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.2018年1月30日；115（5）：E906-E915。
doi:10.1073/pnas.1713773115。 Epub 2018年1月16日。

p63转录因子的蛋白聚集是AEC综合征严重皮肤脆性的基础

克劳迪娅·拉索 1, 克里斯蒂安·奥斯特堡 2, 安娜·西里科 1, 达里奥·安东尼尼 三 4, 拉斐尔·安布罗西奥 4, 朱莉娅·马伦·沃兹 2, 约尔格·林恩塔尔 2, 马可·费尼亚尼 三, 塞巴斯蒂安·凯洛瑟 2, 比吉特·施费尔 2, 彼得·古恩特 2, 萨特拉吉特·辛哈 5, 沃尔克·多奇 6, 卡特琳娜·米塞罗 7 三
附属公司

p63转录因子的蛋白聚集是AEC综合征严重皮肤脆性的基础

克劳迪娅·拉索等。 美国国家科学院程序. .

摘要

这个第63页基因编码表皮承诺、发育和分化的主调节器。C末端结构域的杂合突变第63页该基因可导致强直性睑球粘连-外胚层缺陷-唇腭裂（AEC）综合征，这是一种以皮肤脆弱和严重、持久的皮肤糜烂为特征的危及生命的疾病。尽管对p63的功能有着深入的了解，但对疾病病理机制和可能的治疗方法知之甚少。在这里，我们发现多个AEC相关的p63突变，但不是引起其他疾病的突变，会导致热力学蛋白失稳、错误折叠和聚集，类似于癌症中发现的已知p53功能缺失突变。AEC突变蛋白表现出受损的DNA结合和转录活性，由于与野生型p63和p73的聚集，导致显性负效应。重要的是，p63聚集也发生在该疾病的条件敲入小鼠模型中，其中错误折叠的p63突变蛋白导致严重的表皮缺陷。消除突变蛋白聚集的p63变体能够在报告分析和人类成纤维细胞-角质形成细胞转化分析中拯救p63的转录功能。我们的研究表明，AEC综合征是一种蛋白质聚集障碍，为治疗干预开辟了途径。

关键词：AEC综合征；小鼠模型；第63页；蛋白质聚集；皮肤。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
AEC突变体p63。(A类)p63结构和致病突变（如图所示，每种疾病的颜色编码）。本研究中使用的突变以粗体显示。(B类)小鼠L514F SAM的核磁共振波谱（PDB ID代码5N2O）。显示了具有最低CYANA目标函数值的20个一致器的束。突变的氨基酸表示为棒状。(C类)通过CD光谱记录纯化的野生型（黑色）和L514F（红色）SAM结构域的熔化曲线。(D类)记录初始熔化曲线后，反转纯化野生型和L514F SAM结构域的CD熔化曲线。由于不可逆沉淀，突变体保持未折叠状态。(E类)野生型ΔNp63α（黑色）和由蛋白质延伸引起的指示AEC突变的TANGO分析(上部：聚集肽I-III）或SAM和TI结构域中的错义突变(下部). 预计V603D变体将消除突变聚集。(F类)BN-页码(上部)和SDS/PAGE(下部)然后对表达野生型（WT）和EEC（蓝色）或AEC（红色）突变的H1299提取物中的p63进行Western blot。可溶性ΔNp63α蛋白主要以单体形式存在（m）。(G公司)SEC随后对过度表达野生型ΔNp63α和p63L514F突变体的H1299细胞裂解物进行Western blot。样品在37°C下培养15分钟，然后加载到SEC上左侧显示每个收集部分的相对强度。
图2。
图2。
AEC相关p63突变体与其他p53家族成员聚集。(A类)BN-页码(上部)和SDS/PAGE(下部)然后对野生型p63和ΔNp63αV603D变异背景中SAM域的一组扩展AEC突变进行Western blot(左侧)和EEC突变体(赖特)在H1299细胞中瞬时表达。(B类)H1299细胞中表达的野生型和指示突变型p63的SEC分析和Western blot。野生型ΔNp63α和所有EEC突变蛋白洗脱为四聚体（11.25–15 mL），而AEC突变蛋白主要转移到空隙体积（7.5 mL），对应于聚集物。(C类)突变HA-p53R175H和指示的Myc-ΔNp63α蛋白之间的协同免疫沉淀。p53用HA特异性抗体免疫沉淀（IP）。抗-HA-Tag抗体用于检测p53，而抗Myc抗体用于p63。(D类)在H1299细胞中，ΔNp73αV586D（对应于p63中的V603D）与ΔNp 63αV603D野生型或L514F共表达的SEC分析和Western blot。样品在37°C下孵育15分钟，然后加载到SEC上。
图3。
图3。
p63聚集和AEC综合征小鼠模型中受损的转录功能。(A类)通过与Klf4和指示的p63病毒共感染转化为iKCs的HDFs中指示的角质形成细胞特异性p63靶基因的实时RT-PCR。(B类)iKCs中Krt14和p63的Western blot。β-actin作为负荷对照。(C类)p63的基因靶向策略+/L514Fflox公司敲入小鼠。携带L514F突变的突变外显子13以红色表示。LoxP位点（黑色三角形）侧翼野生型外显子13-（绿色）与外显子14的编码部分和SV40 polyA（pA）融合。3xFLAG（蓝色）位于外显子14编码序列的末端。FLAG标记的p63突变蛋白在Cre介导的缺失中表达。(D类)来自p63的角质形成细胞中野生型p63（灰色条）和p63L514F（白色条）的实时RT-PCR+/地板L514F（het）和p63L514Fflox/L514F floxAd-Cre介导的缺失或感染Ad-GFP（ctr）后的（hom）小鼠。(E类)p63诱导突变角质形成细胞靶基因实时RT-PCR，ctr水平设为1(n个= 5). (F类)对突变角质形成细胞中p63及其靶基因Krt14和Irf6的蛋白产物进行Western blot。ERK被用作负荷控制。(G公司)突变角质形成细胞p63抑制靶基因的实时RT-PCR(n个= 3). (H（H）)野生型（WT）和K14-Cre表皮K14（绿色）和FLAG标记的p63L514F（红色）的免疫荧光；第63页L514Fflox/L514F flox（L/L）小鼠P0。（比例尺：50μm）(我)L/L突变小鼠的宏观表型。大约10%的新生小鼠出现大面积皮肤糜烂(左侧). 100%的突变小鼠在P7-P8处观察到皮肤结痂和溃疡，并伴有体型缩小和脱水(赖特). (J型)+/+和L/L表皮p63靶基因的实时RT-PCR(n个= 6). (K（K）)BN-页码(上部)和SDS/PAGE(下部)然后用Western blot检测感染Ad-Cre或Ad-GFP的小鼠原代角质形成细胞的p63D类. (L（左）)BN-页码(上部)和SDS/PAGE(下部)然后用Western blot检测从具有指定基因型的小鼠分离的原代角质形成细胞中的p63。数据显示为平均值±SEM，但以下数据除外D类其中误差条表示SD。使用配对双尾模型评估统计显著性t吨测试(J型)和单因素方差分析(A类,E类、和G公司). *P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.001; ***P（P）≤ 0.0001.
图4。
图4。
AEC相关的p63突变蛋白在细胞中表现出受损的DNA结合。(A类)过度表达p63野生型（WT）的HEK293细胞KRT14启动子的ChIP-qPCR和指示突变体(n个= 6) (上部)和SDS/PAGE(下部)然后用Western blot检测p63和β-肌动蛋白(下部). (B类)p63 WT和p63L514F共转染HEK293细胞p63增强子的ChIP-qPCR(n个=5）和相对SDS/PAGE(下部)如中所示A类. (C类)来自p63的原代角质形成细胞中指定的p63应答增强子的ChIP-qPCRL514Fflox/L514F flox（hom）小鼠感染Ad-Cre。感染Ad-GFP的角质形成细胞作为对照（ctr）(n个= 4). (D类)在如下条件下对原代角质形成细胞中指示的p63重表达基因元件进行ChIP-qPCRC类(n个= 3). (E类)用与人CDKN1A启动子上p63反应元件相对应的固定化DNA寡核苷酸对体外翻译的p63进行下拉（PD）分析和Western blot。输入（IP）。下拉效率百分比如赖特(n个= 3). 数据显示为平均值±SEM，但以下数据除外E类其中误差条表示SD。使用配对双尾模型评估统计显著性t吨测试(C类和D类)和单向方差分析(A类,B类、和E类). *P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.001; ***P（P）≤ 0.0001.
图5。
图5。
通过降低AEC相关突变体p63的聚集倾向来恢复转录活性。(A类–C类)BN-页码(上部)和SDS/PAGE(下部)然后进行p63蛋白的Western blot和转染HEK 293细胞的指示突变和缺失。(D类–F类)HEK293细胞KRT14启动子野生型和突变型p63荧光素酶报告子检测(n个= 3) (上部). 荧光素酶数据标准化雷尼利亚荧光素酶活性。SDS/页面(下部)随后显示野生型和突变体p63的蛋白质印迹作为对照。(G公司)通过与KLF4和指示的p63病毒共同感染，HDF中指示的角蛋白细胞特异性p63靶基因转化为iKCs的实时RT-PCR。(H（H）)iKCs中KRT14和p63的蛋白印迹。β-actin作为负荷对照。数据显示为平均值±SEM，并使用单因素方差分析评估统计学显著性*P（P）≤ 0.05; **P（P）≤ 0.001; ***P（P）≤ 0.0001.
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