人类细胞忠实染色体分离需要PIASγ

中期平板在没有PIASγ的情况下正常形成，但染色体可以离开平板

PIASγ缺失后，有丝分裂过程中最多有35%的细胞积累(图1我 数据未显示）表明，要么细胞进入有丝分裂比对照组慢，要么细胞在中期延迟后最终退出有丝分裂（或这些因素的组合）。进入有丝分裂的速度较慢，这与在诺克唑存在下重复上述时程实验的结果一致，即在有丝分裂过程中PIASγ缺失细胞的积累程度低于对照组(图1K（K） ). 然而，为了确定某些细胞在PIASγ缺失后是否退出有丝分裂，并更详细地了解活细胞中的有丝分裂缺陷，我们对具有荧光标记组蛋白（H2B-GFP）的HeLa细胞进行了16-20小时延时分析[23]遵循早期S相同步(图2，图S3，表S1、和电影S1–S4系列).

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图2

PIASγ缺失细胞的活细胞延时分析。

从两个对照区和两个缺乏PIASγ的细胞区中提取的选定细胞帧，在16(A、 C类)或20小时(B、 D类)双胸苷同步释放后的时间。

（支持信息包括该系列的整个领域的电影B类和D类拍摄了，以及与之对应的电影A类和C类，以及对每个细胞的细胞周期进程的详细分析图S3和表S1.) (A、 B类)控制(C、 D类)PIASγ缺失细胞。右上角的数字表示释放第二个胸苷块后的时间。

(A类)两个控制细胞分裂。两例患者的有丝分裂长度（M）均为1小时14分钟(电影S1).

(B类)六个控制细胞分裂。

有丝分裂较长的两个细胞用箭头表示，有丝分裂总长度用箭头表示；单元格是从中显示的字段中选择的电影S2.

(C类)两个缺乏PIASγ的细胞进入有丝分裂（分别为10小时07分钟和10小时28分钟）。

它们在核膜破裂后18分钟和15分钟达到中期，并在后期之前保持中期3小时26分钟和4小时18分钟。

底部的细胞在后期显示出一些滞后染色体（箭头），最终并入子核之一。

这些单元格如所示电影S3(D类)PIASγ缺失细胞分裂。

底部的细胞达到中期，中期延迟，几个染色体从板上脱离（去编码中期），恢复完整的中期板，然后返回去编码中期，最后在再次实现中期比对后才开始后期。

顶部的细胞在中期度过一个多小时后，大部分时间处于去表达中期。这些单元格是从中显示的更宽字段中选择的电影S4.

在对照组中，有丝分裂正常进行(图2A、 B类 ，图S3和表S1)在一个特定区域内，33/51（64%）的细胞在4小时内（从早期S期释放后10-14小时）进入有丝分裂，细胞同步性明显增强。在早期S期释放后的5小时内，PIASγ缺失细胞也与单个场中一半以上的细胞启动有丝分裂完全同步(图S3). 与中描述的时间进程实验一致图1，大多数PIASγ-缺失的细胞在有丝分裂中强烈延迟。有丝分裂的平均时间为6小时35分钟（s.d。 = 3小时56分钟；n个 = 26），而对照组为69分钟（s.d。 = 24分钟；n个 = 36).

PIASγ缺失细胞通常以正常的时间进行前中期，形成真正的中期板(图2C、 D类 ，图S3和表S1). 在这些细胞中，中期持续时间比对照细胞长1–6倍（s.d。 = 78分钟，相比之下，s.d.为44分钟。 = 对照组25分钟）。中期记录的最大时长为4小时10分钟。在延长中期后，观察到两种替代结果：（i）细胞启动后期(图2C类 )偶尔会观察到滞后的染色体（见电影S3对应于图2C类 ; 参见箭头）或后期启动是异步的（参见图S1对 )或（ii）几个染色体离开中期板，向纺锤极迁移(图2D类，顶部单元格). 在后一类中，细胞似乎已恢复到前中期样状态；在某些情况下，这些细胞恢复了所有染色体的完全中期排列，在后期，在中期进一步延迟后，能够进行后期排列(图2D类，底部单元格). 这一类别中的其他细胞在延时电影结束之前一直处于“去编码”中期状态(图2D类，顶部单元格).

结合细胞学分析图1和图S1这些活细胞成像研究详细描述了PIASγ缺失引起的有丝分裂缺陷。大多数细胞及时进入中期，形成明显正常的中期板。在延长中期延迟后，细胞要么进入后期，要么少量染色体离开板并迁移到纺锤极。这种去表达中期状态在大多数细胞中维持了数小时。

在没有PIASγ的情况下，应满足主轴检查点的要求，但着丝粒保持粘连

中期板块在没有PIASγ的情况下正常形成，但后期未能按时启动，这似乎违反了直觉。延时研究表明，启动后，一些PIASγ缺失细胞的后期正常进行，表明有丝分裂纺锤体和马达功能正常。一致的是，α-管蛋白的免疫染色显示，在缺乏PIASγ的细胞中，有丝分裂纺锤体与对照中期没有区别(图3A、 G公司 ). 此外，在对照细胞和缺乏PIASγ的细胞中，中期板染色体的动粒明显少于远离板的染色体动粒(图3B–F、H–K ). 这种染色模式是典型的纺锤形检查站失活后，每个染色体聚集到中期板[24]，[25]PIASγ耗尽细胞中形成的中期板与对照中期板无法区分，也认为纺锤体检查点应该被沉默，因为只有在适当的动粒细胞微管附着时，中期板上的染色体才能发生生物定向，导致纺锤体对每个结合的姊妹体施加的反向力达到平衡，并在每个染色体上产生适当的纺锤体张力。因此，PIASγ缺失细胞中延长的中期延迟表明有丝分裂检查点能够在中期发挥作用：这只是以前报道的对拓扑异构酶II抑制的反应[26]–[28].

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图3

在缺乏PIASγ的细胞中，纺锤体形态正常，对齐染色体的动粒处CENP-E染色减少。

(A、 克)在对照组和缺乏PIASγ的中期细胞中，有丝分裂纺锤体（用抗α-管蛋白抗体染色）无法区分，只是在后期有一小部分具有额外的极点（如箭头所示A类): (A、 克)红色 = α-管蛋白，蓝色 = DAPI公司。

(B–F、H–K)CENP-E染色（红色）在远离中期板的染色体动粒上强烈检测到，无论是对照处理细胞还是缺乏PIASγ的细胞(B、 H、I)但在板上的染色体大大减少(C、 J、K).

在中期长时间停滞后，一些PIASγ缺失细胞有一条或两条染色体离开平板，在其动粒处重新获得强烈的CENP-E染色(D–F并查看图S1N、 O（运行） ).

同一单元格如所示D类（合并图像），E类（CENP-E应变）和F类（DAPI应变）。

PIASγ耗尽后激活了依赖于极光B和Mad2的检查点

上述结果表明，缺乏PIASγ可能触发了有丝分裂检查点。虽然纺锤体检查点在缺乏PIASγ的中期似乎已被沉默，但基于动粒CENP-E染色的减少，我们发现，使用RNAi联合耗尽Mad2和PIASγ，可以在双胸腺嘧啶同步释放后消除有丝分裂中细胞的积累（数据未显示）。我们还发现Aurora B的小分子抑制剂ZM447439[29]，能够解除中期逮捕(图4). 在Hec1耗尽的对照细胞中，一种诱导持续纺锤体检查点阻滞的治疗[30]添加ZM447439后，几乎所有细胞都能快速分离姊妹体，然后有丝分裂退出(图4A–E ). 类似地，通过有丝分裂振荡收集PIASγ缺失的有丝分裂细胞，然后添加ZM447439，大多数细胞迅速进行姐妹染色单体分离和分离，然后有丝分裂退出(图4F–J型 ). 后期和有丝分裂退出可能是ZM447439处理后细胞周期蛋白B降解的结果。与此相一致，添加Cdk抑制剂roscovitine对PIASγ缺失细胞也有类似的作用(图4K–O型 )诱导染色单体分离、纺锤体极分离和有丝分裂出口。因此，这些实验解决了几个重要问题。首先，只要Cdk-cyclin B失活，PIASγ缺失细胞基本上能够消除姐妹间的凝聚力。第二，如延时研究所示，用ZM447439或roscovitine处理的PIASγ缺失细胞一定具有功能性有丝分裂纺锤体，因为染色体在末期去致密之前分离到纺锤体两极。第三，PIASγ耗尽引起的中期延迟是一个检查点响应。

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图4

在缺乏PIASγ的中期细胞中，Aurora B或Cdk抑制可诱导后期。

(A–E)使用RNAi耗尽Hec1[30]在前中期诱导持续性纺锤体检查点停止(A类).

极光B抑制剂ZM447439（5.6µM）[29]绕过这次逮捕：细胞在后期进行(B、 C类)并在30分钟内退出有丝分裂(D、 E类).

(F–J型)添加ZM447439后，被PIASγ耗尽阻滞在中期的细胞进行后期和退出有丝分裂，但其动力学略慢于Hec1耗尽的细胞，这表明：（1）PIASγ缺失后，纺锤体与动粒的相互作用是有功能的，（2）姐妹染色单体能够迁移到相反的纺锤体两极，（3）PIASγ耗尽后的中期阻滞是由于检查点反应。(K–O型)Cdk抑制剂roscovitine（150µM）在PIASγ耗尽的中期阻滞细胞中诱导无期和有丝分裂退出。

检查点可以监测生物过程中的缺陷，并通过延迟细胞周期进程作出反应[8]PIASγ缺失细胞的中期延迟是典型的检查点反应，因为尽管可以机械地进行，但后期发作被阻断，通过化学抑制检查点成分之一（在本例中为极光B）可以绕过延迟，在某些细胞中，即使后期不一定能成功完成，延迟也会自动克服。当被ZM447439或roscovitine覆盖时，染色单体分离很少有效(图4F–O型 ). 通常，绕过检查点延迟会显示激活检查点的细胞畸变。在缺乏PIASγ的细胞出现延迟的情况下，检查点旁路显示几乎每个细胞分裂细胞核之间存在多个染色质桥。在PIASγ缺失细胞的延时电影中，在一些后期也可以看到落后的染色体，这些细胞以前在中期延迟了很长一段时间。这些数据表明，PIASγ缺失细胞的缺陷可能是不能有效分离姐妹染色单体。

在hSgo1缺失的细胞中，PIASγ是姐妹分离所必需的

PIASγ的缺乏导致了中期到后期过渡的检查点激活，并且细胞未能去除着丝粒的内聚力。然而，如果缺乏PIASγ干扰了凝集素的去除，上述实验并没有直接解决。许多重要的研究表明，即使在纺锤体检查点处于活动状态的情况下，缺乏凝聚力保护蛋白hSgo1的细胞也不能保持姐妹染色单体的凝聚力[13]，[31]–[35]这些结果表明，没有hSgo1，细胞对纺锤体检查点控制不敏感，核膜破裂后，凝集素迅速从染色体上去除。如果PIASγ缺失通过激活纺锤体检查点使细胞停滞在中期，但与染色体凝聚力没有直接关系，那么hSgo1的缺失应减轻PIASγ敲除后的姐妹染色单体凝聚力。如前所述，我们可以通过RNA干扰（数据未显示）有效地耗尽hSgo1的HeLa细胞，并发现，与以前的报告类似，细胞在有丝分裂过程中积累，其所有姐妹染色单体完全分离，即使在诺可唑的存在下也是如此[13]在没有hSgo1的情况下，姐妹染色单体同样能够在细胞中分离，在这些细胞中，APC/C活性通过耗尽催化位点的Apc2组分和同时添加诺卡唑而被消除(图5A、 B类 ). 此外，如果心轴检查点因Hec1耗尽而持续激活(图5C类 )hSgo1的同时缺失导致姐妹凝聚力的完全丧失(图5D类 ). 这些实验中的每一个都证实了已知的纺锤体检查点通路在缺乏凝聚力保护蛋白hSgo1的情况下无法保持凝聚力。

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图5

在缺乏凝集素保护蛋白hSgo1的PIASγ缺失细胞中，姐妹染色单体不能分离。

(A、 B类)当APC/C（Apc2）的一个重要成分与粘着蛋白保护因子hSgo1一起被耗尽时，HeLa细胞在与分离姐妹的有丝分裂中停止。

如前所述进行RNAi[13]在诺康唑存在下，在早期S期同步后允许细胞达到有丝分裂：(A类)Apc2缺失后诺可唑阻止c-有丝分裂；(B类)在hSgo1和Apc2共耗竭后，在诺可达唑存在下完成姐妹染色单体分离。(C、 D类)当Hec1缺失诱导持续纺锤体检查点时，hSgo1是姐妹凝聚力所必需的（如图3和[13]): (C类)Hec1耗竭后的前中期阻滞；(D类)hSgo1和Hec1共同耗尽后完成姊妹分离。这些显微照片上的数字(A–D)表示从S期释放后20小时内以这些表型停止的细胞百分比。(E–N公司)当PIASγ被共同耗尽时，hSgo1缺失也不会导致姐妹分离(E–J公司)或诺卡唑的存在(K–N（K–N）): (E、 F类)PIASγ耗尽后中期阻滞；(K（K）)PIASγ-缺失后诺克唑的c-有丝分裂阻滞；(G、 L（左）)hSgo1缺失后完全姐妹分离，使用或不使用诺康唑；(H、 我)hSgo1和PIASγ共同耗尽后中期阻滞；(M（M）)hSgo1和PIASγ共耗竭后诺可达唑抑制c-mitosis。(J型)从早期S期释放后，hSgo1缺失细胞与分离的姐妹细胞在有丝分裂中停滞，而几乎所有的PIASγ缺失细胞和hSgo1/PIASγ共同缺失细胞与凝聚的姐妹细胞停滞。诺康唑处理的细胞从早期S期释放后也获得了类似的结果(N个). 诺卡唑用量为0.25µM。(O–R′)HeLa细胞中myc标记Rad21的免疫染色。(O–R（运行-恢复）)DAPI（蓝色）、CREST（绿色）、myc-Rad21（红色）的合并。(O′–R′)仅myc-Rad21染色。

(O、 O′)对照细胞。由CREST信号显示，Rad21强烈定位于动粒之间，而在染色体臂之间较弱。与其他小组一样，术语“类中期”是指在免疫染色前所需的预提取和固定程序后，中期无法明确识别。(P、 P′)中期PIASγ缺失细胞显示与对照细胞类似的myc-Rad21定位模式。(Q–Q′)Sgo1缺失细胞。左边的细胞很可能是早期前期细胞（通过紧密配对的姐妹动粒判断），并且在整个细胞核中显示出高myc-Rad21染色，而右边的细胞没有任何可检测到的myc-Rad21（大多数染色体都有成对的动粒，而一些染色体已经分离，这是hSgo1缺失后早熟姐妹分离的典型特征）。(R、 R′)PIASγ和hSgo1共同耗尽后的中期细胞。虽然姐妹着丝粒内聚力保持不变（动粒成对），但未观察到可检测的myc-Rad21染色。

我们使用RNAi（数据未显示）和双胸苷阻断方案耗尽同步化HeLa细胞中的PIASγ和hSgo1，然后释放到细胞周期中，无论是否使用诺康唑。如前所述，无论培养基中是否存在诺克唑，hSgo1缺失的细胞在有丝分裂过程中积累，姐妹染色单体分离，细胞周期进展被阻断，处于类似于末期的状态(图。5G、J、L、N ). 然而，出乎意料的是，缺乏PIASγ和hSgo1的双耗尽HeLa细胞在中期/去表达中期积累，并有粘连的姐妹染色单体(图5H–J、M、N )就像细胞只消耗PIASγ一样(图。5E、F、K ). 因此，值得注意的是，即使在没有凝聚力保护蛋白hSgo1的情况下，姐妹染色单体分离也需要PIASγ。当PIASγ与索罗林（Sororin）同时被耗尽时，也观察到了同样的结果，索罗林是一种与凝集素复合体物理上相互作用的蛋白质，是有丝分裂中姐妹染色单体凝聚力所必需的（数据未显示）[36]，[37]这些实验表明，PIASγ可能直接参与内聚力的去除。

从着丝粒中去除粘着蛋白不需要PIASγ

PIASγ/hSgo1双亏损细胞中姐妹染色单体分离的缺失可以用以下两种方式中的一种来解释：（1）即使在没有凝集素监护人的情况下，也需要PIASγ来去除凝集素，或者（2）在没有凝集素的情况下姐妹染色单体能在着丝粒处保持凝集。为了验证这一点，我们在PIASγ缺失、hSgo1缺失或双缺失细胞中对Rad21进行了免疫放大。正如预期的那样，hSgo1缺失细胞中的有丝分裂染色体缺乏任何可检测到的凝集素，除非核膜破裂之前，在这种情况下，凝集素在整个细胞核中都能强烈检测到(图5Q，Q′). 然而，与对照细胞一样，PIASγ缺失的有丝分裂细胞在每一条相关染色体的成对动粒之间有着清晰的着丝粒Rad21区域(图5P、 P′ ). 染色体臂之间也可见一些Rad21(图5O、 O′，P，P′ ). 令人惊讶的是，在hSgo1/PIASγ双亏损细胞中，成对的动粒或相干姐妹臂之间未观察到Rad21(图5R、 R′ ). 因此，在没有hSgo1的情况下，从染色体中去除粘着蛋白不需要PIASγ，但在相同的实验条件下，姐妹染色单体分离需要PIASγ。因此，在缺乏可检测的Rad21的情况下，姐妹动粒之间的内聚力得以维持。

在缺乏凝聚力的情况下，DNA链可能维持着丝粒的初级收缩和凝聚力

由于在两种不同的条件下（没有索罗林或hSgo1）姐妹分离需要PIASγ，在这两种条件下，基于凝聚力的凝聚力不能将姐妹结合在一起，并且由于我们无法在PIASγ/hSgo1缺失细胞的着丝粒处检测到凝聚力Rad21，我们推测，在PIASγ缺失后，内聚蛋白并不是提供姐妹内聚的唯一成分。在酵母中，凝集素复合物的组分和调节物被sumo连接酶修饰，此外，酵母拓扑异构酶II被sumo酰化。一种已知的连接姐妹染色单体的机制是DNA连环，虽然不知道它是否受到严格的调控，但它是在S期合成姐妹DNA分子时产生的。在芽殖酵母和爪蟾，PIASγ介导的DNA拓扑异构酶II的sumoylation是唯一一种能够去除姐妹染色单体间连环的酶，被认为在有丝分裂期间将拓扑异构酶II靶向染色体的着丝粒或中心周围区域[16]，[21]因此，在缺乏PIASγ的细胞中，除了凝集素外，连锁还与姐妹染色单体相连，这一点似乎是合理的。这可以解释为什么PIASγ和hSgo1双亏损细胞在没有凝集素的情况下保持姐妹染色单体的凝聚力，并表明需要PIASγ来去除连锁。为了验证这一假设，我们使用了拓扑异构酶II的特异性抑制剂ICRF-193，它将酶锁定在所谓的“闭合钳”形式，防止串联的姐妹双链体被解析。我们在双胸苷同步前耗尽HeLa细胞中的PIASγ，然后收集从S期阻滞释放后在有丝分裂中停滞的细胞。如中所述图4Cdk抑制剂roscovitine或Aurora B抑制剂ZM447439使这些有丝分裂细胞分离出大多数姐妹染色单体，然后将其分离到纺锤体两极，这表明姐妹染色单体内聚力已基本消除。如果PIASγ缺失的有丝分裂细胞具有将姐妹DNA分子连接在一起的连环，那么抑制拓扑异构酶II应该会阻止罗斯科汀或ZM447439处理后的姐妹分离。我们与ICRF-193同时向缺乏PIASγ的有丝分裂细胞中添加了roscovitine（数据未显示）或ZM447439，并制备了细胞学样品。令人惊讶的是，拓扑异构酶II的抑制完全阻断了所观察到的每个细胞的姐妹染色单体分离。在这些条件下，拓扑异构酶II是姐妹分离所必需的，这表明在PIASγ缺失的中期阻滞细胞中确实存在连环(图6A–E ).

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图6

在缺乏拓扑异构酶II活性的PIASγ缺失细胞中，姐妹染色单体不能分离。

收集PIASγ耗尽的中期阻滞细胞，如图4然后添加Aurora B抑制剂ZM447439和拓扑异构酶II抑制剂ICRF-193，并采集样本进行细胞学分析。(A类)中期；(B、 C、D)在有丝分裂后期和随后退出时姐妹分离失败。在B类和C类姐妹染色单体仍然可以观察到粘连，而染色质基本上是去致密的（双箭头）。相比之下，在ZM447439单独存在的情况下，小的插入面板显示中期（最左侧面板）和后期（右侧两个面板）。(E类)添加ZM447439后姐妹细胞能够分离的细胞频率，有或没有ICRF-193。(F–I型)表达H2B-GFP的HeLa细胞中拓扑异构酶IIα的免疫染色（插入物显示同一显微照片中的选定区域略有扩大）。(F–I型)Merge-拓扑异构酶IIα（红色）和H2B-GFP（绿色）。(F′–I′)仅拓扑异构酶IIα染色。(F′′–I′′)仅H2B-GFP。(F–G公司)控制有丝分裂细胞，显示拓扑异构酶IIα定位于核心并集中于着丝粒区域；(H（H）)染色质上弥漫定位拓扑异构酶IIα的PIASγ缺失有丝分裂细胞；(我)带有拓扑异构酶IIα的PIASγ缺失有丝分裂细胞定位于细胞核，但在着丝粒区域没有强烈富集。(J型)对照细胞和PIASγ缺失有丝分裂细胞中拓扑异构酶IIα和INCENP免疫染色模式的分类。“动粒”和“核心&动粒”类别要求拓扑异构酶IIα强烈集中在着丝粒区域。

纺锤组件检查点是否监控着着丝粒DNA的十年化能力？

PIASγ耗竭后有丝分裂过程的动力学揭示了检查点激活的典型特征：首先，细胞延迟到下一个细胞周期阶段（与对照组相比，中期延长）；第二，延迟可以被自发地（如延时电影中所见）和化学处理（极光B抑制、Cdk抑制）所覆盖；第三，覆盖检查点揭示了检查点可能要避免的缺陷（化学覆盖后出现后期染色质桥，自发覆盖后出现滞后染色体和异步后期）。

我们的数据表明，如果没有PIASγ，由于Aurora B和Mad2依赖性检查点的激活，细胞在有丝分裂过程中会被阻断。以前关于极光B在纺锤检查点控制中的作用的研究表明，极光B有助于感知和/或纠正单极定向染色体和亚甲基附着的动粒。我们尚未确定在PIASγ缺失后触发检查点激活的确切分子事件，但在基于染色体扩散、CENP-E免疫放大和活细胞成像的细胞学水平上，我们无法在中期染色体比对之前检测到有丝分裂缺陷。在缺乏PIASγ的细胞中，所有染色体都朝向中期板，这就降低了染色体单极取向和可能的亚基附着是检查点激活的原因的可能性。大多数缺乏PIASγ的HeLa细胞进入中期，动力学与对照细胞无明显区别，然后在中期阻滞较长时间（平均为正常中期长度的2.5倍）。在这些通过时间推移分析拍摄的中期细胞中，中期板的典型运动与对照细胞一样发生，可能表明纺锤体和运动功能正常。事实上，所有染色体在中期板上的正确排列意味着正确的动粒、纺锤体和运动行为以及每条染色体上的适当张力。我们能够为PIASγ缺失细胞中的唯一分子缺陷提供证据的是，不能去除着丝粒连环，并且在着丝粒区域（以及一些细胞中的有丝分裂染色体核心）缺乏拓扑异构酶II定位。因此，后期检查点可能是为了响应持续的着丝粒连环或无法有效删除这些连环而诱导的。其他研究也支持这一模型，因为在后期发病之前，抑制拓扑异构酶II（唯一能使DNA十进制化的酶）会导致中期检查点延迟[26]–[28].

在有丝分裂过程中发生的姐妹染色单体的分离爪蟾鸡蛋提取系统也依赖于PIASγ。但在这个体外系统中，缺乏PIASγ不会导致中期阻滞延长，正如我们在缺乏PIASβ的HeLa细胞中观察到的那样[15]这种差异可能只是反映了鸡蛋提取系统的局限性，或者更有趣的是，这意味着爪蟾胚胎样细胞周期缺乏激活检查点以应对PIASγ缺失的能力。

细胞学

如前所述，在细胞学分析中，用制备的Carnoy’s和染色体涂片固定细胞，或用多聚甲醛进行免疫染色[13]抗体：抗CENP-E，1∶250稀释（Immuquest）；抗myc，1∶1000稀释（Gramsch Laboratories）；抗拓扑异构酶IIα，1∶1000稀释（CalBiochem）。在表达myc标记的Rad21的细胞中观察到Rad21[49]量化细胞表型时，每个样本至少计数1000个细胞。使用蔡司Axioplan2显微镜、alpha-Plan Fluar 100×/1.45 n.a.物镜和Axiovision软件（蔡司）AxioCam MRC5相机获取显微照片。

生物化学

如前所述获得全细胞提取物并进行蛋白质印迹[13]使用以下抗体：抗hRad21（Abcam，1∶1500）、抗hShugosin（Adrian Salic和Tim Mitchison，哈佛医学院，1∶1000）、一抗细胞周期蛋白B1（1：抗，抗组织细胞，抗的结果，一的时候的（制备抗）。

我们感谢R Johnson和K Evenson使用设施，感谢K Sullivan、A Salic、T Mitchison、AstraZeneca、S Taylor、J Peters、H Yu和H Zou提供试剂，感谢克拉克实验室成员进行有益的讨论。