跳到主要内容
访问密钥 NCBI主页 MyNCBI主页 主要内容 主导航
细胞生物学杂志。2003年11月10日；163(3): 477–487.
数字对象标识：10.1083/jcb.200304088
预防性维修识别码：项目经理2173648
PMID：14597774

SUMO-2/3在有丝分裂中调节拓扑异构酶II

Yoshiaki Azuma先生，阿列克谢·阿尔纳乌托夫、和玛丽·达索
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

我们分析了细胞周期中SUMO结合物种的丰度爪蟾鸡蛋提取物。与有丝分裂染色体相关的主要SUMO结合产物来自拓扑异构酶II的SUMO接合。正常情况下，在有丝分裂期间，拓扑异构酶II仅被SUMO-2/3修饰，尽管我们观察到提取物中拓扑异构酶II与SUMO-1蛋白结合。SUMO结合酶Ubc9（dnUbc9）的显性负突变体对SUMO修饰的抑制并没有明显改变拓扑异构酶II的活性，但它确实增加了高盐洗涤后保留在有丝分裂染色体上的未修饰拓扑异构酶II的数量。dnUbc9并没有破坏浓缩有丝分裂染色体的组装或通过有丝分裂阻止提取物的进展，但它确实阻止了姐妹染色单体在中期-后期的分离。总之，我们的结果表明SUMO结合对后生动物系统中的染色体分离很重要，有丝分裂染色质中拓扑异构酶II的活化可能是这种修饰的关键靶点。

关键词：拓扑异构酶Ⅱ；SUMO-1；SUMO-2；有丝分裂；染色体分离

介绍

SUMO家族蛋白是与泛素相关的小蛋白，以类似于泛素的方式与细胞底物结合。哺乳动物中有三种SUMO亚型。其中两种亚型SUMO-2和-3的序列非常相似（加工后的亚型之间的同源性为96%）。在本报告中，当这些亚型无法明确区分时，我们将SUMO-2和SUMO-3统称为SUMO-2/3。SUMO-1更为独特，与其他两种亚型中的任何一种只有～45%的相同。SUMO结合途径类似于泛素结合途径(Hochstrasser，2000年); SUMO蛋白必须经过翻译后处理才能产生COOH末端二甘氨酸基序。经过加工生成共轭形式后，SUMO共轭途径的第一步是在SUMO蛋白及其活化（E1）酶Aos1/Uba2异二聚体之间形成依赖于ATP的硫代酯键。第二步是SUMO蛋白与其结合（E2）酶Ubc9之间形成硫酯键。在最后一步中，通过Ubc9和蛋白连接酶（E3）的协同作用，SUMO蛋白和底物之间形成了一个异肽键。报道了越来越多的SUMO共轭底物，尤其是SUMO-1(梅尔基奥尔，2000年). SUMO-1结合已被证明可以增加稳定性，促进亚细胞再定位或改变不同底物的蛋白质-蛋白质相互作用(Seeler和Dejean，2001年). SUMO-2和-3的细胞作用尚不清楚，SUMO家族成员之间的功能差异也不清楚。

分裂酵母和芽殖酵母分别含有一个单一的SUMO家族蛋白pmt3和Smt3p。这些蛋白质与两种生物体的细胞周期调节有关。在裂变酵母中，pmt3（pmt3） −突变体发生异常有丝分裂，并显示小染色体高频丢失(Tanaka等人，1999年).pmt3（pmt3） −突变体对温度升高、紫外线、DNA损伤剂和复制抑制剂也很敏感。pmt3的E1和E2蛋白突变会导致细胞形态异常、染色体DNA浓缩和/或片段化、微染色体不稳定，甚至在没有辐射治疗的情况下，细胞也会出现“切割”形态(al-Khodaile等人，1995年;Shayeghi等人，1997年). 在芽殖酵母中，抑制Ubc9p合成会阻止细胞周期在G2/M期，稳定细胞周期蛋白并导致具有短纺锤体、单核和完全复制DNA的大芽细胞的积累(Seufert等人，1995年). 此外，芽殖酵母有两种Smt3p异肽酶（Ultp1p和Ultp2p/Smt4p），这两种蛋白质中的任何一种的破坏都会导致细胞周期控制缺陷。温度敏感型ulp1-ts型突变体在G区被捕2/限制温度下细胞周期的M期(Li和Hochstrasser，1999年). 随着在高温下长时间培养，ulp1-ts型突变体最终通过有丝分裂并表现出异常的染色体结构，这与严重的染色体损伤或错位相一致(Li和Hochstrasser，1999年). Ulpp/Smt4p突变体显示质粒和染色体稳定性降低，以及使用DNA损伤剂、DNA复制抑制剂或微管毒素治疗后无法从检查点停止中恢复(Li和Hochstrasser，2000年).

芽殖酵母细胞周期表型的一个潜在原因可能是需要Smt3p修饰拓扑异构酶II（Top2p），以便在后期释放着丝粒凝聚力。SMT3是在一些基因中发现的，这些基因的突变体在中期-后期转换时无法正确分离染色体(Biggins等人，2001年)据报道，ULP2/SMT4是有丝分裂染色体凝聚所需的凝聚素亚基突变的过度表达抑制剂(Strunnikov等人，2001年). 最近，Bachant等人（2002年）检测了在表面贴装4-Δ突变体，发现细胞在中期延迟，染色体沿着纺锤轴异常伸长。对不同染色体位置的姐妹染色单体分离的检测表明，着丝粒内聚力在表面贴装4-Δ突变体。Top2p被认为是导致这种表型的底物之一，因为前2名缺乏Smt3p修饰位点的突变体可以显著抑制表面贴装4着丝粒内聚缺陷。据报道，人类拓扑异构酶IIα和β是与SUMO-1结合的底物，拓扑异构酶II抑制剂刺激这种修饰(Mao等人，2000年). 然而，还没有任何报告表明脊椎动物拓扑异构酶II的细胞周期调控SUMO-1结合。Smt3p或SUMO-1调节拓扑异构酶II的机制尚未在任何生物体中报道。

遗传证据表明拓扑异构酶II在有丝分裂期间的染色体凝聚和分离中起着关键作用(Uemura等人，1987年). 此外，许多观察结果表明，拓扑异构酶II是有丝分裂中凝聚染色体组装的直接必需酶爪蟾鸡蛋提取物；鸡蛋提取物中拓扑异构酶II的缺失阻断了鸡红细胞核染色体的凝聚(Adachi等人，1991年)拓扑异构酶II的化学抑制可防止精子核染色体的重塑和凝结(平野和米奇逊，1993年). 姐妹染色单体分离对拓扑异构酶II的需求可以与它在卵提取物中有丝分裂染色体组装中的作用区分开来，因为VP-16在中期-后期过渡期对拓扑异构酶II的化学抑制阻止了姐妹染色单体分离，尽管VP-16添加之前组装了完整的染色体(Shamu和Murray，1992年). 有丝分裂期间后生动物细胞中拓扑异构酶II的行为一直存在一些争议。早期实验表明拓扑异构酶II与有丝分裂染色体的支架部分紧密相关(Gasser等人，1986年)中期沿染色单体轴分布(恩肖和赫克，1985年). 从这些结果来看，拓扑异构酶II是有丝分裂染色体的主要结构成分。另一方面，拓扑异构酶II的大部分可以在温和、低盐的条件下从有丝分裂染色体中洗脱出来爪蟾鸡蛋提取物，反对它是染色体支架的组成部分的观点(平野和米奇逊，1993年). 最近的活体成像实验表明，拓扑异构酶II在有丝分裂期间在染色体上高度动态(Christensen等人，2002年;Null等人，2002年;Tavormina等人，2002年). 控制拓扑异构酶II与染色体动态结合的机制尚未阐明。

我们使用爪蟾鸡蛋提取物用于检测SUMO结合蛋白中依赖细胞周期的变化。我们发现了一组高摩尔重量、染色质依赖的有丝分裂SUMO物种，其蛋白质序列显示为SUMO结合拓扑异构酶II。正常情况下，在有丝分裂期间，拓扑异构酶II仅被SUMO-2/3修饰，尽管我们可以观察到提取物中拓扑异构酶II与外源SUMO-1蛋白的SUMO-1偶联。在循环提取物中，拓扑异构酶II的SUMO-2/3修饰在中期最大，在后期快速解偶联。利用Ubc9显性负突变体阻断SUMO修饰（dnUbc9=Ubc9-C93S，L97S；Banerjee等人，1995年)未检测到蛋提取物中组装的染色质上拓扑异构酶II的活性发生改变。然而，dnUbc9增加了高盐洗涤后保留在有丝分裂染色体上的未修饰拓扑异构酶II的量。dnUbc9没有通过有丝分裂阻止循环提取物的进展，也没有改变有丝分裂抑制提取物中浓缩染色体的组装。相比之下，dnUbc9在中期-后期转换中明显干扰了姐妹染色单体的分离。总之，这些发现表明SUMO-2/3结合不会显著改变拓扑异构酶II的酶活性，但这种修饰对于有丝分裂染色体上拓扑异构酶II在中期-后期过渡的重塑是重要的。当SUMO结合被阻断时，这种重构的失败显然在染色体错位中起着重要作用。

结果

SUMO-1结合在细胞周期中的调控

我们试图使用爪蟾鸡蛋提取物作为模型系统，研究SUMO结合与细胞周期进展之间的关系。我们检测了SUMO-1结合蛋白在细胞周期中的分布。为了在本实验中提高SUMO-1结合的整体水平，我们添加了重组His6-将SUMO-1（His-SUMO-1）标记为减数分裂阻滞细胞抑制因子（CSF）提取物。然后通过添加CaCl将CSF提取物释放到间期2并在间期和有丝分裂之间自发振荡(图1;Kornbluth等人，2001年). 我们使用亲和纯化的抗SUMO-1抗体，通过Western blot分析在不同点检测SUMO-1结合蛋白的光谱。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f1.jpg

有丝分裂底物的染色质依赖性SUMO结合。脑脊液提取物补充有组氨酸标记的SUMO-1（最终浓度30 ng/μl）和指定数量的精子核。在凝缩中期染色体形成后（反应开始后90分钟），通过添加0.6 mM CaCl将CSF阻滞释放到间期2用亲和纯化的抗SUMO-1抗体通过Western blotting分析整个反应过程中的SUMO-1结合蛋白谱。在含有10000个精子核/μl的反应中观察到一系列强M相特异性SUMO-1结合物（底部用星号表示）。在含有1000个精子核/μl的反应中，也可以微弱地观察到这些条带，但在无核反应中则没有。这些条带在提取物进入间期后消失。这些特征表明，这些条带是由有丝分裂底物以染色质依赖的方式修饰而成的。

在减数分裂阻滞释放CSF提取物之前，我们观察到一系列高摩尔重量共轭物种(图1，底部；用星号表示）。这些共轭物种以>200kD的迁移率迁移，并且在提取物通过添加CaCl进入相间后迅速消失2我们可以立即确认这些带是由SUMO-1结合产生的，因为它们可以通过添加SUMO-1 E2蛋白的显性负形式Ubc9（dnUbc9=Ubc9-C93S，L97S；Banerjee等人，1995年). 这些共轭产物的行为特别显著，因为它们的外观完全取决于反应中染色质的存在(图1，比较顶部面板和底部面板）。因此，我们选择进一步调查他们的身份和监管。

拓扑异构酶II通过与SUMO-2/3的偶联进行修饰

为了确定M期发现的～200-kD共轭物种的起源，我们准备了一个大规模的脑脊液提取反应，其中添加了高浓度的精子核和His-SUMO-1。培养60分钟后，我们通过离心对染色质相关蛋白进行粗分离。我们通过Western blotting观察到，所需物种与DNA分离（未发表的数据）。将染色质部分的His-SUMO-1偶联蛋白溶解在含有8M尿素的缓冲液中，并使用金属亲和色谱对回收的部分进行进一步纯化。银染后，所得部分显示出一组清晰的条带，在适当的摩尔重量范围>200 kD，这些条带在蛋白印迹上被抗SUMO-1抗体强烈识别。这些条带在哈佛微化学设施（马萨诸塞州剑桥）进行分离并进行蛋白质测序。蛋白质序列分析表明，这些缀合物种来源于拓扑异构酶II的His-SUMO-1缀合。

为了证实拓扑异构酶II在没有外源性His-SUMO-1的情况下被SUMO-1偶联修饰，我们用抗拓扑异构酶II抗体进行Western blotting分析了含有或不含有外源性SUMO-1或dnUbc9的CSF鸡蛋提取物(图2A；卢克和博根哈根，1989年). 针对拓扑异构酶II的抗体在存在或不存在外源性SUMO-1蛋白的情况下识别出一系列条带。与这些谱带是由SUMO-1共轭产生的想法一致，它们被添加dnUbc9而废除(图2A、 左）。然而，我们惊讶地发现，在缺乏外源性SUMO-1蛋白的情况下，抗SUMO-1的抗体不能识别对应于共轭拓扑异构酶II的任何条带(图2A、 中间）。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f2.jpg

DNA拓扑异构酶II在M相提取物中被SUMO-2/3修饰。（A） 含有10000个精子核/μl的脑脊液提取物在23°C下孵育60分钟，添加或不添加外源性30 ng/μl His-SUMO-1或150 ng/μl dnUbc9。用抗-爪蟾拓扑异构酶II、抗SUMO-1和抗SUMO-2/3抗体。（B） 将含有10000个精子核/μl的脑脊液提取物在23°C下孵育60分钟。反应被拆分，通过添加0.6 mM CaCl，一半被驱动到界面2每个反应在23°C下再培养30分钟。如材料和方法中所述，从有丝分裂和间期提取物中分离染色质。用以下抗体对染色质进行Western blotting：（1）单克隆抗人拓扑异构酶IIα/β（DNATop2AB）；（2） 单克隆抗人拓扑异构酶IIα；（3） 多克隆抗人拓扑异构酶IIα；（4） 反–爪蟾拓扑异构酶Ⅱ；和（5）抗SUMO-2/3。注意，拓扑异构酶IIα基本上是鸡蛋提取物中拓扑异构酶II的唯一形式。（C） 将含有指定数量精子核/μl的脑脊液提取物在23°C下孵育60分钟。将等量的分离染色质进行SDS-PAGE，并使用抗SUMO-2/3和抗异构酶II抗体进行Western blotting分析。星号表示所有面板中存在SUMO结合形式的拓扑异构酶II。

因为SUMO-1与其他脊椎动物SUMO家族成员、SUMO-2和SUMO-3共享E2酶(梅尔基奥，2000年)，我们检查了它们是否可能与拓扑异构酶II结合。SUMO-2和-3的氨基酸序列密切相关（96%的加工形式相同），而SUMO-1和SUMO-2或-3之间的同源性更为有限（～45%）。我们用亲和纯化的多克隆抗SUMO-2/3抗体对相同样本进行了Western blotting。在不含外源蛋白的提取物的Western blot上，抗SUMO-2/3抗体识别与抗异构酶II识别的条带相对应的条带(图2A、 右侧）。与拓扑异构酶II与SUMO-2/3结合产生这些条带的想法一致，含有dnUbc9的提取物的Western blot中没有这些条带。此外，在含有外源SUMO-1的提取物的Western blot中，这些条带急剧减少，这表明当SUMO-1存在于高于正常生理浓度时，它可以直接与SUMO-2/3竞争与拓扑异构酶II的结合。检查拓扑异构酶II与EGFP标记的SUMO-2和SUMO-3在CSF提取物中与精子细胞核的结合的额外实验表明，在该反应中可能对SUMO-2有强烈的偏好（图S1，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200304088/DC1). 获得能够区分内源性SUMO-2和-3的试剂，以在不受干扰的条件下证实这一结论，显然将是未来的兴趣所在。

因为我们早期的结果表明，外源添加的SUMO蛋白有能力扭曲底物修饰的正常模式，所以我们希望分析未扰动提取物中SUMO-2/3与拓扑异构酶II的结合，仅依赖内源蛋白。首先，我们希望确认拓扑异构酶II的修饰是否仅限于M相。为此，我们比较了从间期和CSF捕获的卵子提取物中分离的染色质上SUMO-2/3偶联的拓扑异构酶II的模式(图2B） ●●●●。用抗SUMO-2/3抗体和四种不同的抗拓扑异构酶II抗体进行Western blot分析表明，拓扑异构酶II的共轭形式仅存在于脑脊液提取物的染色质部分，这使我们得出结论，这种修饰确实具有M相特异性。接下来，我们检测了结合拓扑异构酶II的水平，作为添加精子染色质的函数(图2C） 。当我们通过蔗糖垫离心分离，从含有不同初始精子染色质浓度的反应中纯化染色体时，很容易观察到SUMO结合对染色质相对浓度的依赖性。当每个反应产生的相同浓度的精子染色质被加载到Western blot的相邻通道中时，拓扑异构酶II–SUMO-2/3的量基本相同，与孵化过程中精子染色质的初始浓度无关(图2C） 。这些数据表明，精子染色体具有特定的饱和能力来生成和/或稳定拓扑异构酶II–SUMO-2/3结合物。

总之，我们的结果表明，拓扑异构酶II以M相和染色质依赖的方式与SUMO-2/3结合，尽管如果SUMO-1的浓度异常高，它可以在这种结合反应中与SUMO-2-3竞争。

内源性SUMO-2/3对DNA拓扑异构酶II的修饰

为了更密切地研究有丝分裂细胞周期中内源性拓扑异构酶II修饰的时间，我们使用了在间期和有丝分裂之间自发同步振荡的循环提取物(Kornbluth等人，2001年). 我们在反应开始时加入精子染色质，并通过染色体形态（未发表的数据）、细胞周期蛋白B丰度和ERK1磷酸化跟踪细胞周期的进展(图3). 在指定的时间间隔内取等分反应物。从这些等分样品中制备染色质，并使用针对胚胎连接蛋白组蛋白B4的抗体通过Western blotting验证每个时间点的等效染色质回收率（未公布的数据；Dasso等人，1994年). 染色质相关拓扑异构酶II的修饰状态通过抗拓扑异构酶II和抗SUMO-2/3抗体的Western blotting测定。染色体形态检查表明，提取物在～65分钟进入有丝分裂，后期开始于～80分钟。这一时间点由细胞周期蛋白B降解和ERK1磷酸化的特征证实。在使用抗拓扑异构酶II抗体的Western blot上，我们观察到拓扑异构酶II结合的最大水平出现在中期的～75分钟，接近细胞周期蛋白B积累的最大水平。随着提取物通过中期-后期过渡，共轭物种的水平迅速下降，我们在染色体组分中95分钟内未检测到共轭拓扑异构酶II。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f3.jpg

拓扑异构酶II在未受干扰的循环提取物中的有丝分裂期间被SUMO-2/3修饰。 爪蟾循环卵子提取物补充2000个精子核/μl，并在23°C下培养。在指定时间从提取物中提取样品。每个样品的等分样品直接进行SDS-PAGE和Western blotting分析，以确定细胞周期蛋白B丰度（第四组）和磷酸化ERK1水平（底部）。按照材料和方法中的描述，从每个时间点采集的样品中分别制备染色质。用抗拓扑异构酶II（顶部）、SUMO-2/3（第二组）和SUMO-1（中部）抗体进行Western blotting分析染色质制剂。在添加Hoechst 33342 DNA染料（未描述）后，也在指定时间取出等分样品，并分析DNA形态。我们在反应开始后75分钟观察到中期染色体浓缩，85分钟观察到后期染色体浓缩。

用抗SUMO-2/3抗体进行Western blot分析表明，染色体组分中主要的SUMO-2/3-结合物种以与SUMO-2+3-修饰拓扑异构酶II相同的摩尔重量迁移，并遵循相同的丰度模式，支持拓扑异构酶II在后期开始前立即发生最大修饰的结论。相反，当我们用抗SUMO-1抗体检测染色体组分时，我们发现有丝分裂期间SUMO-1结合显著下调。相反，我们观察到SUMO-1共轭物种在相间积累。值得注意的是，主要修饰拓扑异构酶II物种的迁移与主要SUMO-1结合产物之间从来没有密切的对应关系。

这些发现进一步说明了SUMO-2/3修饰拓扑异构酶II在未扰动卵提取物细胞周期中的特异性和染色质依赖性，并表明SUMO-1不是循环提取物中拓扑异构酶II的主要修饰物。此外，该实验记录了拓扑异构酶II在正常条件下的后期和去偶联之间的密切一致性。

SUMO-2/3修饰调节拓扑异构酶II的染色质动力学

接下来，我们研究了SUMO-2/3的修饰是否显著改变有丝分裂拓扑异构酶II的生物化学行为或染色质关联。我们从含有或不含dnUbc9的鸡蛋提取物中产生的有丝分裂染色体中提取拓扑异构酶。这使我们获得了以SUMO结合形式富集的拓扑异构酶II的制剂(图4B、 至20%修饰）和未修饰拓扑异构酶II的类似制剂。当我们测量这些动粒体DNA十年制备物的活性时，它们的活性水平无法区分(图4A） ●●●●。这些结果并没有消除SUMO-2结合可能抑制拓扑异构酶II的可能性，因为该分析不够敏感，无法检测到拓扑异构酶II结合亚群的部分抑制。然而图4与SUMO-2偶联对拓扑异构酶II活性的剧烈刺激不一致。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f4.jpg

dnUbc9不会改变爪蟾拓扑异构酶II。（A） 从含有或不含有150 ng/μl dnUbc9的精子染色质中制备染色体蛋白，并按照材料和方法中所述的方法进行测定。对染色体蛋白质进行连续稀释，以便将每条通道中指示的等效体积添加到倾析反应中。为了进行比较，使用纯化的人类拓扑异构酶II进行反应，并显示每个反应的制造商单位数。在标记为D的泳道中加载一个完全十联的标记，在标记为L的泳道上加载一个线性化的标记。标记为0的泳道显示的是来自未添加染色体蛋白的对照反应的动粒体DNA。（B） 染色体洗脱液的Western blot，从没有（左）或有（右）dnUbc9的提取物中提取，用于倾析反应。

为了检测拓扑异构酶II的染色体关联，我们通过蔗糖垫离心分离CSF提取物中形成的有丝分裂染色体。用含有递增浓度NaCl（100、300和500 mM）的缓冲液依次提取染色体颗粒。在以前的一份报告中，发现大部分拓扑异构酶II是通过含有100 mM盐的缓冲液从染色体中释放出来的(平野和米奇逊，1993年)，但我们观察到了略有不同的提取模式；拓扑异构酶II的很大一部分与染色体无关，在染色体后上清液中发现(图5A） ●●●●。该部分拓扑异构酶II未显示SUMO-2/3结合。在我们手中，通过使用含有100 mM NaCl的缓冲液清洗染色体制剂，释放出无法检测到的染色质相关拓扑异构酶II(图5A） ●●●●。尽管在用含有500 mM NaCl的缓冲液提取染色质后，仍有一小部分拓扑异构酶II保留在染色质上，但用含有300 mM NaCl的缓冲溶液洗涤后，大部分拓扑异构酶II从染色质中释放出来。SUMO-2/3–共轭拓扑异构酶II在300-mM NaCl洗涤液的上清液中检测到最丰富。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f5.jpg

SUMO-2/3–修饰的DNA拓扑异构酶II与染色质相关。（A） 将含有10000个精子核/μl的脑脊液提取物在23°C下培养60分钟，并按照材料和方法中的描述从每个反应中分离出染色质。用补充有5 mMβ-甘油磷酸和100、300或500 mM氯化钠的XB缓冲液提取染色质。如图所示，对等量的所有组分进行SDS-PAGE和Western blotting，并使用抗异构酶II抗体。（B） 在没有或存在dnUbc9（+dn；150 ng/μl）的情况下，将含有10000个精子核/μl的脑脊液提取物在23°C下培养60分钟。按照材料和方法中的描述，从每个反应中分离出染色质。如上所述提取染色质，并对300-mM NaCl提取液（每个面板中的左两个通道）、500-mM NaCl萃取液（每个板中的中间两个通道具有抗拓扑异构酶II和抗SUMO-2/3抗体。（C） 在有无dnUbc9的情况下，在23°C的CSF提取物中组装有丝分裂染色体60分钟。染色体为低盐（CSF-XB）或高盐（CSF-XB+200mM NaCl）缓冲液，并用单克隆抗人拓扑异构酶IIα/β抗体染色，如材料和方法中所述。用Hoechst 33342可视化DNA。使用相同的暴露时间拍摄所有拓扑异构酶II免疫荧光图像。

我们检测了改变染色体拓扑异构酶II的SUMO-2/3修饰是否可以改变其提取行为。为此，我们从含有和不含dnUbc9的CSF提取物中制备染色质样品，并从这些样品中检测拓扑异构酶II的盐萃取行为(图5B） ●●●●。在这些实验中，可以任意区分染色质上拓扑异构酶II松散结合（在300-mM NaCl洗涤液中提取）的亚群和紧密结合（在500-mM NaCl洗涤液的上清液和颗粒中发现）的亚群体。如果SUMO-2/3偶联不影响拓扑异构酶II在松散和紧密结合组分之间的分配，则dnUbc9的添加预计不会改变拓扑异构酶II的萃取行为。然而，如果SUMO-2/3结合在不可抑制拓扑异构酶II亚群转化为可提取形式中起到了机械作用，则dnUbc9将导致紧密结合形式的增加。值得注意的是，dnUbc9的存在显著增加了300-mM NaCl萃取后留在染色质上的拓扑异构酶II的数量(图5B、 右侧）。这一观察结果显然支持后一种可能性。

作为另一种检测dnUbc9影响拓扑异构酶II与染色体结合能力的方法，我们使用抗拓扑异构酶II抗体通过免疫荧光检测提取的染色质。与我们的生化观察结果一致，高水平的拓扑异构酶II仍然与用CSF-XB缓冲液（100 mM KCl）提取的染色质有关，但用CSF-XXB缓冲液加200 mM NaCl处理后染色水平低得多（最终盐浓度=200 mM氯化钠+100 mM氯化钾；该缓冲液称为高盐CSF-XB；图5C） 。值得注意的是，尽管拓扑异构酶II在CSF-XB洗涤后的染色质上的分布相对均匀，但用高盐CSF-XB洗涤后残留的拓扑异构酶II呈点状。

在整个染色体组装反应中，dnUbc9的存在并没有改变在任何盐浓度下洗涤的染色体的形态。当用CSF-XB缓冲液进行提取时，装配有或没有dnUbc9的染色体的染色显示出非常相似的模式，拓扑异构酶II的分布与DNA的分布密切相关(图5C、 左侧面板）。相比之下，dnUbc9显著增加了与高盐CSF-XB洗涤染色质相关的拓扑异构酶II的数量(图5C、 右侧面板）。增强染色不均匀，但清晰地分布在整个染色体上的明亮病灶中，表明dnUbc9增加了拓扑异构酶II特定亚群的特异性保留。结合我们的生化数据，这些发现强烈表明SUMO-2/3修饰可以改变拓扑异构酶II的染色质结合特性，促进紧密结合的拓扑异构酶II转化为低亲和力形式。

SUMO接合是有丝分裂染色体正确分离所必需的

我们的观察表明，拓扑异构酶II的一些紧密染色质相关形式与SUMO-2/3结合，以促进其转化为低亲和力形式。这种转化可能涉及从染色质中去除紧密结合的拓扑异构酶II，或其在染色体上的重塑。为了测试拓扑异构酶II和其他潜在底物的有丝分裂SUMO修饰的生物学作用，我们评估了dnUbc9对循环和脑脊液提取物的影响。在循环抽提物中，添加dnUbc9对精子染色质去凝聚、细胞核形成、DNA复制或抽提物进入有丝分裂没有明显影响（未公布的数据）。此外，在存在或不存在dnUbc9的情况下，在循环或脑脊液提取物中组装的有丝分裂染色体的形态之间没有任何一致的差异。这些发现表明，这些过程都不需要SUMO共轭。相比之下，我们发现在含有和不含dnUbc9的循环提取物中，染色体在中期-后期转变时的行为存在显著差异。虽然在发病后期，我们可以在对照提取物中持续观察到分离的姐妹染色单体，但在含有dnUbc9的提取物中，我们没有观察到染色体分离（未发表的数据）。尽管含有dnUbc9的提取物中没有任何明显的姐妹染色单体分离，但提取物从有丝分裂中发展出来，并与对照提取物同步形成细胞核。

这一发现促使我们在能够精确控制中期-后期转变开始的条件下评估姐妹染色单体分离(图6). 为此，我们使用CaCl将脑脊液提取物注入间期2将精子染色质添加到该提取物中，使其形成细胞核并进行一轮完整的DNA复制。然后加入新鲜的脑脊液提取物将提取物驱回有丝分裂状态，此时加入dnUbc9(图6A） ●●●●。在加入CSF提取物30分钟后评估纺锤体组装，我们没有发现有或没有dnUbc9的反应之间的区别，这再次表明dnUbc9不会破坏染色体凝聚、与纺锤体的附着或中期板上的排列。与未复制染色质相同(图5B） ，通过用含有300mM NaCl的缓冲液洗涤从复制的染色质中提取大部分拓扑异构酶II，尽管即使在用含有500mM NaCl的缓冲液提取染色质后，也有一小部分拓扑异构酶II保留在染色质上（图S2，可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200304088/DC1). 当用新鲜脑脊液提取物诱导有丝分裂时，添加dnUbc9后，拓扑异构酶II在不可萃取部分的分布增加。

保存图片、插图等的外部文件。对象名为200304088f6.jpg

有丝分裂中SUMO结合的扰动导致染色体分离缺陷。（A） 染色体分离分析示意图。补充罗丹明标记微管蛋白的脑脊液提取物被CaCl释放到间期2添加。在CaCl后5分钟添加2000个精子/μl2，并将提取物在23°C下培养55分钟。通过添加新鲜CSF提取物（反应体积的50%）和或不添加dnUbc9（最终浓度150 ng/μl）诱导重新进入有丝分裂。在23°C下孵育30分钟后，第二次添加CaCl诱导后期2（B）在指定时间取出等分样品，并使用Hoechst 33342 DNA染料（绿色）分析DNA形态，并在固定后分析微管结构（红色）。（C） 实验如上所述进行，添加了35第二等分CSF提取物时的S标记证券素。对每个时间点的样品进行SDS-PAGE分离，并使用分子动力学磷光成像仪进行放射自显影。（D） 从带有或不带有dnUbc9的反应中分离出有丝分裂染色质，并用抗SUMO2/3和抗反异构酶II抗体进行Western blotting分析。

当第二等分CaCl2添加到含有或不含dnUbc9的反应中，它们同步进行有丝分裂外，如有丝分裂后期产物保护复合物（APC）底物securin和cyclin B的降解所示(图6C类；未发布的数据）。这一观察结果表明，dnUbc9不抑制APC或导致任何非特异性的M期进展延迟。对对照反应的观察显示，数字清楚地表明CaCl作用10分钟内姐妹染色单体分离2添加。然而，值得注意的是，在含有dnUbc9的反应中，即使经过相当长的培养时间（>15分钟；图6B） ，清楚地表明SUMO结合对姐妹染色单体分离至关重要。该表型与先前的报告惊人地相似，其中拓扑异构酶II毒物VP-16在中期-后期过渡期被添加到鸡蛋提取物中(Shamu和Murray，1992年).

总之，我们的结果表明，存在少量与有丝分裂染色体紧密相关的拓扑异构酶II，通过与SUMO-2/3结合，拓扑异构酶II被动员以释放染色质或重塑染色体。当SUMO结合被dnUbc9阻断时，姐妹染色单体分离是有缺陷的，这表明这种动员以及SUMO接合调节的其他事件对有丝分裂期间正确的染色体分配至关重要。此外，在有丝分裂过程中，拓扑异构酶II的SUMO-2/3修饰在时间上受到严格调控，这表明拓扑异构酶II的动员时间是与其他有丝分裂事件相协调的。

讨论

我们使用爪蟾鸡蛋提取物。这些实验已经得出了一些显著的发现。首先，我们发现拓扑异构酶II是有丝分裂染色质相关SUMO结合的主要靶点。拓扑异构酶II的SUMO-2/3修饰直接依赖于染色质，并在时间上受到严格调控。SUMO-2/3–共轭拓扑异构酶II的浓度在细胞周期蛋白B降解开始前立即达到最高水平。其次，我们发现一小部分染色质相关拓扑异构酶II对通过盐洗从染色体中提取具有抵抗力，这表明它与有丝分裂染色体的关系比拓扑异构酶II的大部分更紧密。随着dnUbc9对SUMO结合的抑制，抗萃取拓扑异构酶II的数量增加，这表明SUMO-2/3修饰在从不可抑制的亚群中动员拓扑异构酶II方面起着重要作用。最后，我们发现在M期特异性阻断SUMO修饰导致后期染色体分离缺陷。该缺陷与在中后期过渡时加入拓扑异构酶II毒素VP-16时观察到的缺陷非常相似(Shamu和Murray，1992年).

拓扑异构酶II在正常情况下的有丝分裂过程中仅被SUMO-2/3修饰(图2). 不同SUMO亚型之间的这种区别值得注意，原因有二。首先，关于SUMO-1、-2和-3之间的功能差异的研究很少。我们的数据表明，使用这三种SUMO同种型具有很强的细胞周期特异性，因此SUMO-1缀合物在卵子提取物的间期中占主导地位，而SUMO-2/3缀合物在有丝分裂期间占主导地位。虽然我们还不了解这种细胞周期偏好的分子基础，但我们发现拓扑异构酶II的SUMO-2/3结合在中期受到有丝分裂激酶的严格控制（未发表的数据）。这种调节表明，拓扑异构酶II与SUMO-2/3的结合与有丝分裂期间发生的其他事件密切相关。第二，当外源SUMO-1添加到生理水平以上时，它有能力与有丝分裂提取物中的拓扑异构酶II结合，这表明它可以替代正常对照物，调节有丝分裂期间的异构体选择性。鉴于这些蛋白质共享一组共同的激活酶和结合酶，特异性的丧失可能是由于SUMO亚型之间的直接竞争造成的。SUMO-1与拓扑异构酶II竞争有丝分裂结合的能力增加了先前报道为SUMO-1底物的其他蛋白质可能更典型地被SUMO-2或-3修饰的可能性。

一些研究结果表明，拓扑异构酶II不需要SUMO-2/3偶联来实现其解链活性。首先，即使在有丝分裂高峰期，也只有一部分拓扑异构酶II被SUMO-2/3修饰(图3). 在大多数染色体制备中，Western blotting显示约20%的拓扑异构酶II转化为SUMO修饰形式(图2B） 虽然很难精确定量修饰的拓扑异构酶II的分数，因为不同的抗体似乎以不同的效率识别SUMO-2/3共轭拓扑异构酶II。更重要的是，我们使用dnUbc9阻断了循环和脑脊液提取物中的所有SUMO结合，并且我们证实了dnUbc8在阻断拓扑异构酶II的SUMO-2/3结合方面是高效的(图2). 这些反应产生的染色质制剂被用作进一步纯化拓扑异构酶II的来源。我们发现，来自带有或不带有dnUbc9的染色质的拓扑异构酶II对动粒体DNA的解链具有无法区分的活性水平(图4). 最后，我们使用不添加dnUbc9的提取物分析了核组装、核转运、DNA复制、有丝分裂染色体凝聚、有丝染色体结构和纺锤体组装(图6; 未发布的数据）。在这些分析中，我们没有发现含有或不含dnUbc9的提取物之间的差异。尽管其中许多过程需要拓扑异构酶II活性，但它们显然不需要拓扑异构酶II或其他底物的从头SUMO偶联。

相比之下，dnUbc9破坏了鸡蛋提取物中中期-后期的染色体分离(图6). 很明显，许多底物缺乏结合可能是导致这种表型的原因。然而，一些观点认为，结合拓扑异构酶II的失败以及由此导致的未能促进其分裂为亲和力较低的部分可能是导致染色体分离缺陷的关键因素：首先，拓扑异构酶II是有丝分裂染色体上SUMO结合最丰富的靶点(图3). 第二，拓扑异构酶II毒物，如VP-16，导致滞留的拓扑异构酶II-DNA复合物的积累，产生与dnUbc9非常相似的染色体分离缺陷(图6;Shamu和Murray，1992年). 值得注意的是，不会导致滞留拓扑异构酶II–DNA复合物积聚的拓扑异构酶II抑制剂，如Merbarone(《财富》（Fortune）和《奥舍洛夫》（Osheroff），1998年)，不阻止染色体分离，尽管它们在十年期检测中产生了相当程度的抑制（未公布的数据）。最后，与我们的结论一致，SUMO结合调节鸡蛋提取物中的染色体分离，Smt3p结合在表面贴装4-芽殖酵母的Δ突变体可促进着丝粒内聚力的过早丧失(Bachant等人，2002年).前2名缺少Smt3p修饰位点的突变体可以抑制这种缺陷，这表明Top2p是一种主要底物，其与Smt3p的结合可以改变内聚性。

重新评估拓扑异构酶II在有丝分裂染色体上的作用可能是合适的。最初认为拓扑异构酶II是紧密结合的染色体支架的一部分(恩肖和赫克，1985年)，但这一观点被一项观察所推翻，即大部分拓扑异构酶II可以从体外组装的染色体中去除，而染色体结构不会发生显著变化(平野和米奇逊，1993年). 最近的证据表明，大多数拓扑异构酶II在有丝分裂染色体上是非常动态的(Christensen等人，2002年;Null等人，2002年;Tavorina等人，2002年)也反对拓扑异构酶II作为染色体支架的静态作用。另一方面，我们发现有少量拓扑异构酶II与有丝分裂染色质紧密结合，即使在500-mM含NaCl的缓冲液中提取后也能保留下来。dnUbc9扩大了这个群体，表明SUMO-2/3结合负向控制拓扑异构酶II分配到如此紧密结合的形式。我们的发现提出了一个有趣的想法，即拓扑异构酶II的这种小而高亲和力的部分可能作为姐妹染色单体之间动态系链的一部分，并且在中期-后期转换中其去除可能是染色体分布到子细胞中的一个重要事件。

材料和方法

重组蛋白和抗体

突变的人类Ubc9的细菌表达和产生如前所述(Saitoh等人，1998年;Azuma等人，2001年). dnUbc9与之前描述的cdc34突变相似，cdc34与泛素形成稳定的氧酯，因此不能将泛素转移到E3酶或结合底物(Banerjee等人，1995年). 为了生产人类形式的His-SUMO-1（加工形式），将SUMO-1编码序列亚克隆到pET30载体中，并在大肠杆菌通过Talon（Contac）和Mono Q（Amersham Biosciences）树脂层析纯化His-SUMO-1。全长SUMO-2（GenBank/EMBL/DDBJ登录号。NP_008868.2号)和SUMO-3（GenBank/EMBL/DDBJ登录号。NP_008867.1号)通过PCR从设计用于表达每个蛋白质加工形式的构建物中生成（由日本熊本熊本大学H.Saitoh提供；Saitoh和Hinchey，2000年)，使用编码处理过程中移除的COOH末端延伸的寡核苷酸。加工和全长形式的SUMO-2和-3被克隆到pGEX4T-1中，在其NH处融合2从pEGFP C-1质粒上切下的EGFP片段的末端（CLONTECH Laboratories，Inc.）。根据制造商的协议，使用谷胱甘肽琼脂糖（Amersham Biosciences）纯化GST/EGFP标记的SUMO-2和-3蛋白。通过凝血酶裂解洗脱后，在Mono Q柱上通过色谱进一步纯化蛋白质。

针对加工过的人类SUMO-1（研究遗传学），制备了兔抗SUMO-1多克隆抗体。将未标记的重组SUMO-1（加工形式）与CNBr活化的Sepharose（Amersham Biosciences）偶联，并用于亲和纯化免疫血清中的抗体。兔抗SUMO-2/3的pAb由H.Saitoh提供(Saitoh和Hinchey，2000年). 将未标记的重组SUMO-2（加工形式）与CNBr活化的Sepharose（Amersham Biosciences）偶联，并用于亲和纯化免疫血清中的抗体。鼠标单抗对抗爪蟾cyclin B2由T.Hunt（英国南米姆斯癌症研究所）提供。单克隆抗人拓扑异构酶IIα/β(图2B、 泳道1和2），单克隆抗人拓扑异构酶IIα(图2B、 通道3和4）和兔多克隆抗人拓扑异构酶IIα(图2B、 泳道5和6）购自Research Diagnostics公司爪蟾拓扑异构酶IIα/β(图2B、 车道7和8）如前所述（伊利诺伊大学厄本那-香槟分校P.L.Jones博士提供）；Luke和Bogenhagen，1989年）。除非另有说明，否则使用抗-爪蟾拓扑异构酶IIα/β。抗磷酸化ERK1/2的抗体购自Cell Signaling。

爪蟾鸡蛋提取物与细胞周期分析

爪蟾精子核，低速提取爪蟾卵子被脑脊液截留，循环提取物如前所述制备(Kornbluth等人，2001年). 如图所示，为了观察纺锤体，将罗丹明标记的微管蛋白（Cytosketon，Inc.）添加到0.1 mg/ml的最终浓度。如果反应补充了外源蛋白质，则将蛋白质添加到提取物中，并在冰上孵育5分钟，然后添加精子染色质，并通过将反应转移到23°C开始实验，除非另有说明。在图6，如前所述，对证券的销毁进行了监控(Arnaoutov和Dasso，2003年).

鸡蛋提取物中染色质的分离

为了从脑脊液或循环提取物中制备染色质，用CSF-XB缓冲液（10 mM Hepes-KOH，pH 7.7，100 mM KCl，2 mM MgCl）将每次反应的100μl等分试样稀释五倍2，5 mM EGTA和50 mM蔗糖），含有0.5%Triton X-100，并在室温下培养1分钟。然后将样品分层到含有40%甘油的CSF-XB缓冲垫上，并在10000℃下离心克在4°C下保持10分钟。将颗粒重新悬浮在40%含甘油的CSF-XB中，并重复离心。向所得颗粒中添加50μl SDS-PAGE样品缓冲液，并将样品加热至100°C 5分钟。

染色质结合拓扑异构酶II的制备及酶解分析

用500μl鸡蛋提取物制备染色质，其中含有或不含有150 ng/μl dnUbc9，其中包含10000个精核/μl，如上所述，但洗脱是用100μl XB缓冲液（补充5 mMβ-甘油磷酸盐和300 mM NaCl）代替样品缓冲液进行的。DNA和其他不溶性物质通过20000离心去除克持续15分钟。根据制造商的协议，使用拓扑异构酶II检测试剂盒（TopoGEN，Inc.）对该洗脱液中的染色体后上清液进行动粒体DNA倾析检测。除非另有说明，所有反应在20μl反应中均含有10 ng/μl的动粒体DNA，并在23°C下培养15分钟。在TBE中，用1%琼脂糖凝胶电泳分析倾析试验的产物。为了进行比较，纯化的人类拓扑异构酶II的解链如所示图4.

染色质免疫荧光染色

2000个核/μl精子染色质在脑脊液提取物中孵育60分钟。用CSF-XB缓冲液（低盐）或补充200 mM NaCl（高盐）的CSF-XB缓冲液稀释反应，并在23°C下培养5分钟。通过添加等体积的相同缓冲液和1.6%PFA来固定染色体。在23°C下孵育10分钟后，染色体通过20%的甘油垫旋转到玻璃盖玻片上。染色质用单克隆抗异构酶IIα/β抗体（TopoIIA/B；Research Diagnostics，Inc.）在23°C下以1/200稀释1 h染色，然后用Alexa染色®488–共轭抗鼠IgG（Molecular Probes，Inc.）在23°C下保持1小时。用4μg/ml Hoechst 33342对DNA进行复染后，将样品装入培养基（Vectashield®; Vector Laboratories）并密封。使用荧光显微镜（Axioskop；Carl Zeiss MicroImaging，Inc.）观察标本，其物镜为Plan-neo 63×/12.5或Iris 100×/1.4（Carl Zess-MicroImaging，Inc）。使用由Openlab软件（Improvision）操作的CCD相机（Orca II；Hamamatsu Photonics K.K.）拍摄图像。

在线补充材料

图S1显示，在有丝分裂接合到拓扑异构酶II方面，SUMO-2优于SUMO-3。图S2显示SUMO-2/3修饰的拓扑异构酶II与复制染色质的关联。在线补充材料，请访问http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200304088/DC1.

补充材料

【补充材料索引】

致谢

我们要感谢Rohinton Kamakaka就蛋白质纯化提出的关键建议。我们还感谢彼得·琼斯、久田斋藤和蒂姆·亨特提供抗体和克隆。我们要感谢Dasso小组成员对手稿的批判性评论。

这项工作得到了人类前沿科学计划（Human Frontiers Science Program）对M.Dasso的研究拨款RG0229/1999-M的部分支持。

笔记

本文的在线版本包括补充材料。

本文中使用的缩写：CSF，细胞抑制因子；dnUbc9，Ubc9的显性负突变体；His-SUMO，他的6-标记为SUMO。

工具书类

  • Adachi，Y.、M.Luke和英国Laemmli。1991.体外染色体组装：拓扑异构酶II需要进行缩合。单元格。 64:137–148.[公共医学][谷歌学者]
  • al-Khodaile，F.、T.Enoch、I.M.Hagan和A.M.Carr。1995年葡萄裂殖酵母hus5基因编码正常有丝分裂所需的泛素结合酶。细胞科学杂志。 108:475–486.[公共医学][谷歌学者]
  • Arnaoutov，A.和M.Dasso。2003.Ran GTPase调节动粒功能。开发单元。 5:99–111.[公共医学][谷歌学者]
  • Azuma，Y.、S.H.Tan、M.M.Cavenagh、A.M.Ainsztein、H.Saitoh和M.Dasso。2001.哺乳动物SUMO-1 E1酶的表达和调节。美国财务会计准则委员会J。 15:1825–1827.[公共医学][谷歌学者]
  • Bachant，J.、A.Alcasabas、Y.Blat、N.Kleckner和S.J.Elledge。2002年。SUMO-1异肽酶Smt4通过DNA拓扑异构酶II的SUMO-1修饰与着丝粒内聚力相连。分子细胞。 9:1169–1182.[公共医学][谷歌学者]
  • Banerjee，A.、R.J.Deshaies和V.Chau。1995年。细胞周期泛素结合酶Cdc34的显性阴性突变的特征。生物学杂志。化学。 270:26209–26215.[公共医学][谷歌学者]
  • Biggins，S.、N.Bhalla、A.Chang、D.L.Smith和A.W.Murray。2001.芽殖酵母中姐妹染色单体分离和分离的相关基因酿酒酵母.遗传学。 159：453–470。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Christensen，M.O.、M.K.Larsen、H.U.Barthelmes、R.Hock、C.L.Andersen、E.Kjeldsen、B.R.Knudsen、O.Westergaard、F.Boege和C.Mielke。2002.活细胞中人类DNA拓扑异构酶IIα和IIβ的动力学。《细胞生物学杂志》。 157：31–44。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Dasso，M.、S.Dimitrov和A.P.Wolffe。核组装独立于连接蛋白组蛋白。程序。国家。阿卡德。科学。美国。 91：12477–12481。[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 恩肖、W.C.和M.M.赫克。拓扑异构酶II在有丝分裂染色体中的定位。《细胞生物学杂志》。 100:1716–1725.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 《财富》、J.M.和N.Osheroff。1998年。Merbarone通过阻断DNA裂解抑制人类拓扑异构酶IIα的催化活性。生物学杂志。化学。 273:17643–17650.[公共医学][谷歌学者]
  • Gasser，S.M.、T.Laroche、J.Falquet、E.Boy de la Tour和英国Laemmli。中期染色体结构。拓扑异构酶II的参与。分子生物学杂志。 188:613–629.[公共医学][谷歌学者]
  • Hirano，T.和T.J.Mitchison。1993年拓扑异构酶II在有丝分裂染色体的组织中不起支架作用爪蟾鸡蛋提取物。《细胞生物学杂志》。 120:601–612.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Hochstrasser，M.2000年。泛素样蛋白结合系统的进化和功能。自然细胞生物学。 2：E153–E157。[公共医学][谷歌学者]
  • Kornbluth，S.、J.Yang和M.Powers。2001.细胞周期分析爪蟾鸡蛋提取物。当前细胞生物学协议。J.S.Bonifacino、M.Dasso、J.Lippincott-Schwartz、J.B.Harford和K.M.Yamada，编辑。John Wiley&Sons，Inc.，纽约，11.11.1–11.11.13。
  • Li，S.J.和M.Hochstrasser。1999.酵母细胞周期进展所需的一种新蛋白酶。自然。 398:246–251.[公共医学][谷歌学者]
  • Li，S.J.和M.Hochstrasser。2000.酵母ULP2（SMT4）基因编码一种新的蛋白酶，对泛素样Smt3蛋白具有特异性。分子细胞生物学 20:2367–2377.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Luke，M.和D.F.Bogenhagen。1989年。卵巢癌患者卵母细胞和卵子中II型拓扑异构酶的定量非洲爪蟾.开发生物。 136:459–468.[公共医学][谷歌学者]
  • Mao，Y.、S.D.Desai和L.F.Liu。2000.SUMO-1与人DNA拓扑异构酶II同工酶的结合。生物学杂志。化学。 275:26066–26073.[公共医学][谷歌学者]
  • 梅尔基奥尔，F.2000。SUMO–非经典泛素。每年。Rev.细胞发育生物学。 16:591–626.[公共医学][谷歌学者]
  • Null、A.P.、J.Hudson和G.J.Gorbsky。哺乳动物DNA拓扑异构酶II的α和β亚型都与有丝分裂中的染色体相关。细胞生长差异。 13:325–333.[公共医学][谷歌学者]
  • Saitoh，H.和J.Hinchey。小泛素相关蛋白修饰物SUMO-1与SUMO-2/3的功能异质性。生物学杂志。化学。 275:6252–6258.[公共医学][谷歌学者]
  • Saitoh，H.、D.B.Sparrow、T.Shiomi、R.T.Pu、T.Nishimoto、T.J.Mohun和M.Dasso。1998年。Ubc9p和SUMO-1与RanGAP1和RanBP2的共轭。货币。生物。 8:121–124.[公共医学][谷歌学者]
  • Seeler、J.S.和A.Dejean。2001.SUMO：分支蛋白质和核体。致癌物。 20:7243–7249.[公共医学][谷歌学者]
  • Seufert，W.、B.Futcher和S.Jentsch。泛素结合酶在S期和M期细胞周期蛋白降解中的作用。自然。 373：78–81。[公共医学][谷歌学者]
  • 沙姆、C.E.和A.W.穆雷。青蛙卵提取物中姐妹染色单体的分离需要DNA拓扑异构酶II在后期的活性。《细胞生物学杂志》。 117:921–934.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Shayeghi，M.、C.L.Doe、M.Tavassoli和F.Z.Watts。1997.特征葡萄裂殖酵母rad31，一个UBA相关基因，需要DNA损伤耐受性。核酸研究。 25:1162–1169.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • 斯特伦尼科夫、A.V.、L.Aravind和E.V.Koonin。2001酿酒酵母SMT4编码一种进化上保守的蛋白酶，在染色体凝聚调节中发挥作用。遗传学。 158:95–107.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tanaka，K.、J.Nishide、K.Okazaki、H.Kato、O.Niwa、T.Nakagawa、H.Matsuda、M.Kawamukai和Y.Murakami。1999.多核事件所需的裂变酵母SUMO-1同源物pmt3p的特征，包括端粒长度和染色体分离的控制。分子细胞。生物。 19:8660–8672.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Tavormina，P.A.，M.G.Come，J.R.Hudson，Y.Y.Mo，W.T.Beck和G.J.Gorbsky。2002.有丝分裂中哺乳动物拓扑异构酶IIα在动粒和染色体臂处的快速交换。《细胞生物学杂志》。 158:23–29.[PMC免费文章][公共医学][谷歌学者]
  • Uemura，T.、H.Ohkura、Y.Adachi、K.Morino、K.Shiozaki和M.Yanagida。1987年，DNA拓扑异构酶II是有丝分裂染色体浓缩和分离所必需的S.pombe公司.单元格。 50:917–925.[公共医学][谷歌学者]
文章来自细胞生物学杂志由以下人员提供洛克菲勒大学出版社