氨基酸对mTORC1活性至关重要，因为在缺乏氨基酸的情况下，生长因子无法有效激活mTOR5,9尽管参与溶酶体表面mTOR活化的蛋白质数量不断增加，但氨基酸传感机制的分子性质仍然难以捉摸1,2,4,9-13属于能够在质膜上运输氨基酸家族的溶质载体（SLC）基团的几个成员已被证明可以调节mTOR活性14，增加了SLC也可能参与溶酶体传感的可能性。我们假设存在一种普遍表达的SLC，属于一个能够进行氨基酸转运的家族15亚细胞定位与溶酶体氨基酸传感兼容。在两种不同细胞系中强烈表达的SLC列表中，我们将重点放在SLC38家族的成员9上，因为它完全没有特征性，表现为囊泡染色16通过蛋白质组分析与溶酶体相关17(). SLC38家族包含11个成员，是由SLC32和SLC36家族组成的氨基酸转运蛋白系统发育簇的一部分18(). SLC38A9预计包含11个跨膜螺旋和一个120-残留细胞质N末端区域。肽治疗-N个-糖苷酶（PNGase）F表明SLC38A9高度糖基化，能够检测内源性蛋白(). 在HEK293T细胞中，短发夹RNA（shRNA）沉默SLC38A9可能对生长调节途径起作用，导致细胞大小和细胞增殖减少().
为了测试SLC38A9是否与复合调节mTORC1相关，我们设计HEK293细胞以诱导方式表达标记的SLC38A 9，并验证该蛋白在溶酶体中的定位(). 我们使用串联亲和纯化（TAP）结合一维无凝胶液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）纯化内源性组装蛋白复合物。无凝胶方法至关重要，因为沸腾后SLC38A9会形成无法进入SDS-聚丙烯酰胺凝胶的不溶性聚集体(). 分析确定Ragulator/LAMTOR复合物的所有五个成员和四个RAG GTPase是SLC38A9的特异性相互作用物(,). Ragulator/RAG GTPases复合物所有成分的这种集体高序列覆盖强烈表明SLC38A9是一个额外的非特征化成员。当在HEK293T细胞中共同表达时，SLC38A9与LAMTOR1共同免疫沉淀，并且过度表达的LAMMOR1结合内源性SLC38A 9(). 我们完全在不同细胞系的内源性水平上验证了复杂成员关系。SLC38A9的免疫沉淀导致内源性RAGA和LAMTOR1的特异性招募，相反，免疫沉淀RAGA结合的SLC38A 9(). 当沉默SLC38A9时，没有观察到这种关联，从而证实了特异性。HeLa和K562细胞中显示内源性SLC38A9和RAGA的关联()在小鼠NIH/3T3成纤维细胞和RAW 264.7巨噬细胞中(). 为了进一步挑战特异性，我们对SLC38家族的两个最高表达成员SLC38A1和SLC38A2以及SLC36A1/PAT1应用了相同的蛋白质组策略，这两个成员之前与Ragulator/RAG GTPase复合物相关19。尽管诱饵回收率很高，但在相互作用物中没有发现Ragulator/RAG GTPase复合物成员，这突出表明SLC38A9与该复合物的结合是该家族成员的独特属性(). 此外，当我们免疫沉淀SLC38A9、SLC38A1、SLC39A2、SLC36A1/PAT1以及SLC38家族的溶酶体成员SLC38A 7时20和SLC36家族的第二个成员SLC36A4/PAT4，只有SLC38A9共同免疫沉淀内源性LAMTOR1、LAMTOR3、RAGA和RAGC具有低和高表达水平().
SLC38A9是控制mTORC1的氨基酸感应机械的溶酶体成分a、，通过TAP–LC-MS/MS鉴定SLC38A9的相互作用体。所示数据基于两个独立实验（n=2），每个实验在两个技术复制中进行分析。b至g，来自用所示标记的构建体或空载体转染的HEK293T细胞的裂解物（−）(b、 c，克)，对照（空载体或shGFP）或shSLC38A9转导的HEK293T(d日)和赫拉(e（电子）)或K562(（f）)细胞进行免疫沉淀。PNGas处理的免疫沉淀物（IP）和蛋白提取物（XT）用所示抗体进行免疫印迹分析。结果代表了两个独立实验（n=2）<：ST-HA-SLC38A9；*：非特异性带h-j，转染标记SLC38A9构建物并用抗HA和LAMP1免疫染色的HeLa细胞的共焦显微镜图像(小时)、EEA1(我)或吉安丁(j个)抗体。显示了具有代表性的单元格。比例尺，10μm。
对HeLa细胞中标记的SLC38A9进行免疫染色显示，与晚期内体/溶酶体标记LAMP1、CD63和晚期内体或多泡体脂质LBPA广泛共定位，但与早期内体（EEA1）或高尔基体（Giantin）标记不共定位(,). 这支持SLC38A9是Ragulator/RAG GTPase复合物的溶酶体成分。
这种多蛋白复合物的完全成员资格需要在相互纯化中与几个检测到的成员中的任何一个进行物理联系。我们使用LAMTOR1、3、4和5，以及RAGA和RAGC GTPases进行亲和纯化并结合质谱分析。在结合六个独立纯化得到的相互作用网络的核心，我们发现Ragulator/RAG GTPases复合体、RAPTOR以及SLC38A9的所有预期成员(,). SLC38A9的总体低序列覆盖率可能归因于蛋白质不可访问的跨膜部分的低效蛋白水解裂解，因为它反映了当SLC38A 9用作诱饵时获得的覆盖率(). 免疫沉淀证实了内源性SLC38A9与所有诱饵的相互作用(). 通过检测v-ATP酶复合物的亚单位VA0D1也表明了蛋白质组调查的质量7和FLCN-FNIP2复合体11有趣的是，在与Ragulator/GTPases复合物成员的任何纯化中，我们都没有检测到氨基酸转运蛋白家族的任何其他SLC成员，这表明SLC38A9至少在这个细胞系统中是唯一显著相互作用的SLC。
SLC38A9是Ragulator/RAG GTPases机械的组成部分a、，通过TAP–LC-MS/MS鉴定了LAMTOR1、LAMTOR3、LAMTOR 4、LAMTOR5、RAGA和RAGC的相互作用体。显示了与所有诱饵蛋白相互作用的蛋白质，添加了RAGC下拉中未检测到的RAGD。指出了之前公布的检测到的Ragulator/RAG GTPases复合物的相互作用物。所示数据基于每个条件（n=2）的两个独立实验，每个实验在两个技术复制中进行分析b-e、，HEK293T细胞转染有标记的构建物或空载体（−）。免疫沉淀物和细胞提取物用PNGase处理并进行免疫印迹分析。SLC38A9突变结构体标记有编码氨基酸的数量(d日)或氨基酸基序被丙氨酸取代(e（电子）). 结果代表了两个独立实验（n=2）。
缺失研究表明，SLC38A9的N-末端细胞质尾部（氨基酸1-112）缺乏任何跨膜区，足以并需要结合Raulator/RAG GTPases复合物，而当剩余的11个含跨膜区（113-561），保留溶酶体定位(,). 我们进一步将最小相互作用区定位到氨基酸31-112，并在该部分鉴定了四个保守的基序(). 前三个基序中的任何一个基序的突变都完全取消了结合，而第四个基序被破坏则没有效果(,). 重要的是，所述突变均不影响SLC38A9的溶酶体靶向性(). 虽然N端细胞质区域在SLC38A9蛋白中是进化保守的，但我们无法检测到与任何其他SLC38家族成员的N端区域的任何显著同源性。这些结果确定了SLC38A9独特的细胞质部分负责与溶酶体mTOR激活机制的相互作用。
SLC38家族通常有能力运输谷氨酰胺18,20与亮氨酸和精氨酸一起被认为是参与mTORC1调节的主要氨基酸9,14,21我们监测了用纯化的重组SLC38A9重组脂质体中SLC38A对这些氨基酸的转运能力(). 在蛋白质脂质体中，位于小泡外表面的细胞质尾部，与溶酶体中观察到的方向相对应(). 添加[三H] -谷氨酰胺导致时间依赖性转运()这需要脂质体内钠，但不需要添加外部钠，并且在酸性pH（pH5.5-6.5）下最为活跃(，未显示），与天然蛋白质的溶酶体定位一致。此外，推定的钠结合位点（N128A）的点突变22中度受影响的运输(). 缬氨霉素存在下钾梯度人工产生的膜电位23SLC38A9（未显示）的运输活性不受外部或内部阳性的影响。竞争实验表明，一些极性氨基酸能够有效竞争谷氨酰胺转运，而系统A SLC38家族成员的抑制剂MeAIB则没有作用(,). 直接转运分析进一步揭示了SLC38A9对[三H] -精氨酸和[三H] -天冬酰胺，但不适用于[三H] -亮氨酸或[三H] -组氨酸(). 精氨酸与谷氨酰胺转运竞争能力低，之前也报道过SLC38A720，可能反映了这两种氨基酸的结合和/或转运特性的差异。计算出10μM谷氨酰胺的初始摄取率为0.42±0.10 nmol/mg蛋白质/分钟，与其他重组转运蛋白相比，这是适度的23如果SLC38A9的生理作用是评估氨基酸在溶酶体内的可用性，那么测量其流出使能活性也是相关的。我们监测了[三H] -来自蛋白脂质体的谷氨酰胺，并测得1.7±0.30 nmol/mg/min的速率()，这高于摄取量，但总体上仍低于用相同方法测量的其他几种氨基酸转运蛋白23这表明SLC38A9可能是一种与SLC38A类似的低容量运输机20类似于酵母中氨基酸传感器的特性24和果蝇属25.
SLC38A9以核苷酸负载和氨基酸敏感性方式运输氨基酸并与RAG GTPases相互作用一，时间进程[三H] -用纯化的SLC38A9或对照空载体重组的蛋白脂质体中谷氨酰胺的摄取。数值表示八个不同实验（n=8）的比输送平均值±标准差。b、，氨基酸抑制[三H] -蛋白质脂质体中谷氨酰胺的摄取。数值表示三个独立实验（n=3）中相对于对照组（无添加竞争对手）±标准偏差的剩余活性平均值。c（c），吸收指示的[三H] 蛋白质脂质体中SLC38A9标记的氨基酸。数值表示三个独立实验（n=3）中在同一实验中测量到的谷氨酰胺转运百分比平均值±标准差。日期：，用SLC38A9重建的蛋白脂质体谷氨酰胺流出的时间过程。数值表示三个独立实验（n=3）得出的比输送平均值±标准差。e、，用标记的RAG GTPases突变构建物或空载体（−）的指示组合转染HEK293T细胞。PNGas处理的免疫沉淀物和细胞提取物通过免疫印迹分析。W： 野生型；66:Q66L；21:T21N；75：S75N；120:Q120L。f-g（胎龄）将稳定表达所示结构的HEK293T细胞饥饿氨基酸和血清50分钟（AA starv+），并用氨基酸刺激20分钟（AA stim+）。免疫印迹分析免疫沉淀物和细胞提取物。在克显示了两个生物复制的结果。*：IgG轻链。结果代表两个(e（电子）-（f），n=2）或三个(克，n=3）独立实验。在a-c公司通过Student t检验估计显著性(*P（P）<0.01或**P（P）< 0.001)
RAG GTPase异二聚体通过结合猛禽招募mTOR的能力关键取决于核苷酸负载状态和由此产生的两个GTPase伴侣的构象5通过免疫沉淀RAGA/B-RAGC核苷酸结合突变异二聚体的不同组合，我们可以概括与RAPTOR和LAMTOR蛋白的调节相互作用8,11并观察到SLC38A9与RAG GTPases的结合受其突变状态的显著影响，甚至比Ragulator复合物的影响更大(,). 低亲和力核苷酸结合突变体RAGAT21N型和RAGBT54N型与RAGC的行为相比，SLC38A9招募人数大幅增加S75N系列其消除了SLC38A9与异二聚体的结合。GTP绑定RAGAQ66升/B类Q99升突变体还显示SLC38A9结合降低(,). 这些结果表明，SLC38A9与配合物的关键GTPases部分的相互作用具有高度构象特异性。在稳定表达标记的SLC38A9的细胞中，氨基酸饥饿增强了SLC38A与内源性RAGC之间的相互作用，在较小程度上增强了RAGA，但没有显著影响LAMTOR1和LAMTOR3的招募(). 同样，氨基酸刺激减少了RAGC和RAGA的招募量。总之，这些结合性质的氨基酸敏感性特征唤起了Ragulator所发挥的作用8和卵泡素11并指出SLC38A9在调节RAG GTPases的核苷酸状态中的可能功能。氨基酸敏感性需要跨膜区域，因为RAGC仅由N末端区域招募不受氨基酸可用性的影响(). 这与十一个跨膜螺旋环绕区域是与身体接触的氨基酸部分的概念是一致的，并且需要传递敏感性。
氨基酸的提取导致mTORC1快速失活。通过底物S6激酶和ULK-1的磷酸化监测，稳定表达SLC38A9的细胞在氨基酸饥饿时表现出持续的mTORC1激活(,). 这导致氨基酸饥饿时延迟和减少自噬诱导，如LC3B重定位到自噬体的定量所示(,)以及转录因子TFEB的持续磷酸化和延迟核移位26(). 饥饿期间SLC38A9表达触发的持续mTOR活性被Torin 1抑制(). 相反，v-ATP酶抑制剂Concanamycin A在这种情况下没有作用，而它有效地阻断了由氨基酸刺激引起的mTORC1激活(). 这表明v-ATP酶复合物和SLC38A9共同参与氨基酸对mTORC1活性的控制。最有可能的是，SLC38A9的高表达水平导致了绕过v-ATP酶输入的活跃信号状态。事实上，N-末端区域的表达似乎足以赋予mTORC1延长的活化，这表明该部分呈现独立于跨膜区域的活性构象(,). 总之，数据表明SLC38A9是mTORC1功能的上游正调节器。
SLC38A9是氨基酸激活mTORC1所需的正调节因子a、，稳定表达野生型FLAG-SLC38A9-或FLAG-METAP2的HEK293T细胞在无氨基酸和血清的培养基中饥饿30分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物b、，将稳定表达EGFP-LC3B和SLC38A9或METAP2的HEK293T细胞饥饿指定时间。通过图像分析定量LC3B阳性自噬体。将数据归一化为细胞大小，并相对于拟合的METAP2最大值绘制。至少三个重复井的平均值±标准差。c。稳定表达所示未标记SLC38A9结构的HEK293T细胞按照一.d-e公司，用抗SLC38A9或GFP的慢病毒编码shRNA转导的HEK293T细胞饥饿50分钟，然后用氨基酸刺激(d日)或环己酰亚胺(e（电子），25μg/ml）10或20分钟。通过免疫印迹分析细胞裂解物。（f）用靶向SLC38A9、LAMTOR1或非靶向对照的siRNA转染HEK293T。72小时后，细胞按照d日.英寸(电子-传真降低)细胞裂解物用PNGase处理;*：非特异性带。克，SLC38A9在氨基酸诱导的mTORC1激活中的功能示意图模型。结果代表两个(a至e，n=2）或三个(（f）)独立实验（n=3）。
因此，shRNA沉默HEK293T中SLC38A9导致氨基酸诱导的mTORC1活化减少(). 培养时间较长的细胞表现出较弱的表型，可能是由于代偿性适应机制（未显示）。因此，我们通过小干扰RNA（siRNA）沉默SLC38A9，并观察到在HEK293T和HeLa细胞中抑制氨基酸诱导的mTORC1激活，其效率与敲除LAMTOR1相当(,). SLC38A9的耗尽还削弱了环己酰亚胺诱导的mTORC1活化，环己酰氨通过阻断蛋白质合成模拟氨基酸刺激，从而诱导细胞内氨基酸的积累5(). 这进一步表明，SLC38A9参与溶酶体mTORC1的激活，而不是促进细胞外氨基酸在质膜的输入。此外，SLC38A9水平似乎在氨基酸饥饿时未被诱导，而一些SLC负责在质膜上输入氨基酸().
总之，本文提出的工作将SLC38A9确定为溶酶体机制的一个新的组成部分，该溶酶体机械根据氨基酸控制mTORC1活性(). SLC38A9是整个机械的第一个成员，能够结合和运输氨基酸。与其他溶质载体蛋白一样，它应该具有显著的药物敏感性27在氨基酸刺激诱导的mTOR溶酶体募集中，我们未能观察到对SLC38A9的强烈依赖性，这可能是由于技术原因，或者更有趣的是，分离部分独立的控制mTOR定位和激活的机制。再加上SLC38A9长时间沉默后观察到的适应性，这表明额外的传感元件可能在该途径中工作。考虑到低转运能力以及与Ragulator/RAG GTPase复合体的物理联系，有理由将SLC38A9视为SLC的受体类型24,28-30这让人想起酵母氨基酸传感器GAP1和ssy1p，其中氨基酸参与用于变构信号转导，而不仅仅是运输。
方法
抗体
使用的抗体有SLC38A9（HPA043785 Sigma）、LAMTOR1（8975细胞信号）、LAMMOR3（8169细胞信号），RAGA（4357细胞信号）（5466细胞信号）和磷酸化p70 S6激酶（Thr389）（9234细胞信号））、磷酸化S6（Ser240/244）（2215细胞信号）或磷酸化-ULK1（Ser757）（6888细胞信号）以及raptor（2280细胞信号），ATP6V1B2（ab73404 Abcam）、ATP6V1A（GTX110815 GeneTex）、小鼠抗兔IgG（构象特异性）（3678细胞信号）、LAMP1（555798 Pharmingen和ab25630 Abcam，ULK1（8054细胞信号）、Tubulin（ab7291 Abcam）、RCC1（sc55559 Santa Cruz）、HA（H6533 Sigma、3724 Cell Signaling、MMS-101P Covance或sc-805 Santa Cru）、V5（ab9116-Abcam）、His（A7058 Sigma）、FLAG（F7425-Sigma）。所使用的二级抗体为山羊抗小鼠AlexaFluor568（A-11004和A-11031分子探针）、山羊抗兔AlexaFuor568[A-11036分子探针]、山羊抗鼠AlexaFluor488[A-11001分子探针]，山羊抗兔alexaFluor 488（A-11008分子探针）和HRP-结合抗体（Jackson ImmunoResearch）。
质粒
通过PCR扩增EST或从Addgene获得的质粒（RAGA：质粒19298（WT）和19300（Q66A）生成表达结构；RAGB:19301（WT）和19303（Q99A）；RAGC:19304；EGFP-LC3B:11645）或来自哈佛医学院质粒库（SLC38A1、SLC38A2、SLC39A7、SLC36A1、SLC6A4）并通过网关克隆（Invitrogen）亚克隆到pTRACER-CV5-GW或pTO-SII-HA-GW31带有SLC38A9、SLC38A1、SLC38m2、SLC39A7、SLC36A1、SLC6A4、RAGA、RAGB、RAGC和LAMTOR3（人和鼠）的N端标签，以及LAMTOR1、4和5的C端标签。通过定点突变（Invivogen）引入点突变。
细胞
从ATCC和DMSZ中获得HEK293T、Raw264.7、NIH/3T3和K562细胞。HeLa由M.Hentze提供。允许强力霉素依赖性转基因表达的TREx细胞中的HEK293 Flp-In来自Invitrogen。将细胞保存在补充有10%（v/v）FBS（Invitrogen）和抗生素（100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素）的DMEM（Sigma）或RPMI培养基（PAA Laboratories）中，并通过PCR或ELISA检查支原体。
转染、细胞裂解、脱糖、免疫沉淀和分离
细胞转染Polyfect（Qiagen），24小时后用于实验。为了进行裂解，将细胞重新悬浮在Nonidet-40裂解缓冲液（1%NP-40，50mM Hepes pH7.4，250 mM NaCl，5 mM EDTA，Halt磷酸酶抑制剂混合物（ThermoScific），每50 ml一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂（Roche））中5分钟。通过在微型离心机中离心（13000转/分，10分钟，4C）清除裂解液。蛋白质用BCA（Pierce）定量。对于免疫沉淀，在Sepharose6珠（Sigma）上预先分离裂解产物（旋转40分钟，4°C），然后用HA-、V5-或FLAG-偶联珠培养（旋转3小时，4°C）或用初级抗体和蛋白G-sepharose培养（GE healthcare）（旋转14小时，4℃）。在SDS-PAGE和免疫印迹分析之前，回收珠子并用裂解缓冲液洗涤四次。必要时，使用小鼠抗兔IgG（构象特异性）抗体进行免疫印迹，并与抗鼠HRP结合抗体一起显示，以避免检测免疫球蛋白重链。如果检测到内源性SLC38A9，则在SDS-PAGE之前用PNGase（NEB，250U，30 ul，1h，37°C）处理样品。如前所述进行核质细胞分离32.
稳定表达细胞的产生
使用具有CMV启动子（pLJM60）的改良pLKO.1慢病毒载体生成表达密码子优化的FLAG标记SLC38A9亚型1（GenScript）的HEK293T细胞。使用XTremeGene 9转染试剂（Roche）将带有ΔVPR包膜的慢病毒转移载体和CMV VSV-G包装质粒共同转染到HEK293T细胞中，从而产生慢病毒。转染DMEM后24小时更换培养基，补充30%IFS。洗涤、过滤后48小时和72小时收集含病毒上清液，并在8μg/mL聚合物存在下用于靶HEK293T细胞的旋转感染（2200 rpm，1小时）。感染24小时后，去除病毒，用嘌呤霉素筛选细胞。使用修饰的pMSCV逆转录病毒载体产生HEK293T表达密码子优化的未标记或SII-HA标记的SLC38A9（GenScript）全长、C末端（113-561）或N末端区域（aa 1-112）。表达EGFP-LC3B或TFEB-STHA的细胞通过感染FLAG-SLC38A9或FLAG-METAP2稳定细胞，使用改良的pMSCV逆转录病毒载体和杀鼠素选择产生。
RNA干扰
对于shRNA介导的敲除，使用编码靶向SLC38A9（ThermoFisher，TRCN0000151238）或GFP（ThermoFisher，RHS4459）的pLKO.1的shRNA。使用第二代包装质粒pMD2-VSVG和pCMV-R8.91生产慢病毒。HEK293T细胞与包装质粒和shRNA编码质粒共转染。转染后16h清洗细胞。洗涤24h后收集含病毒上清液，过滤后用于感染。感染48小时后，用嘌呤霉素（4μg/ml）筛选HEK293T细胞，并在3至7天后用于实验。对于siRNA-介导的敲除，HEK293T细胞转染含有30 nM siRNA池的Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）；HeLa with HiPerfect（Qiagen）with 60 nM siRNA池。48小时后，接种细胞，24小时后进行氨基酸刺激。ON-TARGETplus SMARTpool对抗SLC38A9（L-007337-02，靶序列：ACACUGAAGAGAGAGUACGGUAA、GAUCCUGGACUAGAAUA、GAAGAGCUGUAUA、CAUGUCAUCAGAGGUUA）、LAMTOR1（L-020916-02，靶顺序：UCUCCAGGAUAGCUGCCUUA、GGUACAGUACCCUAA、AAGUGGAACCUU、GUGUCACCUCGAUAAA）和非靶池（D-001810-10）来自ThermoScific。
蛋白质组学
如所述，产生可诱导表达SII-HA标记的SLC38A9、SLC38A1、SLC39A2、SLC36A1、RAGA、RAGC、GFP或LAMTOR复合亚单位的Flp-in HEK293 T-Rex细胞系33如前所述进行串联亲和性STREP-HA纯化31简而言之，用强力霉素/四环素刺激细胞24小时，以诱导SII-HA-标记诱饵蛋白的表达。使用小鼠蛋白版本进行LAMTOR3下拉，并在无血清培养基中饥饿9小时后进行。用链霉亲和素琼脂糖通过TAP分离蛋白质复合物，然后用生物素洗脱，第二步用HA琼脂糖珠纯化。蛋白质用100 mM甲酸洗脱，用碳酸氢三乙基铵（TEAB）中和，用胰蛋白酶消化，肽用LC-MS/MS分析。
MS数据分析和交互数据过滤
使用ProteoWizard（3.0.3201版）从RAW文件中提取峰值列表数据-http://proteomwizard.sourceforge.net/)并对照人类SwissProt数据库版本v2013.01_20130110（37261个序列和常见污染物）进行搜索。搜索引擎MASCOT（v2.3.02，MatrixScience，英国伦敦）和Phenyx（v2.5.14，GeneBio，瑞士日内瓦）34使用。使用内部perl脚本，在前体离子和碎片离子质量容差分别为±10 ppm和±0.6 Da的条件下，将搜索结果提交给MASCOT。使用本次搜索的高置信度鉴定，在MASCOT和Phenyx上重新校准前体和碎片离子质量，以进行二次搜索，前体和片段离子质量容差分别为±4 ppm和±0.3 Da。允许一次胰蛋白酶误食。氨基甲基半胱氨酸和氧化蛋氨酸分别被设定为固定修饰和可变修饰。如前所述，蛋白质和肽的错误发现率分别为<0.25%和<0.1%35SAINT AP-MS过滤软件36用GFP TAP作为阴性对照筛选相互作用。SAINT AvgP>0.95的所有猎物蛋白均被鉴定为高置信相互作用物。此外，光谱计数为1或CRAPome的蛋白质37排除>0.1的频率。对于LAMTOR-RAG网络，我们只保留那些与所有诱饵蛋白相互作用的蛋白质（RAGC下拉中未检测到RAGD）。
免疫荧光
HEK293T细胞被镀在涂有纤维连接蛋白的玻璃盖玻片上，16小时后用多西环素诱导。24h后，用PBS清洗细胞，固定（PBS，4%甲醛）并渗透（PBS、0.3%皂苷、10%FBS）。将载玻片与抗HA（sc-805 Santa Cruz）、抗LAMP1（ab25630 Abcam）或抗LAMP2（sc-18822 Santa Cru）抗体孵育（1小时，25°C，PBS，0.3%皂苷，10%FBS）。三次清洗后，将载玻片与山羊抗鼠AlexaFluor568或抗兔AlexaFlour488抗体（Invitrogen，1小时，25°C，PBS，0.3%皂苷，10%FBS）孵育。DAPI染色后，将载玻片洗涤三次，并用ProLong Gold（Invitrogen）固定在盖玻片上。使用蔡司激光扫描显微镜（LSM）700拍摄图像。图像从lsm文件导出到tiff文件，并使用自定义的Matlab代码进行分析。基于DAPI和联合免疫荧光染色分别检测细胞核和细胞轮廓，共定位测量仅限于细胞质区域。在LAMP1或LAMP2（红色）通道中，彩色化是指SCL38A9（绿色）像素值高于背景的百分比。经验证，SLC38A9和LAMP1或LAMP2共定位对背景阈值的变化具有鲁棒性，并且还显示出红色和绿色通道之间的显著像素值相关性。
HeLa细胞接种到80%的融合处进行转染（Lipofectamine LTX，Invitrogen）。转染24小时后，将细胞分裂成玻璃盖玻片，再培养24小时。然后用PBS清洗细胞，并将其固定在细胞骨架缓冲液中的4%PFA中（20mM Pipes pH6.8、150mM NaCl、5mM EGTA、5mM葡萄糖和10mM MgCl2）。通过在添加了0025%皂苷和50mM NH4Cl的细胞骨架缓冲液中培养细胞，可以同时进行渗透和阻断。然后在室温下用在封闭缓冲液中稀释的一级抗体孵育细胞2小时。然后在补充有50mM NH4Cl的细胞骨架缓冲液中清洗细胞6次，并在室温下与在封闭缓冲溶液中稀释的二级抗体培养45分钟。在补充有50mM M NH4Cl的细胞框架缓冲液中冲洗6次后，使用Vectashield硬化介质（vectorlabs）安装盖玻片。使用SP5激光扫描共焦显微镜（Leica）和63x油浸物镜（na1.4）拍摄Z堆栈图像。使用惠更斯专业反褶积和分析软件（科学体积成像）对原始图像进行反褶缩。然后在ImageJ（开源版本）中可视化Z堆栈ID文件，将其转换为彩色堆栈图像，并选择具有代表性的Z平面。单平面图像最终转换为Adobe Photoshop CS6格式。代表性细胞在所有图中以相同的曝光和放大倍数显示。
细胞大小和自噬体测量
用shRNA转导的抗SLC38A9或GFP细胞的HEK293T细胞在固定前24 h接种（PBS，4%甲醛）、渗透（PBS、0.3%皂苷、10%FBS）并用DAPI染色。使用PerkinElmer Operetta在共焦模式下放大20倍，通过自动显微镜拍摄图像。使用CellProfiler分析图像(网址：www.cellprofiler.org)，细胞分类器(http://www.pelkmanslab.org/？page_id=63)，人口上下文度量代码(https://www.pelkmanslab.org/？page_id=1150)以及专门为本研究编写的自定义Matlab代码。使用CellProfiler检测每个图像上的单个核，使用CellClassifier进行迭代机器学习以检测正确分割的间期核。使用群体背景测量代码测量每个单个细胞的局部细胞密度，细胞大小测量仅限于稀疏细胞，以避免局部拥挤混淆测量结果。我们使用典型的细胞核直径（即与每个细胞核测量的面积相同的圆形直径）作为细胞大小的可靠代理38。我们证实，SLC38A9 shRNA处理诱导的细胞尺寸缩小在不同的局部细胞密度范围内都存在。将EGFP-LC3B和SLC38A9或METAP2表达细胞接种在96孔板中进行成像。24小时后，用PBS清洗细胞，并在指定的时间内饥饿氨基酸和血清。用Operetta在活细胞上以20倍放大率采集每孔三乘三图像，以尽量减少EGFP-LC3B阳性自噬体的破坏。图像细胞固定后，DAPI染色并重新植入。使用自定义Matlab分析，基于8至30像素直径的积分拉普拉斯高斯变换阈值，从GFP通道定量自噬体。丢弃局部GFP信号富集度小于42%的候选斑点，其余斑点被视为自噬体，并根据每种情况的细胞数量和面积进行标准化。每种情况都在三个重复孔中测量，共有85000多个细胞。在METAP2对照细胞系中拟合调整后的希尔曲线，并将数据归一化为最大拟合值。
细胞增殖测量
接种用针对SLC38A9或GFP的shRNA转导的HEK293T细胞，并使用Casy（Roche）每24小时计数一次。
氨基酸饥饿和刺激
用PBS清洗RPMI中生长的HEK293T细胞，并通过在无血清的无氨基酸RPMI中培养细胞50分钟来进行饥饿处理。然后通过添加含有两次浓缩氨基酸溶液的RPMI刺激细胞10或20分钟。刺激后，培养基中氨基酸的最终浓度与RPMI中相同。在放线菌酮治疗的情况下，通过添加最终浓度为25μg/ml的无氨基酸RPMI中稀释的放线菌胺来刺激氨基酸保护的细胞。通过添加含有两倍浓度氨基酸和胰岛素溶液（最终浓度为1 uM，Sigma，I9278）的RPMI刺激在RPMI中生长的HeLa细胞10或20分钟。Concanamycin A（sc202111 Santa Cruz）在5μM下使用，Torin 1（4247，Tocris Bioscience，）在250 nM下使用。用碳酸氢钠和磷酸钠补充无氨基酸RPMI培养基粉末（R8999-04A，US biological），溶解于水中，调节至pH7.4并过滤。通过将无氨基酸RPMI培养基与RPMI 1640氨基酸溶液（R7131，Sigma）互补，获得含有两次浓缩氨基酸溶液的RPMI，调节至pH7.4并过滤。在使用前不久添加L-谷氨酰胺（59202C，Sigma）。
RNA测序
使用TRI试剂（SIGMA）提取RNA，用DNAse I（无DNA试剂盒，Ambion）和RiboZero试剂盒（Epicenter）处理以去除核糖体RNA。该文库使用ScriptSeq试剂盒版本1（Epi中心-链特异性文库）制备。对Illumina HiSeq 2000进行测序。使用TopHat将fastq格式的序列读取与RefSeq hg19构建（2011年9月9日下载）对齐，并使用Cufflinks计算FPKM值。
定量PCR
使用RNeasy Mini Kit（Qiagen）分离总RNA。使用寡核苷酸（dT）引物，使用RevertAid逆转录酶（发酵剂）逆转录RNA。使用SensiMix SYBR试剂盒（Bioline）在RotorGene RG-600（Qiagen）PCR机器上进行定量PCR。使用2对结果进行量化-ΔΔC（t）方法，使用GAPDH表达水平进行归一化。引物：SLC38A9_Fw:TCCTTGGGCAGTGGTCGAG，_Rev:ACCCGGCACTTGGACAAA；GAPDH_Fw:GAAGGTGAAGGTCGGAGT，版本：GAAGATGGTGATGATTC。
重组人SLC38A9的克隆、表达和纯化
人SLC38A9 cDNA根据大肠杆菌GenScript使用密码子。在这个优化的基因中，密码子适应指数（CAI）从0.63（野生型）提高到0.87，GC含量和不利峰被优化以延长mRNA的半衰期，核糖体结合位点被去除。然后将优化的cDNA亚克隆到表达载体（pH6EX3-His6-hSLC38A9）39.质粒用于转化大肠杆菌Lemo21（DE3）pLys（NEB）。如前所述选择LB-agar39添加0.1 mM鼠李糖以调节RNA聚合酶表达。添加0.4 mM IPTG细胞后，在39°C下培养2 h。细胞按照之前所述进行处理39用SDS-PAGE分析细胞裂解液组分的蛋白质模式。用100 mM Tris/HCl洗涤来自表达SLC38A9的细胞或空载体转染细胞的不溶性细胞部分（约1.5 mg蛋白质），并将其重新悬浮在100 mMβ-ME、3.5 M尿素、0.5%沙克糖、200 mM NaCl、10%甘油、20 mM Tris/HCl pH 8.0中，并在12000 g下在4℃离心10 min。将所得上清液（约1mL）施加到填充有His-select镍亲和凝胶（Sigma）的柱（0.5cm×2.5）上，所述His-select镍亲和凝胶用8mL 0.1%的沙科西、200mM的NaCl、10%的甘油、10mM的Tris/HCl pH 8.0预处理。用10 mL 0.1%C进行洗脱12E类8，150mM NaCl，10%甘油，5mM DTE，10mM Tris/HCl pH 8.0（洗涤缓冲液），1.4mL相同缓冲液加10mM咪唑；然后用1.4 mL相同缓冲液加50 mM咪唑洗脱纯化的蛋白质部分（4-7μg蛋白质）。
SLC38A9在蛋白质脂质体中的重组及转运测定
如前所述，通过去除洗涤剂来重组SLC38A9或空载体制剂的纯化部分40采用分批程序从400μL蛋白质（约2μg蛋白质，0.1%C）混合物中提取12E类8，β-ME 6 mM，10%甘油，20 mM Tris/HCl pH 8.0，150 mM NaCl，50 mM咪唑），80μL 10%C12E类8，100μL 10%蛋黄磷脂（w/v），20 mM Hepes/Tris pH 6.5。600μL蛋白质脂质体通过Sephadex G-75柱（直径0.7 cm×高度15 cm），用20 mM Hepes/Tris pH 6.5进行预平衡。开始添加10μM的传输（摄取）测量[三H] 谷氨酰胺或其他放射性底物（0.5μCi/nmol）至25°C下的100μL蛋白脂质体等分试样。通过在葡聚糖凝胶G-75柱（0.6×8 cm）上应用每个蛋白质脂质体样品来停止转运，以分离外部和内部放射性。在竞争实验中，将指示的氨基酸（1 mM）与[三H] -谷氨酰胺（10μM）和转运在60分钟时进行测量。对于流出量测量，将同一池蛋白脂质体的等分样品通过Sephadex G-75柱（直径0.7 cm×高度15 cm），用20 mM Hepes/Tris pH 6.5预平衡，与外部10μM孵育[三H] 谷氨酰胺。加载120分钟后，蛋白质脂质体再次通过Sephadex G-75柱（直径0.7 cm×高度15 cm），用20 mM Hepes/Tris pH 6.5进行预平衡，以去除残留的外部放射性。时间进程[三H] 然后，通过在Sephadex G-75柱（0.6×8cm）上应用蛋白质脂质体样品来测量谷氨酰胺流出量，从而在每个时间间隔内阻止流出反应，以分离外部放射性和内部放射性。在摄取和流出分析中，用1 mL 50 mM NaCl洗脱的蛋白质脂质体收集在闪烁鸡尾酒中进行计数。如前所述，估计重组蛋白的量39时间进程数据由一阶速率方程插值，根据该方程，初始传输速率被计算为k×平衡传输。L-谷氨酰胺[3，4-三H（N）]来自PerkinElmer；L-组氨酸[环-2,5-三H] ，L-天门冬氨酸[三H] 来自Campro Scientific。
SLC38A9在蛋白质脂质体中的定位
纯化后，将His-SLC38A9在37°C下在没有或存在1 U凝血酶的情况下培养过夜（GE healthcare），然后使用抗-His或抗-SLC38A9抗体进行免疫印迹分析。为了评估SLC38A9的取向，重组蛋白脂质体在108.000×g下离心90分钟，再悬浮在20 mM Hepes/Tris pH 6.5中，在与纯化蛋白相同的条件下，在37°C下与1 U凝血酶孵育过夜。孵育后，用2.5%SDS和0.2M Tris/HCl（pH 6.8）溶解蛋白质脂质体。并对纯化蛋白进行免疫印迹分析。
测定SLC38A9功能的pH值和脂质体内钠依赖性
在不同pH值的20 mM Hepes/Tris缓冲液中进行重组。通过添加10μM蛋白质脂质体开始转运（摄取）[三H] -谷氨酰胺在20 mM Hepes/Tris缓冲液中，与重组混合物的pH值相同，30分钟后停止。为了测试钠依赖性，从洗脱缓冲液中去除NaCl，纯化SLC38A9。在没有或存在20或50 mM NaCl的情况下进行重组，并进行转运（摄取）测量。
