结果
新型极光a和极光B抑制剂ZM447439
为了鉴定新型Aurora抑制剂,筛选了约250000种化合物,以抑制重组人Aurora A对人工肽底物的激酶活性。一种经鉴定的抑制剂被进一步改性,以生成ZM447439(4-(4-(N个-苯甲酰氨基)苯胺)-6-甲氧基-7-(3-(1-吗啉基)丙氧基)喹唑啉;A) ●●●●。利用纯化的重组蛋白进行体外激酶检测,ZM447439用IC抑制Aurora A和B50分别为110和130 nM(B) ●●●●。相比之下,ZM447439不抑制其他大多数蛋白激酶。基于模型系统的数据,我们预测极光抑制剂应阻止细胞分裂并抑制组蛋白H3在丝氨酸10上的磷酸化。为了确定ZM447439是否抑制细胞分裂,将一组人类细胞系用2μM ZM447739处理96小时(C) 。18小时后,所有细胞系中绝大多数细胞都含有4N DNA含量。所有分析过的株系都进行了内复制,积累了DNA含量大于4N的细胞,表明ZM447439完全抑制了细胞分裂。为了确定ZM447439是否抑制丝氨酸10上组蛋白H3的磷酸化,未经处理和ZM447739处理的细胞用抗磷酸组蛋白H4抗体染色(Hsu等人,2000年). 在未经处理的细胞中,磷酸组蛋白H3染色阳性的染色体(D) ●●●●。然而,短暂接触ZM447439后,磷酸组蛋白H3未被检测到,这表明ZM447739确实抑制组蛋白H4的有丝分裂磷酸化。与之前的观察结果一致(Adams等人,2001c),组蛋白H3磷酸化的缺乏似乎不会影响染色体的浓缩。
ZM447439抑制极光A和极光B。(A) ZM447439的化学结构。(B) IC显示表50针对一组蛋白激酶的ZM447439值(μM)。(C) 用ZM447439处理HeLa、A549和HME细胞数小时后的DNA含量直方图。(D) 有丝分裂DLD-1细胞磷酸组蛋白H3(绿色)和DNA(红色)染色。
ZM447439诱导的内复制在p53功能缺失时增强
虽然在ZM447439的存在下,A549和HME细胞中有很大一部分内复制,但在48小时后,几乎所有细胞都被4N或8N DNA内容物阻止(C) 。相反,缺乏功能性p53反应的HeLa细胞会继续DNA合成,并迅速丧失生存能力。这增加了一种可能性,即A549和HME细胞表现出的4N/8N阻滞不是直接由ZM4447439引起的,而是由异常有丝分裂和/或胞质分裂后发生的p53依赖性有丝分裂后检查点的激活引起的(Andreassen等人,2001年). 一贯地,在ZM447439的存在下,表达显性阴性p53突变的U2OS细胞内复制有效,以至于到48小时时,78%的细胞有8N DNA含量(A) ●●●●。相比之下,只有38%的p53高产亲本U2OS细胞含有8N DNA,这表明p53确实抑制了ZM447439诱导的分裂失败后的细胞周期进展。为了测试在ZM447439存在下细胞周期的进展是否可以解释HeLa细胞失去活性的原因,我们分析了暴露于ZM447739 72小时后细胞的集落形成潜能。选择MCF7细胞进行本实验,因为它们可以通过抗雌激素治疗在G0中滞留。暴露于ZM447439期间生长受阻的细胞产生的菌落比那些增殖的细胞更多(B) ●●●●。一贯地,在1.25和2.5μM ZM447439时,增殖细胞的克隆效率降低到40%以下,而生长抑制细胞的克隆率基本上不受影响(C) 。尽管ZM447439存在下细胞周期的持续进展会导致活性丧失,但p53缺陷的U2OS细胞似乎没有HeLa细胞那样迅速丧失活性。其原因尚不清楚,但这表明p53诱导的依赖机制也可能影响ZM447439诱导四倍体后的细胞命运。
p53在ZM447439存在下抑制核内复制。(A) 具有(p53+)或不具有(p53−)功能性p53应答的U20S细胞的DNA含量直方图,用ZM447439处理,时间以小时为单位。(B) 生长停滞或增殖的MCF-7细胞暴露于ZM447439 72 h,然后分析在没有ZM447739的情况下形成集落的能力。(C) 柱状图量化了用一系列ZM447439浓度处理的MCF-7细胞的克隆效率。每个值代表三个独立实验的平均值和SD。
ZM447439处理的细胞进入有丝分裂,但不能分裂
ZM447439处理的细胞可以在不分裂的情况下进入额外的S期,这一观察结果提出了两种可能性:要么细胞在不进入有丝分裂状态的情况下重新复制基因组,要么细胞在进入和退出有丝分裂时不分裂,然后进入第二个S期。为了区分这两种可能性,我们分析了HeLa细胞从G1/S区释放到新鲜培养基或添加ZM447439或诺卡唑(一种阻止微管聚合的纺锤体毒素)的培养基中后的情况()在G1/S后的不同时间,收集细胞以测定DNA含量、有丝分裂指数和细胞周期蛋白B1水平。DNA含量直方图显示,绝大多数对照细胞分裂12小时后进入第二个S期,到18小时,大多数细胞的DNA含量大于2N(A) ●●●●。有丝分裂指数在10小时达到峰值,细胞周期蛋白B1水平随着细胞完成有丝分裂而降低(). 诺可达唑处理的细胞进入有丝分裂期,然后在实验的剩余时间内,细胞周期蛋白B1水平保持在较高水平。释放到ZM447439中的细胞经过S期,分裂失败,细胞周期蛋白B1正常降解,然后进入第二个S期(). 值得注意的是,有丝分裂指数增加和减少的动力学与对照培养物非常相似(B) ●●●●。因此,在ZM447439存在下,HeLa细胞正常进入和退出有丝分裂,但不能分裂。A549和HME细胞表现出类似的反应(未公布的数据)。
ZM447439处理的细胞进入有丝分裂,但不能分裂。HeLa细胞从G1/S释放到不同的药物组合中,在指定的时间(小时)收获,然后通过流式细胞术和免疫印迹分析。所示数据代表了三个独立的实验。A和B中的数据来自同一个实验,其中有丝分裂指数在G1/S释放后10小时达到峰值。C中的数据来源于一个独立的实验,其中,有丝分裂指标在G1/S.释放后12小时达到峰值,(A)DNA含量直方图显示ZM447439处理的细胞无法分裂,但以与对照细胞相似的动力学重新复制它们的基因组。(B) 由MPM-2反应性测定的有丝分裂指数随时间的曲线图显示,经ZM447439处理的细胞以与对照相似的动力学进入和退出有丝分裂。(C) 免疫印迹显示,在ZM447439处理的细胞中,细胞周期蛋白B1水平上升和下降,其动力学与对照组相似。Tubulin用作加载控件。
ZM447439抑制染色体对齐
观察到ZM447439处理的细胞进入和退出有丝分裂但没有分裂,提出了两种可能性:要么染色体分离正常但胞质分裂失败,要么染色体分离失败,阻止胞质分裂。为了确定ZM447439是否阻止染色体分离,我们分析了ZM447739处理的培养物中的纺锤体形态。在对照组中,前中期玫瑰花结、中期和后期纺锤波很明显()在ZM447439处理的培养物中,观察到双极纺锤波,前期细胞比例正常。然而,中期和后期纺锤体的比例显著降低,表明ZM447439抑制染色体分离(B) ●●●●。尽管缺乏后期反应,但单用ZM447439处理的细胞在有丝分裂中没有积累(C) 。然而,经ZM447439和诺卡唑处理的细胞在有丝分裂过程中确实积累,证实了经ZM47439处理的细胞无需进行染色体分离即可进入和退出有丝分裂。在ZM447439存在的情况下,染色体排列也出现异常。特别是,染色体要么在整个细胞中展开,要么沿着纺锤体的长度排列,而不是在纺锤体赤道对齐(A) ●●●●。在后一种情况下,动粒朝向纺锤体,表明动粒-微管相互作用正在发生。事实上,在电子显微镜分析的薄片中观察到动粒和动粒纤维(D) ●●●●。在19个对照细胞中,12例患者观察到含有多个微管的纤维。其中八个可以追溯到动粒。在20个经ZM447439处理的细胞中,15例观察到含有多个微管的纤维,6例追踪到动粒。虽然我们不能排除ZM447439影响动粒结构和/或微管结合能力的可能性,但ZM447739显然不能阻止动粒-微管相互作用或双极纺锤体的形成。然而,ZM447439确实抑制染色体对齐和分离。为了确定ZM447439是否阻止姐妹染色单体分离,我们让细胞在ZM447739存在下通过有丝分裂,然后分析接下来有丝分裂中的染色体扩散。从未观察到双染色体(未发表的数据),这表明ZM447439不能阻止姐妹染色单体内聚力的丧失。目前尚不清楚ZM447439是否直接抑制胞质分裂,或者胞质分裂是否作为染色体分离阻滞的次要后果而被阻止。
ZM447439防止染色体对齐和分离。(A) 有丝分裂DLD-1细胞微管蛋白、动粒/着丝粒(ACA,绿色)和DNA(红色)染色。底部面板显示了用ZM447439处理1小时后经常观察到的异常前中期的示例(B)量化DLD-1细胞暴露于ZM447739 1小时后的前期(P)、前中期(PM)、中期(M)和后期(A)细胞数量的图表,表明染色体对齐和分离受到抑制。(C) 显示在用单独的ZM4447439(红色菱形)、诺可达唑(黄色正方形)或ZM4447439加上诺可达唑(蓝色三角形)处理后所指示的时间DLD-1培养物的有丝分裂指数的图。B和C中的值表示来自三个独立实验的平均值和SEM,其中至少计数了1000个细胞。(D) ZM447439处理的HeLa细胞的电子显微照片,显示动粒(箭头)和动粒纤维。
ZM447439破坏了主轴检查点功能
上述观察结果提出了一个悖论:染色体排列缺陷应激活纺锤体检查点,从而导致有丝分裂阻滞。然而,ZM447439处理的细胞以正常的动力学退出有丝分裂(B) ,表明ZM447439可能会损害检查点功能。为了测试这种可能性,我们分析了诺康唑释放后ZM447439对细胞的影响。通过选择性分离分离诺卡唑抑制的有丝分裂细胞,清洗以去除诺卡唑,然后在各种药物组合中重新种植(,A–C)。在不同时间采集细胞,以测定DNA含量、有丝分裂指数和细胞周期蛋白B1水平。释放后2h,大多数对照细胞已完成染色体分离和分裂(A) ●●●●。相反,ZM4447439、诺科达唑和ZM4447439加上诺科达唑处理的细胞未能分裂(未发表的数据)。对照细胞的有丝分裂指数最初很高,但释放后2小时下降到15%。相比之下,在持续使用诺康唑的情况下,细胞在有丝分裂过程中仍然处于停滞状态(B) ●●●●。持续地,在对照细胞中,细胞周期蛋白B1水平在2小时后下降,但在诺康唑的存在下仍保持较高水平(C) 。令人惊讶的是,ZM447439处理细胞的有丝分裂指数急剧下降:1小时后,只有4%的ZM447739处理细胞仍处于有丝分裂状态,而对照组只有67%(B) ●●●●。一直以来,细胞周期蛋白B1在1小时后检测不到。因此,ZM447439处理的细胞迅速退出有丝分裂,这与ZM447739覆盖纺锤体检查点的概念一致。
ZM447439损害了主轴检查点功能。(A–C)有丝分裂HeLa细胞在诺卡唑阻滞12小时后通过选择性分离分离,在不同药物组合中重新种植,然后在指定的时间采集并分析。(A) DNA含量直方图显示对照细胞在1小时后分裂。(B)绘制由MPM-2反应性测定的有丝分裂指数的图表,显示ZM447439加速了有丝分裂的退出。(C) 免疫印迹显示,在ZM447439处理的细胞中,细胞周期蛋白B1和磷酸组蛋白H3水平迅速下降。用药物组合处理(D和E)DLD-1细胞,然后固定并通过荧光显微镜进行分析。(D) 绘制6小时后有丝分裂指数的柱状图显示,ZM447439可以降低紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞,但不能降低诺卡唑诱导的有核分裂阻滞。(E) 绘制8小时后有丝分裂指数的折线图,显示ZM447439解决了诺卡唑和紫杉醇对纺锤检查点功能的影响。D和E中的值表示三个独立实验得出的平均值和SEM,其中至少有1000个细胞被计数。所使用的药物组合是单独使用诺可唑(Noc,黄色方块);紫杉醇单独用药(税务);仅ZM447439(ZM,红色钻石);诺卡唑加ZM447439(新西兰,蓝色三角形);紫杉醇加ZM447439(TZ,绿色方块);无药物(对照组,绿色圆圈)。(F) 诺克唑阻滞2小时或12小时后收获的有丝分裂HeLa细胞被替换为诺克唑(黑条)或诺克唑加ZM447439(白条),有丝分裂指数是通过测量4小时后MPM-2的反应性来确定的。柱状图显示,ZM447739在长时间有丝分裂阻滞后,可以破坏诺克唑诱导的检查点激活。
然而,用ZM447439和诺卡唑处理的异步培养细胞在有丝分裂中积累细胞(C) ,表示ZM447439在所有情况下都不会覆盖检查点。为了解释这一点,我们推断,当微管聚合时,ZM447439可能只会破坏检查点。为了验证这一点,我们分析了ZM447439对紫杉醇引起的有丝分裂细胞聚集的影响,紫杉醇是一种纺锤体毒素,通过稳定微管激活检查点。在紫杉醇、诺科达唑或诺科达唑加ZM4447439存在的情况下,6小时后有丝分裂指数达到~25%(D) ●●●●。相比之下,ZM4447439处理的培养物的有丝分裂指数仍较低,约为7%。值得注意的是,紫杉醇加ZM447439处理的培养物的有丝分裂指数仅达到12%。为了证实这种差异效应,我们测定了诺卡唑和紫杉醇处理的培养物在ZM447439浓度范围内的有丝分裂指数。E清楚地表明,ZM447439解决了诺卡唑和紫杉醇对检查点功能的药理作用。因此,这些观察结果证实,当微管聚合时,ZM447439可以有效地覆盖纺锤检查点。
虽然用ZM447439和诺卡唑处理的异步培养物积累有丝分裂细胞的方式与诺卡唑单独处理的培养物相似(C) 在诺康唑阻滞12小时后,释放到诺康唑和ZM447439中的有丝分裂细胞比释放到诺康唑中的细胞更快地退出有丝分裂(B) ●●●●。这表明,也许在长时间有丝分裂阻滞后,ZM447439还可以破坏微管解聚诱导的检查点。为了验证这一点,在诺卡唑阻滞2小时或12小时后采集有丝分裂HeLa细胞,然后在诺卡唑单用或诺卡唑加ZM447439中重新放置4小时。尽管在ZM447439和诺卡唑的存在下,2h阻滞后收获的细胞中约80%仍被阻滞,但在12h阻滞后分离的细胞中只有约20%仍被阻滞。因此,在长时间有丝分裂阻滞后,ZM447439可以缓解微管解聚诱导的检查点阻滞。然而,从这一分析中可以清楚地看出,在短期内,ZM4447439处理的细胞在微管解聚时确实会发生有丝分裂停滞,但在微管稳定时不会停滞(E) ●●●●。
ZM447439抑制BubR1、Mad2和Cenp-E的动粒定位
为了深入了解ZM447439是如何破坏染色体对齐和检查点功能的,我们分析了它对极光A、极光B、生存素、纺锤体检查点成分BubR1和Mad2以及与运动蛋白相关的运动蛋白Cenp-E定位的影响或者Aurora B和Survivin定位于着丝粒(A) ●●●●。然而,ZM447439确实降低了与动粒结合的BubR1、Cenp-E和Mad2(A和图S1,可在http://www.jcb.org/cgi/content/full/jcb.200208091/DC1). 像素强度的定量显示,在存在和不存在微管毒素的情况下,ZM447439将动粒相关的BubR1降低至~10%(B、 图S1和表SI)。ZM447439分别将前中期细胞中与动粒结合的Mad2降低至<10%,并在诺卡唑和紫杉醇的存在下降低至30%和43%(图S1 C)。在ZM447439和ZM447739加紫杉醇处理的细胞中,动粒结合的Cenp-E分别减少到28%和23%。然而,在诺卡唑和ZM447439的存在下,Cenp-E仅降至59%。有趣的是,荧光强度直方图的检查(图S2)表明,尽管ZM447439在大多数动粒中降低了动粒结合的Cenp-E,大量Cenp-E水平保持正常(30%的Cenp-E/ACA比率大于仅用诺卡唑处理的细胞中动粒的平均值)。相反,在ZM447439和诺卡唑存在的情况下,没有动粒具有正常的BubR1水平(0%的BubR1/ACA比率大于仅诺卡唑的平均值)。
ZM447439不能阻止极光B定位到着丝粒。在(A)暴露于ZM447439 1 h或(B)转染Aurora B siRNA双链后,对前中期DLD-1细胞的免疫荧光图像进行染色,以检测Aurora A(绿色)、Survivin(红色)和DNA(蓝色)。(C) 瞬时转染HeLa细胞,表达Myc-tagged Aurora B或Myc-tag Aurora BK106R,染色检测Aurora B(绿色)、Myc-tagned蛋白质(红色)和DNA(蓝色)。
ZM447439抑制BubR1的动粒定位和磷酸化。(A) 去卷积图像堆栈的投影显示有丝分裂DLD-1细胞用指定药物处理1小时,然后染色以检测动粒/着丝粒(ACA)、BubR1和DNA。(B) 绘制了各种条件下BubR1与ACA信号的荧光比率的条形图,表明ZM447439将BubR1信号降低了约10倍。数值表示至少在三个不同细胞中分析的至少26个不同的着丝粒/着丝粒对的平均值和SEM。(C) 未经处理的细胞(绿色圆圈)或暴露于ZM447439(红色钻石)或紫杉醇(蓝色方块)40分钟的细胞中期动粒的BubR1信号强度与动粒间距离的曲线图。使用ACA病灶确定动粒位置。椭圆至少包含75%的数据点。(D) 通过免疫印迹分析从G1/S释放到所指示的药物中后通过选择性分离收集的有丝分裂HeLa细胞。在ZM447439存在下,BubR1的磷酸化形式无法检测到。(E) BubR1从诺卡唑阻滞的有丝分裂HeLa细胞中亲和纯化,并在ZM447439存在下检测激酶活性。每个值代表三个独立实验得出的平均值和SEM。
尽管动粒结合的BubR1在染色体对齐后减少(Chan等人,1999年;Taylor等人,2001年),在低水平长春碱引起张力丧失后,它被招募回中期动粒(Skoufias等人,2001年). 为了确定ZM447439是否在张力丧失后抑制BubR1与排列的动粒的再结合,我们在用ZM447739或紫杉醇治疗40分钟后测量了中期动粒的Bub R1信号强度和动粒间距离(C和表SII)。紫杉醇治疗后,平均动粒间距从0.89±0.20μm减少到0.58±0.15μm(P<0.001),平均BubR1/ACA荧光比从2.23±1.21增加到3.86±2.41(P<0.001)。相反,尽管暴露于ZM447439后,平均动粒间距降低到0.55±0.14μm,但BubR1/ACA荧光比率降低到1.11±0 0.88μm,这与紫杉醇处理和对照细胞有统计学差异(P<0.001)。
BubR1被磷酸化以应对纺锤体损伤(Chan等人,1999年;Taylor等人,2001年). 为了确定ZM447439是否阻止BubR1磷酸化,在G1/S阻滞释放到各种药物组合中后约9.5小时收集有丝分裂细胞。在存在ZM447439的情况下,无论是否存在诺康唑,都无法检测到BubR1的磷酸化形式(D) ●●●●。为了排除ZM447439直接抑制BubR1的可能性,在存在和不存在ZM447739的情况下,对Bub R1免疫沉淀物的激酶活性进行了分析。尽管ZM447439抑制了极光A,但它并没有抑制BubR1(E) ●●●●。
抑制极光B抑制BubR1、Cenp-E和Mad2的动粒定位
ZM447439数据表明,Aurora激酶活性是染色体对齐和纺锤体检查点功能所必需的。为了确定这些功能需要哪种Aurora,并排除ZM447439表型可能是由于另一种激酶的抑制所致的可能性,我们通过RNAi抑制Aurora A和B(A) ●●●●。尽管对照组和Aurora A RNAi培养物具有强大的纺锤体检查点,但抑制Aurora B可减少纺锤体损伤后有丝分裂细胞的积累(B) ●●●●。抑制极光B(而非极光A)抑制BubR1、Cenp-E和Mad2的动粒定位(C和图S3)。因此,这些观察结果表明,上述ZM447439诱导的表型是由于Aurora B的抑制,而不是Aurora A或其他一些激酶的抑制。
极光B的抑制阻止了BubR1的动粒定位。用siRNA双工体转染HeLa和DLD-1细胞以抑制Aurora A或B。数值表示三个独立实验的平均值和SEM,其中至少计算了1000个细胞。(C) 靶向Aurora A(顶部)和Aurora B(底部)的siRNAs转染后,诺卡唑处理的有丝分裂DLD-1细胞的投影去卷积图像堆栈。(D) 对照组和Aurora B RNAi培养中纺锤体形态的例子。(E) 对照细胞和极光B抑制细胞的动粒间距图。
Aurora B K106R的过度表达导致内源性蛋白定位错误
极光B RNAi表型似乎比ZM447439诱导的更严重。特别是,Aurora B RNAi对诺卡唑和紫杉醇的检查点逮捕作出了妥协(B) ●●●●。此外,染色体经常与纺锤体相邻(D) ,表明缺乏动粒-微管相互作用。因此,平均粒间距离显著缩短(E) ●●●●。对这些差异的一个可能的解释是,除了其催化作用外,极光B也可能在着丝粒处发挥结构作用。值得注意的是,Aurora B、INCENP和Survivin形成了一个复合物,这是有丝分裂和胞质分裂的多个方面所必需的(Adams等人,2001a). 破坏这种复合物可能会产生更广泛的后果,而不仅仅是抑制Aurora B激酶的活性。尽管ZM447439治疗后Survivin定位于着丝粒(A) ,它不是在极光B RNAi之后(B) ●●●●。如果上述论点有效,Aurora B激酶突变体的异位表达应产生类似于ZM447439的表型。然而,Aurora B K109R的过度表达消除了动粒-微管相互作用(Murata-Hori和Wang,2002年),导致表型与我们的RNAi数据更加一致。因此,我们测试了Aurora B激酶突变体过度表达后Aurora B是否定位于着丝粒。瞬时转染HeLa细胞后,外源性野生型极光B定位于前中期的着丝粒(C) 和细胞分裂后的中体(未发表的数据)。此外,在低表达水平下,Aurora B K106R突变体也定位于着丝粒(请注意,人类Aurora B K106R突变相当于前面描述的大鼠K109R突变Murata-Hori和Wang[2002]). 然而,在表达中到高水平K106R突变体的前中期细胞中,着丝粒处的极光B不明显(C) 。因此,与Aurora激酶抑制剂的治疗相反,Aurora B激酶突变体的过度表达阻止内源性蛋白定位到着丝粒。
染色体比对需要BubR1
我们的观察结果与Aurora B激酶活性通过将BubR1靶向动粒来调节纺锤体检查点的概念一致,至少部分是这样。因为BubR1结合Cenp-E(Chan等人,1999年;Yao等人,2000年)我们推断,Aurora B在促进正确染色体对齐方面的需求也可能通过其对BubR1的影响而被介导,至少部分是这样。为了验证这一点,我们使用RNAi来确定BubR1的阻遏是否抑制染色体对齐。与抗体注射实验一致(Chan等人,1999年),抑制BubR1损害主轴检查点功能。特别是,在异步培养中,中期的数量减少,后期经常显示滞后染色体(图S4)。此外,BubR1 RNAi培养物在暴露于纺锤体毒素时没有积累有丝分裂细胞(未公开数据)。引人注目的是,BubR1 RNAi培养物中的前中期细胞经常出现异常,染色体沿着纺锤体长度而不是中期板排列(A) ●●●●。虽然这些染色体似乎附着在纺锤体上,但与对照细胞相比,平均着丝粒间距减小了(B) ,与拉力减少一致。
抑制BubR1可阻止染色体对齐。用siRNA双工体转染DLD-1细胞以抑制BubR1,然后进行染色以检测Bub1(绿色)、微管蛋白(红色)和DNA(蓝色)。(A) 染色体沿着纺锤体长度而不是沿着中期板排列的异常前中期细胞的例子。条形图显示,约40%的前丝分裂出现异常,染色体沿纺锤体长度排列。(B) 使用Bub1焦点测量的动粒间距离图,以确定动粒位置。(C) 暴露于MG132 1小时后,有丝分裂细胞表现出前中期或中期染色体对齐的比例。数值代表三个独立实验得出的平均值和SEM,其中至少计算了100个有丝分裂细胞。
为了排除这种排列缺陷仅仅是由于细胞过早进入后期的可能性,我们用蛋白体抑制剂MG132处理对照和BubR1 RNAi培养物,以防止后期发病。在3小时的时间过程中,在对照组和BubR1 RNAi培养中,前期和后期的数量几乎为零(图S4)。在对照培养物中,前中期的比例大致保持在~25%,中期的比例上升到~66%(C) ,与MG132一致,防止中期-后期过渡。然而,在BubR1表达的培养物中,前中期的比例从~32%上升到~49%,中期的数量仅达到~44%(B) ●●●●。因此,当纺锤体检查点激活下游的中期-后期转换被阻断时,BubR1的阻遏会减少中期细胞的积累,这表明染色体对齐确实需要BubR1。
讨论
ZM447439是一种新型的特异性极光激酶抑制剂
蛋白激酶抑制剂作为治疗剂和实验研究工具的有用性取决于抑制剂的选择性。ZM447439用IC体外抑制极光A和B50100 nM范围内的值。相反,当对14种不同结构类型的其他蛋白激酶进行测试时,11种,包括有丝分裂激酶CDK1和PLK1,都被IC抑制50值>10μM。虽然MEK1和SRC在1μM范围内被抑制,但此处描述的表型不太可能是由于这些酶的抑制,因为与ZM447439相比,选择性SRC和MEK1抑制剂延迟G2/M进展(Moasser等人,1999年;Wright等人,1999年). 对ZM447439选择性机制的深入了解来自Aurora A与相关抑制剂复合的晶体结构(Andrew Pannifer和Richard Pauptt,阿斯利康制药,个人通信)。这表明该抑制剂占据了ATP结合囊和邻近的缝隙,而其他激酶中没有该缝隙。极光激酶的序列同源性(比肖夫和犁手,1999年)表明ZM447439可能以类似的方式抑制极光B,也可能抑制极光C。虽然我们不能排除ZM447439抑制其他未经测试的蛋白激酶的可能性,但RNAi数据()提供令人信服的证据表明,这里描述的表型是由于极光B的抑制,而不是极光A或任何其他蛋白激酶的抑制。极光A是双极纺锤形成所必需的果蝇属胚胎和爪蟾鸡蛋提取物与中心体成熟秀丽线虫胚胎(Hannak等人,2001年). 虽然我们还没有测试ZM447439对中心体成熟的影响,但双极纺锤是在ZM447739存在下形成的。然而,当极光A被RNAi(未公开的数据)抑制时,也会形成双极纺锤波,这表明也许极光A对人体体细胞中的纺锤波双极性不是必需的。
极光B激酶活性调节染色体排列和纺锤体检查点
与以前的报告一致(Adams等人,2001c;Kallio等人,2002年;Murata-Hori和Wang,2002年),我们的观察结果表明,Aurora B是人类细胞中纺锤体检查点功能和中期染色体排列所必需的。通过使用一种新的选择性蛋白激酶抑制剂,我们首次能够直接解决这些过程中对Aurora B激酶活性的要求。由于来自蛋白质阻遏和过度表达的表型似乎比ZM447439诱导的表型更广泛,我们的数据证明了小分子抑制剂在剖析复杂细胞过程中的有用性。事实上,动粒纤维是在ZM447439存在下形成的,这表明动粒-微管相互作用并不需要Aurora B激酶活性,而是调节这些相互作用以促进正确的染色体排列。Aurora B的这种作用与Ipl1在芽殖酵母中的作用完全一致:Ipl1不是染色体附着到纺锤体所必需的,而是解决了不适当的动粒-微管相互作用,以确保正确的双向定向(Tanaka等人,2002年).
Ipl1也与主轴检查点功能有关(Biggins和Murray,2001年)以及染色体比对。因为极光B也促进染色体对齐,它在检查点激活中的作用是否可能是产生独立的动粒的次要结果,正如Ipl1所论证的那样(Tanaka等人,2002年)? 如果是这样的话,我们可以预测,在缺乏Aurora B激酶活性的情况下,BubR1和Mad2应该定位于缺乏结合微管的动粒。然而,在诺卡唑和ZM447439的存在下,BubR1和Mad2在动粒中的定位都严重降低。因此,至少在人类细胞中,极光B激酶活性似乎是检查点功能直接需要的。
本研究中最引人注目的观察结果是ZM447439对诺卡唑和紫杉醇诱导的有丝分裂阻滞的差异作用。下面,我们考虑两种可能的解释,一种是定性的,另一种是定量的。“定性”解释是,检查点必须由多条通路组成,其中一条不需要Aurora B激酶活性。如果是这样,那么Aurora B激酶活性对于因动粒-微管相互作用和/或纺锤体破坏而丧失的检查点激活来说并不是必需的,但在动粒能够捕获微管,但不能在纺锤体上正确对齐的情况下是必需的。这表明,就像芽殖酵母中的Ipl1一样(Biggins和Murray,2001年),Aurora B不直接监测动粒-微管的相互作用,而是激活检查点,以应对着丝粒张力的丧失。
另一种“定量”解释是,极光B只是将BubR1和Mad2对准动粒,而不考虑张力。尽管ZM447439明显降低了与动粒相关的BubR1和Mad2(分别降低了~90和~70%),但在缺乏动粒-微管相互作用的情况下,残留的结合蛋白可能足以维持有丝分裂阻滞。如果微管的占用足以使剩余的结合蛋白失活,这可以解释为什么细胞在ZM447439和紫杉醇的存在下不能停止生长。有趣的是,与ZM447439加紫杉醇处理的细胞相比,用ZM447739和诺卡唑处理的细胞中的动粒结合Cenp-E几乎高出两倍。因为Cenp-E被认为通过BubR1激活检查点(Chan等人,1999年;Yao等人,2000年),也许Cenp-E的升高水平足以激活剩余的BubR1,从而在诺克唑存在下维持有丝分裂阻滞。
目前,很难想象人们如何区分这两种可能性。事实上,主轴检查点是否监测张力、微管附着或两者都没有解决(穆萨乔和哈德威克,2002年). 虽然来自芽殖酵母的证据表明,Ipl1确实激活了检查点,以应对紧张情绪的缺乏(Biggins和Murray,2001年),有令人信服的证据表明哺乳动物体细胞中的检查点仅监测微管附着(Rieder等人,1995年). 然而哺乳动物的动粒对张力的变化很敏感(Waters等人,1998年),特别是BubR1,但不是Mad2,在张力损失后被募集到排列的动粒中(Skoufias等人,2001年;Shannon等人,2002年). 然而,就检查点功能而言,紧张和依恋可能是不可分离的事件。事实上,许多年前就有研究表明张力可以稳定微管的附着(尼克拉斯和科赫,1969年). 此外,我们的观察表明,BubR1在聚集和检查点功能中发挥双重作用,这表明调控和监测染色体排列的机制在分子水平上交织在一起。
极光抑制剂作为潜在治疗剂
Auroras代表一个新的具有致癌潜能的蛋白激酶家族(Bischoff等人,1998年;Tatsuka等人,1998年;Zhou等人,1998年;Adams等人,2001a). 我们的观察表明,使用小分子抑制剂可以选择性地抑制细胞中的极光激酶活性。此外,我们已经表明,相对于具有功能性p53反应的细胞,p53缺陷细胞更有可能在ZM447439的存在下继续细胞周期进展。此外,在ZM447439存在下,循环细胞迅速失去活力,而非分裂细胞保持活力。总之,这些观察结果表明,极光激酶抑制剂可能对增殖的肿瘤细胞具有选择性毒性,因此为开发新型抗癌药物开辟了新的机会。
材料和方法
体外激酶分析
重组Aurora A和B表达为NH2-终端His6-根据制造商的说明,使用杆状病毒表达系统(FastBac™;GIBCO BRL)标记融合蛋白。Aurora A用Ni-NTA琼脂糖亲和层析纯化,Aurora B用CM Sepharose Fast Flow(Amersham Biosciences)离子交换层析纯化。将1 ng纯化的重组酶添加到含有25 mM Tris-HCl、pH 7.5、12.5 mM KCl、2.5 mM NaF、0.6 mM DTT、6.25 mM MnCl的反应混合物中2,10μM肽底物(Biotinyl-Ahx-tetra(LRRWSLG));Bachem),10μM用于极光A或5μM ATP用于极光B,0.2μCiγ[33P] ATP(比活性≥2500 Ci/mmol;Amersham Biosciences),然后在RT下孵育60分钟。通过添加20%磷酸停止反应,并将产物捕获在P30硝化纤维过滤器(Whatman)上,并分析其并入33P带Betaplate™计数器(Wallac)。采用无酶和无复合对照值测定ZM447439的浓度,该浓度对酶活性有50%的抑制作用。更多详细信息可向Nicholas Keen(英国柴郡阿斯利康制药公司)索取。
细胞培养
A549、MCF-7和DLD-1细胞(美国型培养物收集)、TA-HeLa细胞(Taylor和McKeon,1997年)、稳定转染pCMVp53 143A的U2OS细胞和亲代U2OS电池(均来自英国格拉斯哥Beatson癌症研究所的Karen Vousden)均按上述方法培养(Taylor等人,2001年). 表达hTERT的未转化人类乳腺上皮细胞(克隆技术公司)在MEGM中培养。如前所述使用诺卡唑、紫杉醇和胸苷(Taylor等人,2001年). 将MG132(钙生物化学)溶解在二甲基亚砜中,并以20μM的最终浓度使用。将ZM4447439溶于10mM的二甲基亚砜中,并在−20°C下单独储存9个月,以避免冻融循环,然后在培养基中新鲜稀释。IC50Aurora A和B的值(~100 nM)是在ATP的Km处确定的(见上文)。然而,由于细胞ATP浓度高出约200倍,并且ZM447439是ATP的竞争对手,我们在所有细胞分析中使用浓度为2μM的ZM447739,除非另有说明。将二甲基亚砜添加到无药培养物中以解释溶剂。
细胞周期分析和克隆分析
如前所述,使用双胸腺嘧啶核苷阻滞法测量DNA含量和有丝分裂指数,并同步化G1/S处的TA-HeLa细胞(Taylor和McKeon,1997年). 为了确定克隆效率,将MCF7细胞置于无酚红二甲醚加5%剥离血清(HyClone)中,然后在1μM下用或不用抗雌激素ICI 182780处理48小时,然后在指定浓度下加入ZM447439处理72小时,在不含ZM447439的完整培养基中,在6孔板的每个孔中电镀~400个细胞。10天后,固定菌落,用结晶紫染色并计数。克隆效率表示与DMSO处理的对照组相比,ZM447439处理的平板上的菌落数量。
抗体技术
免疫荧光、免疫印迹和免疫沉淀都是如前所述进行的(Taylor等人,2001年)使用以下抗体:磷酸组蛋白H3(Upstate Biotechnology);细胞周期蛋白B1(Upstate Biotechnology);微管蛋白(TAT1);着丝粒/动粒(人类ACA);丁苯橡胶R1(SBR1.1);Bub1(4B12);极光A(RAA.1);和Myc-tag(9E10)。Aurora B是使用抗AIM-1小鼠单克隆抗体(Transduction Laboratories)或绵羊抗人Aurora BpAb(未公布数据)检测到的。为了定位Mad2和Survivin,我们使用稳定表达Myc-tagged hMad2或hSurvivin-ORF的DLD-1细胞系(未公开数据)。对于IP激酶分析,在激酶缓冲液(10 mM Tris、pH7.5、5 mM KCl、1 mM NaF、0.24 mM DTT和2.5 mM MnCl)中平衡小球,然后在RT下在补充有2.5μM ATP、5μM Ciγ[32P] ATP和3μM生物素-Ahx-四肽(LRRWSLG)底物。用20%磷酸停止反应,然后在P30过滤器(沃特曼)上发现反应。在0.5%磷酸中洗涤五次后,通过闪烁计数对结合放射性标记进行定量。如前所述,执行反卷积显微镜和像素强度定量(Taylor等人,2001年). 简而言之,动粒荧光值是使用softWoRx成像软件(Applied Precision)测定的。减去背景读数,然后根据ACA信号对数值进行标准化,以说明染色或图像采集中的任何变化。如图所示,SoftWoRx使用ACA或Bub1焦点测量动粒间距离,以确定动粒位置。
电子显微镜
室温下用2.5%戊二醛在磷酸盐缓冲液中固定细胞2小时,然后造粒并在室温下用1%四氧化锇后固定1小时。洗涤后,样品在4%醋酸铀酰中整块染色16小时,用丙酮脱水,然后包埋在Spurr树脂中。切下70nm的切片,用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色,然后在电子显微镜上检查(Tecnai 12 BioTWIN;FEI公司)。
RNA干扰
根据制造商的说明,使用寡效胺™(Invitrogen)转染设计用于抑制极光A(5′-AAGCAAAAGCUUGUCCA-3′)、极光B(5′-AACGGCACUUCACAAAUUGA-3′)和BubR1(5′-aACGGCAUUGAUAUGAA-3′)的siRNA双链体(Dharmacon Research)。简言之,105在转染前24小时将细胞接种在24孔板的孔中。将siRNA双链体和OligofectAMINE™在培养基中稀释、混合并孵育20分钟。然后将siRNA/脂质复合物加入细胞4小时,然后加入完整的培养基。24h后进行细胞移植,转染48-72h后进行分析。
瞬时转染
人类极光B ORF(Bischoff等人,1998年)经PCR扩增,克隆到pcDNA-3 Myc(Taylor和McKeon,1997年),突变以产生K106R,并测序,所有这些都遵循标准程序。然后使用ProFection将质粒DNA转染到盖玻片上的TA-HeLa细胞中®磷酸钙试剂盒(Promega)。转染24小时后,用1%甲醛在PBS中固定细胞,并按照上述方法进行免疫荧光处理。