An Atg4B mutant hampers the lipidation of LC3 paralogues and causes defects in autophagosome closure

doi:10.1091/mbc.e08-03-0312

.2008年11月；19(11):4651-9.

doi:10.1091/mbc.e08-03-0312。 Epub 2008年9月3日。

Atg4B突变体阻碍LC3旁系同源物的脂质化并导致自噬体闭合缺陷

藤田直男¹, Mitsuko Hayashi-Nishino公司, 福本裕美, 大本弘子, 山本秋树, 野田毅, 吉森田松（Tamotsu Yoshimori）

附属公司

PMID： 18768752
预防性维修识别码： PMC2575160型
内政部： 10.1091/mbc.e08-03-0312

Atg4B突变体阻碍LC3旁系同源物的脂质化并导致自噬体闭合缺陷

藤田直男等人。分子生物学细胞. 2008年11月.

.2008年11月；19(11):4651-9.

doi:10.1091/mbc.e08-03-0312。 Epub 2008年9月3日。

作者

藤田直男¹, Mitsuko Hayashi-Nishino公司, 福本裕美, 大本弘子, 山本秋树, 野田毅, 吉森田松（Tamotsu Yoshimori）

附属

¹大阪大学微生物疾病研究所细胞调控系，大阪市住田565-0871，日本。

PMID： 18768752
预防性维修识别码： PMC2575160型
内政部： 10.1091/mbc.e08-03-0312

摘要

在自噬过程中，一种泛素样分子LC3/Atg8与磷脂酰乙醇胺（PE）结合，并与形成自噬体相关。在哺乳动物细胞中，多个Atg8同源物（称为LC3副产物）的存在阻碍了LC3副物脂质化的遗传分析。在这里，我们表明Atg4B（一种处理前LC3副logue的蛋白酶）的非活性突变体的过度表达抑制LC3副Logue的自噬降解和脂质氧化。抑制作用是由游离LC3副产物在与Atg4B突变体的稳定复合物中的隔离引起的。在突变过表达细胞中，Atg5-和ULK1-阳性中间自噬结构积累。这些膜结构的长度与对照细胞相当；然而，有相当一部分人没有被关闭。这些结果表明，LC3副产物的脂质化参与了哺乳动物细胞自噬体形成的完成。这项研究也为今后各种各样的自噬研究提供了强有力的工具。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
表达Atg4B的细胞^C74A号表现出自噬降解受阻。（A）稳定表达GFP-LC3的MCF7细胞被携带mStrawberry（Mock）、mStrawberry-Atg4B的腺病毒感染^重量（WT）或mStrawberry-Atg4B^C74A号（C74A）并孵育40 h。然后将细胞在HBSS中培养2 h，固定，并使用荧光显微镜进行观察。棒材，10μm。（B）用携带GFP（−）、3x标记的野生型Atg4B（WT）、Atg4B的腺病毒感染PC12细胞^C74A号（CA）或Atg4B^C74S公司（CS）。细胞在生长或饥饿培养基中培养，用每种抗体通过Western blotting检测裂解产物。顶部面板，防旗；中间面板，抗LC3；底部面板，抗α-微管蛋白。（C） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4B^C74A号（附件4B^C74A号)在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼蛋白（W）的HBSS中培养2 h。使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗p62、抗LC3和抗α-微管蛋白。（D）稳定表达空载体（Mock）或抗LC3 shRNA（LC3 KD）的293A细胞在HBSS中培养2h并收集。使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗LC3、抗GABARAP和抗α-微管蛋白。（E） mStrawberry-Atg4B模型^C74A号-表达（Atg4B^C74A号)或LC3-敲除（LC3-KD）293A细胞在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼蛋白（W）的HBSS中培养2 h。按照*材料和方法*.

**图2。**
Atg4B的影响^C74A号Atg16L复合体过度表达。（A） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4B^C74A号（附件4B^C74A号)在生长培养基或HBSS中培养2小时，并使用每种抗体进行蛋白质印迹。从顶部面板，抗RFP、抗Atg5、抗LC3、抗α-微管蛋白。抗RFP抗体与mStrawberry反应。（B）稳定表达空载体或mStrawberry-Atg4B的293A细胞的细胞溶胶部分^C74A号用体积排阻色谱法分离。使用所示抗体对组分进行蛋白质印迹。显示了分子质量标准的位置。Vo，空隙率。

**图3。**
过量Atg4B之间形成稳定络合物^C74A号和LC3阻止访问Atg7。（A） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4B^C74A号（附件4B^C74A号)用Myc-LC3-HA（WT）或Myc-LC3转染^G120A型-HA（GA）。转染后36小时，细胞在生长培养基或HBSS中培养2小时，并进行Western blotting。从顶部面板，抗RFP、抗Myc和抗α-微管蛋白。（B）用携带3xFlag标记的野生型Atg4B（WT）、Atg4B的腺病毒感染PC12细胞^C74A号（CA）或Atg4B^C74S公司（CS）。孵育40小时后，用抗Flag M2缀合的琼脂糖珠对细胞裂解物进行免疫沉淀。使用每种抗体通过蛋白质印迹检测共免疫沉淀的分子。从顶部面板，反旗帜、反LC3和反GATE16。显示了总细胞裂解物（输入）和免疫沉淀蛋白（IP）。（C） 293A细胞稳定表达空载体（Mock）或mStrawberry-Atg4B^C74A号（附件4B^C74A号)如图所示，转染GFP-LC3和Myc-Atg7。转染后36小时，使用每种抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗myc、抗GFP和抗α-微管蛋白。

**图4。**
外源性LC3以剂量依赖的方式抑制Atg4B突变体对LC3脂质氧化的抑制作用。（A） NIH3T3细胞感染不同数量的携带mStrawberry-Atg4B的逆转录病毒^C74A号筛选出稳定的转化子。将稳定细胞在HBSS（饥饿）中培养1 h，并使用每个抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗Atg4B、抗RFP、抗LC3和抗α-微管蛋白。（B）稳定表达mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞^C74A号感染不同数量的携带GFP-LC3的逆转录病毒，然后选择双稳定的转化子。亲本NIH3T3细胞和稳定的转化子在HBSS（饥饿）中培养1 h，并使用每个抗体通过Western blotting检测细胞裂解物。从顶部面板，抗RFP、抗GFP、抗LC3和抗α-微管蛋白。

**图5。**
Atg4B的影响^C74A号GFP-Atg5阳性膜结构过度表达。（A和B）稳定表达GFP-Atg5或同时表达GFP-Attg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞^C74A号在生长培养基（F）、HBSS（S）或含100 nM沃特曼（W）的HBSS中培养1小时，然后固定。通过共焦激光扫描显微镜（FV1000，奥林巴斯）（A）从间隔0.3μm的连续光学切片获得三维图像堆栈。棒材，10μm。GFP-Atg5点在100多个细胞中计数。所示值为平均值±SD（B）。（C）稳定表达GFP-Atg5或同时表达GFP-Attg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞^C74A号在HBSS中生长1 h，并通过延时视频显微镜直接观察。对50多例患者测量了每一GFP-Atg5点的持续时间。所示数值为平均值±标准差。

**图6。**
Atg4B自噬膜的超微结构分析^C74A号-过度表达的细胞。稳定表达空载体（Mock）（A–E）或mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞^C74A号（F–J）在HBSS中培养1h，固定，并进行常规电子显微镜分析。（B–E）模拟细胞中的典型自噬结构；隔离膜（B）、自噬体（C–E）。（G–J）mStrawberry-Atg4B中的典型自噬结构^C74A号-表达细胞；隔离膜（G和H）、闭合双膜结构（I和J）。图中显示了电子致密结构（黑色箭头）、闭合自噬膜（白色箭头）和开放自噬薄膜（白箭头）的示例。条形，500 nm。（K）模拟和mStrawberry-Atg4B中自噬结构的数量^C74A号-表达细胞。▩, 开放自噬结构；■, 封闭的自噬结构。数据是代表性实验的三倍平均值±SD。（五十）开放结构与总自噬结构的比率。数据是代表性实验的三倍平均值±SD*p<0.05。（M）模拟和mStrawberry-Atg4B中自噬膜的长度^C74A号-表达细胞。▩, 开放自噬结构；■, 封闭的自噬结构。对于自噬膜的长度测定，使用ImageJ版本1.40(http://rsb.info.nih.gov/ij/). 所示值为平均值±标准差。每个结构至少检查了20个样本*p<0.05；NS，不显著。（N）模拟和mStrawberry-Atg4B中开放与闭合自噬结构的长度之比^C74A号-表达细胞*p<0.05。（O）同时表达GFP-Atg5和mStrawberry-Atg4B的NIH3T3细胞^C74A号在HBSS中生长1小时并固定。使用抗GFP抗体通过金增强免疫金电镜检查GFP-Atg5的定位。条形，500 nm。

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1. Chan E.Y.，Kir S.，Tooze S.A.对激肽组进行siRNA筛选，确定ULK1是自噬的多域调节剂。生物学杂志。化学。2007;282:25464–25474.-公共医学
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