏。由于Atg4B突变体的过度表达会抑制自噬体的形成，但不会产生Atg12-Atg5结合物，因此可以避免此类问题。我们相信，非活性的Atg4B突变体将为分析自噬的广泛研究提供有用的工具。

补充材料

【补充资料】

致谢

作者感谢Kouichi Matsunaga博士（吉森实验室）提供稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞；Roger Y.Tsien博士（加利福尼亚大学圣地亚哥分校）为mStrawberry cDNA礼物；山冈Shoji博士为pMRX-IRES-puro和pMRX-IR ES-bsr赠送礼物；北村俊雄博士（日本东京大学）赠送Plat-E细胞；Noboru Mizushima博士（日本东京医科牙科大学）赠送抗Atg16L抗体；Takuya Hayashi先生（吉森实验室）赠送myc-TEV-Flag-tagged Atg9L1构造；和Kyouhei Umebayashi博士（吉森实验室）进行了有益的讨论。本报告所述的工作得到了教育、文化、体育、科学和技术部促进科学技术特别协调基金的部分支持。

使用的缩写：

哈佛商学院汉克斯平衡盐溶液
MEF公司小鼠胚胎成纤维细胞
聚乙烯磷脂酰乙醇胺
TCA公司三氯乙酸
乌尔克不协调的51样激酶。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E08-03-0312)2008年9月3日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会