PRIMA-1改善严重皮肤糜烂AEC患者的表皮覆盖^遇见/4月24日

原代AEC表皮细胞系的建立及表皮分化

对患者1的皮肤非糜烂区域进行活检。建立并扩增原代表皮培养物。WT和AEC KCs增殖或细胞死亡之间未观察到差异（未显示）。通过将培养基中的钙浓度提高到1.5 mM来诱导分层/分化。细胞保持10天，通过qRT-PCR和免疫染色分析，分别对特定分化的表皮标记进行基因和蛋白表达。与野生型（WT）KC相比，患者1的AEC角朊细胞（KCs）中细胞角蛋白1（KRT1）、ZNF750、谷氨酰胺转胺酶（TGM1）、氯分泌（LOR）和富含脯氨酸的小蛋白1A（SPRRA1）基因的表达降低（图。​（图1c）。1c个)。这表明患者细胞的表皮分化延迟或改变。除角化标记（LOR和SPRRA1）外，PRIMA-1恢复了这些基因的表达^遇见因此，与正常KCs相比，患者1通过免疫荧光染色显示的分化KCs降低了细胞核ZNF750、细胞周转谷氨酰胺酶和细胞质KRT1（图。​（图1d）。1天)。值得注意的是，在PRIMA-1的见证下^遇见，在第10天，这些标记物在AEC KC中被有效地挽救（图。​（图1d）。1天)。这强烈表明PRIMA-1^遇见有效挽救AEC细胞分化。有趣的是，虽然AEC分化KC中的KRT1、转谷氨酰胺酶和ZNF750发生了深刻变化，但总苞醇（IVL）正常表达（图。1c、d)。研究表明，在伤口和牛皮癣中，总苞醇的行为与其他皮肤标记物不同^11,12在AEC的背景下研究这种差异是很有意思的。

PRIMA-1不会减少p63聚集^遇见

突变AEC p63主要通过与WT p63和p53家族成员p73形成聚集体而发挥显性负效应¹³.我们测试了PRIMA-1^遇见救援可能是由于蛋白质聚集减少。未经处理和处理的突变体和WT表皮细胞在自然条件下进行裂解，以提取总蛋白。然后将蛋白质提取物装载在非变性凝胶上，然后用抗p63特异性抗体转移进行蛋白质印迹分析。正如预期的那样，在AEC分化细胞中检测到蛋白质聚集，而在WT细胞中没有检测到。然而，尽管PRIMA-1^遇见能够挽救表皮分化和相应的特异性基因表达，但并没有消除突变p63分子驱动的蛋白质聚集（图。​（图2）。2)。这与它对突变型p53的解聚活性相反¹⁴.强烈建议PRIMA-1^遇见靶向表皮细胞分化，而非p63活性。这可能表明这种小分子对瘢痕疙瘩、腿部溃疡或糖尿病溃疡等有缺陷的伤口愈合有更广泛的影响。

在单独的窗口中打开

图2

蛋白质聚集在分化的患者1 KC中诱导，但PRIMA-1不会减少^遇见.

一在融合处和分化10天后从WT和患者1 KC（AEC）中收集蛋白质提取物，并加载到非变性凝胶上，用p63特异性抗体进行western blot分析(b条)。三个独立实验的代表。波段的量化(c（c）)。在每种条件下，装载等量的蛋白质。

PRIMA-1的配方^遇见

自从静脉注射底漆-1^遇见/4月24日在之前的临床癌症试验（第2阶段和第3阶段）中耐受性良好，法国健康与药物管理局（ANSM）授权我们通过皮肤局部用药治疗两名严重皮肤糜烂的AEC患者，作为一种富有同情心的护理，由皮肤科医生和药剂师负责。质量控制底漆-1^遇见/4月24日通过适当的分析对纯粉末（法国生物技术研发系统公司）进行评估。未发现任何杂质超过ICH Q3A、Q3C和Q3D指南的建议阈值。底漆-1^遇见/4月24日将粉末溶解在无菌纯化水中（凡士林^®，Fresenius Kabi，法国），以获得36 mg/mL的溶液。然后将该溶液并入现成的Seraqua中并混合^®亲水性外用霜基（法国法格伦）PRIMA-1MET/246年4月浓度为0.6mg/g奶油。的稳定性底漆-1^遇见/4月24日在该配方中，在2-8°C下储存3周。

qRT-PCR分析

未经处理和处理的AEC和对照KC作为干颗粒收集。然后使用RNEasy Mini试剂盒（Qiagen）提取RNA，并使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）从1µg RNA合成cDNA。使用2×SYBR Green PCR Master Mix（Absource Biotools）进行三次定量PCR。使用2计算每个基因的表达^-ΔΔCt方法。结果显示，折叠变化归一化为B2M家政基因，并与对照KC相对。使用的特定引物序列是

KRT14:5′-GGCCTGCTGGAGATAGAAGACTAC-3′（向上）和5′-CACTGTGGCTGAGAATCTT-3′（向下）

KRT1:5′-TCTCGTTGGATTCGGAACTGAAG-3'（向上）和5′-AGACAACTCTGTTGGTGAGTGC-3′（向下）

ZNF750:5′-CAGGTACTGCTCCTGAGCAC-3′（向上）和5′-GAGAGCCCCGTCATCTGG-3′（向下）

TGM1:5′-CCCCC GCAATGAGATCTACA-3′（向上）和5′-ATCCTCATGGTCCACGTACACA-3′（向下）

ILV:5′-TCTGCCTCAGCTTACTG-3′（向上）和5′-CAGTGGAGTTGGCTGTTTCA-3′（向下）

B2M:5′-CACTCGAAAAAGAGAGTATGCCT-3′（向上）和5′-CCAATACAAATGGCATTCA-3′（向下）。

免疫荧光染色

细胞接种在24孔板中0.1%明胶涂层盖玻片上，每孔5400个细胞。用4%多聚甲醛在室温下分化10天后固定20分钟，在1 mM甘氨酸中培养10分钟以淬灭PFA，并用0.5%Triton X-100在DPBS中渗透^+/+（Gibco™，Life Technologies）7分钟，在DPBS中清洗3×5分钟^+/+在每个步骤之间。在5%BSA中阻断30分钟后，在4°C的加湿室中用一级抗体培养细胞过夜。使用的主要抗体是针对CKRT1（1/250，BioLegend）、ZNF750（HPA023012，1/300，Sigma-Aldrich）、TGM1（sc-25786，1/50，Santacruz）和IVL（I9018，1/100，Sigma）的。细胞在DPBS中清洗^+/+并与相应的二级抗体（山羊抗兔AlexaFluor^®488或山羊抗兔AlexaFluor^®594，Life Technologies）在室温下，在阻挡缓冲液中以1/3000稀释1小时，避光。最后清洗盖玻片，将其安装在显微镜载玻片上（DAPI fluoromount-G™，Electron Microscopy Sciences），并在配备OrcaFlash 4.0 LT相机（哈马松）的尼康Eclipse Ti外荧光显微镜下进行可视化。使用NIS-Elements软件进行图像分析。

我们要感谢患者和家属的合作与信任。这项工作得到了ANR-PRTS、ANR-Emergence、法国皮肤病学会2016和国家皮肤病康复研究所（INSERM）对DA的资助，以及Telethon（GGP16235）对C.M.的资助。