分泌的Frizzled相关蛋白1（sFRP1）调节睾丸中精子细胞的粘附通过粘着斑激酶的去磷酸化及连接蛋白-3粘着蛋白复合物

全长sFRP1的克隆

利用AccuPrime高保真Taq（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA），用正义引物5′-GGGAAGTTTGCAGCGGA-3′和反义引物5’-GCAACCATGTGAACCCAAGAGC-3′从5日龄大鼠睾丸cDNA中扩增出全长sFRP1编码序列；由于sFRP1编码序列5′端的GC含量较高，聚合酶链反应（PCR）中包含6%二甲基亚砜（v/v）。根据大鼠sFRP1（GenBank）预测序列中5′和3′非编码区的一致序列设计引物XM_224987.5号和XM_001072532.2号). 3个睾丸样本的测序结果表明，sFRP1 cDNA的全长序列与XM_001072532.2记录相符。利用5′-CACATGGGCGTCGGGCG-3′和反义引物5′-CTTAAAACAGACTGGAGAGGACCTC-3′和AccuPrime Pfx Taq（Life Technologies）将sFRP1的编码序列克隆到pENTR/SD/D-TOPO（Gateway entry clone，Life-Technologies）中。pLenti7.3-sFRP1由入口克隆的标准Gateway LR重组协议产生，并用于生产慢病毒载体。使用Qiagen EndoFree Plasmid Maxi试剂盒（美国加利福尼亚州巴伦西亚市Qiangen）制备质粒。pLenti7.3-sFRP1和pLenti7.3.β-半乳糖苷酶（LacZ；Life Technologies）在37°C下用Bst98I消化2 h，并通过琼脂糖凝胶电泳进行分析，以确认在用于慢病毒载体生产之前没有随机重组。

实时定量PCR（qPCR）和半定量PCR分析

使用Trizol试剂（Life Technologies）提取不同年龄大鼠（3-60天龄）睾丸的总RNA，并使用Polytron（Kinematica，Luzern，Switzerland）进行均质。受污染的基因组DNA通过DNA酶I（生命技术）处理消除。使用M-MLV逆转录酶（美国威斯康星州麦迪逊市普罗米加）与随机六聚体和寡核苷酸dT以4:1的比例混合进行逆转录。PCR使用N个′,N个′-二甲基-N个-｛4-[(E类)-（3-甲基-1,3-苯并噻唑-2-亚基）甲基]-1-苯基喹啉-1-碘-2-基}-N个-丙基丙烷-1,3-二胺（SYBR绿色）实时PCR母液和ABI 7900HT实时PCR机器（生命科技）。循环参数为95°C 10分钟，50次95°C循环15秒，60°C循环1分钟，然后缓慢增加至95°C进行解离曲线分析。测试了一组家政基因[例如，次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt（小时）)，β-2-微球蛋白(企业对企业)，激活转录因子2(ATF2型)，核糖体蛋白S16(第16节)，TATA盒结合蛋白(TBP（待定）)，3-磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH公司)，肽基丙基异构酶A(Ppia公司)和核糖体蛋白L19(19卢比)]选择GAPDH使cDNA数量正常化，因为其mRNA水平在睾丸发育过程中保持最稳定。底漆由Primer Express 3.0软件（Life Technologies）设计。使用以下引物：sFRP1、正5′-CGTCTGCATGCAC-3′和反义5′-GATGGCCCCGATTTCAACTC-3′；GAPDH（GenbankNM_017008.3号)，5′-GCTGGTCATCAACGGAAAAC-3′和反义5′-GGTGAGACGCCAGTAGAC-3′。在计算折叠变化之前，GAPDH和sFRP1的扩增效率被确定为大致相等（～100%）C类_T型方法。使用睾丸、支持细胞和生殖细胞cDNA进行半定量PCR，以测定sFRP1 mRNA的表达。S16（Genbank{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”NM_001169146“，”term_id“：”310703681“}}NM_001169146)以ABI GeneAmp 2400热循环仪（Life Technologies）作为负载控制，通过5′-TCCGCTCAGTCCGTTCAAGTCT-3′和5′-GCCAACTTCTTGGATTCGCAGCG-3′反义引物扩增。在Genewiz（South Plainfield，NJ，USA）通过核苷酸测序确认了所有PCR产物的身份。

慢病毒载体的生产

Lenti-X 293T细胞（Clontech，Palo Alto，CA，USA）保存在补充有10%胎牛血清（FBS；Life Technologies）、3.7 mg/ml碳酸氢钠、1 mM丙酮酸钠、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2 mM谷氨酸MAX和0.1 mM MEM非必需氨基酸（Life Technols）的高糖DMEM中，22°C时pH值为7.4。细胞在含10%CO的增湿大气中保持在37°C₂：CO中90%的空气（v/v）₂孵化器。只有低传代数（<12）的细胞用于高滴度慢病毒载体包装。几种转染试剂和方法[例如在中试实验中测试了Fugene HD（美国印第安纳州印第安纳波利斯罗氏）、GeneJuice（德国达姆施塔特EMD4生物科学公司）、聚乙烯亚胺（Polysciences）和磷酸钙沉淀]的转染效率和慢病毒载体的滴度。GeneJuice被发现具有最高的滴度，但选择磷酸钙沉淀是因为它是最经济的试剂，并且对于高细胞密度原代Sertoli细胞培养物的转导产生了令人满意的滴度。简单地说，三块150mm的95%汇流板被分成十二块0.001%聚乙烯-我-转染前1天，赖氨酸/PBS（w/v）涂层-150mm板，在含有0.3%胆固醇的培养基（Life Technologies）中。转染前，用含0.3%胆固醇和25μM二磷酸氯喹的新鲜培养基替换细胞。对于12块150mm的板，270μg pLenti7.3-lacZ或pLenti7.3 sFRP1、180μg gag-pol和90μg pMD。G用于转染。质粒与1350μl 2.5 M氯化钙结合，并在无菌Milli-Q水中配制至13.5 ml（Millipore，Bedford，MA，USA）；13.5 ml 2×BBS{50 mM 2-[第二类（2-羟乙基）氨]乙磺酸盐（EMD4生物科学），280 mM NaCl，1.5 mM Na₂高性能操作₄将pH 6.95（22°C）的溶液滴入DNA混合物中，同时旋转并在室温下培养5分钟。将磷酸钙沉淀的DNA混合物（2.25 ml）添加到每个板中。细胞在37°C和3%CO的增湿大气中培养₂：97%空气（v/v）持续16 h。此后，用无血清UltraCulture培养基（瑞士巴塞尔Lonza）替换转染试剂，用100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2 mM谷氨酸MAX、0.1 mM MEM非必需氨基酸、0.3%胆固醇、，和4mM丁酸钠，并在10%CO的增湿大气中再培养32小时₂：收集第一轮原始慢病毒载体前的90%空气（v/v），并将其储存在4°C。在额外培养24小时后收集第二轮粗慢病毒载体。然后将这两个收集物合并，在2000年进行离心分离克持续10分钟，并通过0.45-μm PVDF膜过滤器（Millipore）过滤。为了纯化和浓缩慢病毒载体，首先将32 ml粗收集物添加到每个超离心管中，然后在PBS中添加3 ml 20%蔗糖（含1 mM EDTA），并在70000下离心克使用Beckman SW28摆斗转子（Beckman Coulter，Brea，CA，USA）在4°C下搅拌2小时。丢弃上清液，将慢病毒载体颗粒在总共200μl PBS（含1 mM EDTA）中在4°C下轻轻悬浮3小时，偶尔搅拌。为了测量慢病毒载体的滴度，0.5×10⁵Lenti-X 293T细胞接种在24孔板的每个孔中。在4μg/ml聚brene（溴化六甲菊酯）存在的情况下，用10倍的浓缩慢病毒载体连续稀释1d后转导细胞。转导后第2天，用PBS清洗细胞一次，37°C胰蛋白酶化5分钟，2000年离心克将细胞颗粒重新悬浮在1%的BSA、4 mM EDTA、5 mM氯化镁和40μg/ml DNaseI中3 min。BD Calibur（BD Biosciences，San Jose，CA，USA）进行流式细胞术，并使用FlowJo 7.6.5软件（Tree Star，Ashland，OR，USA。平均滴度为1×10⁹转导单位/ml按常规计算。

慢病毒载体的原代细胞培养和转导

从20 d龄大鼠的睾丸中分离出初级支持细胞，并按前面所述进行培养(27). 支持细胞以0.5×10的密度接种⁶细胞/厘米²如前所述，在F12/DMEM的Matrigel-coated培养皿中添加补充剂(27). 在第4天，当特殊连接形成时(例如、基础ES、TJ）模拟支持细胞BTB体内，总生殖细胞[如前所述分离(28)由于没有玻璃棉过滤步骤，因此我们的生殖细胞制剂中精原细胞：精母细胞：圆形精子细胞：伸长/伸长精子细胞的相对比率与体内(28,29)]以1:5的支持细胞与生殖细胞的比例添加到支持细胞中，以便组装特殊的支持生殖细胞连接，如顶端ES。为了分离初级总生殖细胞，使用了不使用酶（如胰蛋白酶）的机械程序(28). 简言之，将90日龄大鼠的睾丸脱囊，用无菌手术刀在装有F12/DMEM的皮氏培养皿中切碎生精小管约15分钟。然后，用离心机在100℃下收集释放到上清液中的总生殖细胞克用新鲜的F12/DMEM清洗球状小管（切碎的）两次，以释放剩余的生殖细胞和这两次清洗的上清液（每一次在100℃下离心克持续2分钟），并将其合并。然后用Mira布（EMD Millipore）和100μm细胞过滤器（BD Falcon；BD Biosciences）过滤上清液。总生殖细胞在500克10分钟，并用F12/DEM洗涤沉淀的细胞3次。然后在F12/DMEM中重组颗粒细胞，并用40μm细胞过滤器过滤。过滤后的细胞在500克10分钟，并重新悬浮在培养基中，与原代支持细胞相同(27)补充6 mM乳酸钠和2 mM丙酮酸钠。此时，将重组sFRP1加入浓度为2.5μg/ml的培养液中。2天后，在免疫沉淀裂解缓冲液中终止Sertoli生殖细胞共培养(30). 为了在Sertoli生殖细胞共培养中过度表达sFRP1，以0.3×10的密度接种Sertoli细胞⁶细胞/厘米²选择这种细胞密度是因为它具有最强的过度表达，并且TJ和基础ES在Sertoli细胞之间仍保持不变。在Sertoli细胞分离后第2天，添加携带sFRP1或lacZ转基因的慢病毒载体，多重感染率为2，存在4μg/ml聚brene。3小时后更换新鲜培养基。在添加总生殖细胞之前，将支持细胞维持2天，支持细胞与生殖细胞的比例为1:5。在收集细胞裂解液和条件培养基之前，将支持生殖细胞共培养物进一步培养2 d。

免疫印迹和免疫沉淀

免疫印迹和免疫沉淀基本上与前面描述的相同(31). 蛋白裂解物（25μg）和Sertoli生殖细胞共培养条件培养基（50μl）用于免疫印迹。使用300μg蛋白质免疫沉淀连接蛋白3。除检测到对FAK-Tyr外，所有膜在5%脱脂奶粉（w/v）中被封闭³⁹⁷和对酪氨酸（Tyr），其中膜在5%BSA（w/v）中被阻断，并用含有0.1%吐温20的TBS（15.2 mM Tris HCl，4.6 mM Tris，150 mM NaCl，pH 7.6，22°C）清洗。本文报告的不同实验中使用的所有抗体均列于表1.

免疫荧光显微镜

固定sFRP1处理或对照（BSA处理）大鼠的冷冻睾丸切片，并对其进行染色，以检测下列抗体表1.将连接蛋白-3与对-FAK-Tyr共定位³⁹⁷，切片在−20°C的甲醇中固定10分钟。对于肌动蛋白[魔芋苷-荧光素异硫氰酸盐（FITC），1:100；Sigma]和Arp3共定位，切片在室温下固定在4%多聚甲醛/PBS（w/v）中10分钟，然后用0.2%Triton X-100（v/v）渗透5分钟。如前所述进行图像采集和分析(30,31).

电子显微镜

Sertoli生殖细胞共培养中的功能性连接，特别是顶端ES，基本上如前所述通过电子显微镜进行了表征(29,32). 总之，支持细胞以0.5×10的浓度单独培养4天⁶细胞/厘米²在Matrigel-coated 60-mm培养皿上（如参考文献所述，分离后约36小时进行低渗处理，以溶解残余生殖细胞。33)或与总生殖细胞以1:5的Sertoli：生殖细胞比共培养2 d，通过将细胞固定在2.5%（v/v）戊二醛和2.5%（w/v）多聚甲醛中0.1 M二羧酸缓冲液（22°C时pH为7.5）中1 h，终止培养。细胞后固定在OsO中₄并用醋酸铀酰染色。在升序乙醇中脱水后，通过环氧丙烷处理从60-mm培养皿中分离出支持细胞或共同培养的支持细胞和生殖细胞，并将其嵌入EPON块中（电子显微镜科学，宾夕法尼亚州华盛顿堡，美国；参考。34). 银切片是在Reichert Ultracut E超微粒机（美国纽约州德普市Reicher）上获得的，电子显微照片是在80 kV下使用Jeol 100CXII电子显微镜（美国Jeol，马萨诸塞州皮博迪市Peabody）获得的。电子显微镜是在洛克菲勒大学生物成像核心设施进行的。

一般方法

使用DC蛋白质分析试剂盒（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）和Bio-Rad分光光度计（680型）测定蛋白质估计值。cDNA克隆和PCR产物的真实性由Genewiz的直接核苷酸测序证实。

sFRP1延缓精子生成体内

自从发现图1暗示sFRP1的下调可能参与了对精子的控制，因此，我们通过在成年大鼠睾丸内注射重组sFRP1-蛋白来检测这一作用。向90日龄大鼠的每个睾丸（2.5μg/ml或67.6μM）注射单剂量的4μg sFRP1重组蛋白。在处理后6 h、1、2和4 d获取睾丸并进行石蜡切片，以进行形态学检查。我们实验中使用的sFRP1数量在文献中可以发挥生物功能的范围内(36——38). 此外，该浓度是根据初始浓度选择的在体外使用不同浓度重组sFRP1的Sertoli生殖细胞共培养进行试点实验，以确定pFAK磷酸化状态的变化（见下文）。此后，浓度为2.5μg/ml(即，67.6 mM）体内这些实验被发现可以诱导形态变化，因此被用于随后的体内实验。在每只大鼠每个时间点的睾丸横截面上随机对约800-900个小管进行评分(n个=5个时间点各3只大鼠），并将第八期、第八晚期和第九期肾小管的数量制成表格(图2). 精液分泌后，生精上皮中残留的精细胞长度≤50%的小管被归类为晚期VIII小管(图2A类,B类). sFRP1治疗1d后，第VIII期小管数量显著增加，无任何精子形成迹象（对照组为5.4%与。1天治疗组为7.8%），治疗后2天这种模式与大鼠睾丸相似（对照组为5.4%与。2d治疗组8.2%；图2). 因此，1d sFRP1处理的睾丸中晚期VIII小管的数量较低（对照组为3.2%与。治疗1 d组为1.5%；图2C类). sFRP1治疗组的停精表型持续到治疗后2天（第八期小管：对照组5.4%）与。第2天和晚期VIII小管中为8.2%：对照组为3.2%与。第2天为1.1%；图2C类). 最终，在治疗后4天发生精子生成，晚期VIII小管数量恢复正常（对照组为3.2%与。4d治疗组2.4%；图2C类). 尽管如此，在sFRP1处理4天后，发生了精子形成且上皮中不再发现细长精子细胞的IX期小管数量显著减少（对照组为3.7%与。4d治疗组为1.4%；图2C） ，由于精子的延迟。值得注意的是，除精子生成延迟外，sFRP1治疗后6 h和1-4 d大鼠睾丸形态正常，其他所有阶段的精子细胞均未受到影响。

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图2。

sFRP1诱导排卵延迟。90天大鼠每个睾丸接受4μg sFRP1（2.5μg/ml，67.6μM；假设睾丸体积为1.6 ml，sFRP1M（M）_第页在37 kDa下），体积为～200μl，时间为0通过用28克的针头进行睾丸内注射。大鼠在6 h和1、2和4 d后终止实验n个=～3-5只大鼠/时间点，包括对照组。对对照大鼠给予等量的BSA。将睾丸固定在Bouin’s固定剂中，嵌入石蜡中，用切片机切至5μm厚，并进行苏木精染色以进行组织学分析。A类,B类)来自控件的Testis节（Ctrl；A类)sFRP1治疗后1天(B类). 星号表示用sFRP1处理1天的睾丸中VIII期小管数量显著增加。比例尺=60μm。C类)对照组每个睾丸横截面中VIII期、VIII晚期和IX期小管的数量与。对sFRP1处理的大鼠进行评分，并用这些分段小管占每个横截面小管总数的百分比表示。晚期VIII被定义为小管，小管中有≥50%的细长精子细胞。通过比较不同治疗组大鼠睾丸横截面中每个阶段的小管百分比进行统计与。对照组大鼠。结果是来自的数据n个=3只大鼠，约800-900个小管/睾丸/动物。在sFRP1注射后1天和2天，在第VIII期出现了明显更多的小管，这些小管未能进行精子形成。治疗后第4天，sFRP1代谢清除后，精子开始恢复，但第IX期小管数量仍显著减少与。由于排卵延迟而引起的控制。条形代表平均值±标准偏差. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

对-FAK-Tyr的下调³⁹⁷在sFRP1诱导的精子形成延迟过程中

由于sFRP1延迟了精子生成，我们接下来研究了顶端ES蛋白水平是否有任何变化。几种顶端ES蛋白的稳定水平(例如，nectin-3，afadin和JAM-C）在睾丸内注射sFRP1后没有显著变化(图3). 基础ES水平(例如、N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素；图3)和TJ(例如、闭塞素、CAR、JAM-A和ZO-1；数据未显示）BTB的蛋白质也保持不变。几种蛋白激酶在ES顶端表达的磷酸化形式[例如，p-PKB-序列⁴⁷³(29)，p-FAK-Tyr³⁹⁷和p-ERK(39)]也进行了检查，只有对FAK-Tyr³⁹⁷在sFRP1注射后6小时即发现显著下调，并持续到2天(图3和数据未显示）。自从p-FAK-Tyr本地化以来³⁹⁷在生精上皮中仅限于顶端ES，在顶端ES表现出高度限制的时空表达，其表达在VII–VIII期最高（参考文献。40; 见下文），其通过sFRP1的下调暗示其可能是sFRP1诱导的精子化缺陷的下游信号分子。

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图3。

sFRP1抑制FAK-Tyr的磷酸化³⁹⁷.A类)用免疫印迹法分析BSA或sFRP1处理的大鼠睾丸裂解物，并探测基础ES和顶端ES蛋白以及调节蛋白(例如，p-FAK-Tyr³⁹⁷)已知影响精子生成。基础ES（N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和顶端ES（连接蛋白-3、afadin和JAM-C）蛋白质的稳定水平保持不变。FAK-Tyr的磷酸化³⁹⁷在6小时、1天和2天后通过sFRP1处理被抑制。使用GAPDH确保蛋白质负载相等。B类)总结了来自3个以上独立实验的合成结果。取BSA对照大鼠睾丸裂解物的蛋白质水平平均值并设定为1，与sFRP1处理大鼠在指定时间点的睾丸裂解物进行比较。条形代表平均值±标准偏差. *P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

sFRP1导致粘附蛋白复合物在心尖ES的滞留

sFRP1给药后引起的精子延迟体内提示即使一些心尖ES蛋白的稳态水平没有改变，心尖ES的结构也可能改变(图3). 免疫荧光显微镜分析显示，sFRP1治疗后，VIII期肾小管顶端ES的一种顶端ES蛋白nectin-3的表达和定位发生了显著变化(图4A类). 在对照睾丸中，连接蛋白-3在第VII期的ES顶点最强(图4Aa–d类)用于增强细胞粘附，其水平在VIII期小管中显著降低至几乎无法检测到的水平(图4Ae–小时)，与之前的报告一致(41). 相反，在sFRP1给药1天后，连接蛋白-3保留在第VIII期小管的顶端ES(图4美洲-太平洋)其中，在VII期小管中，连接蛋白-3在生精上皮中的染色和定位在对照组和治疗组之间几乎无法区分(图4Aa–d与i–l). 另一方面，层粘连蛋白-γ3链是ES顶端的另一种细胞黏附蛋白，即使在精细胞从生精上皮中耗尽后，仍在伸长的精细胞上表达（数据未显示）。为了进一步研究ES顶端黏附复合体是否有任何变化，我们对Arp3和肌动蛋白进行了双标记免疫荧光分析。与我们之前的数据类似(42)，Arp3在第VII期局限于伸长精子细胞头部的凹侧，在ES顶端与肌动蛋白共定位(图4钡–c). 在精子形成前第八阶段，细长的精子细胞排列在小管管腔的管腔边缘，Arp3和肌动蛋白的染色显著减少，几乎无法检测到(图4Bd–f). sFRP1治疗1天后，除连接蛋白-3外，Arp3和肌动蛋白也保留在第VIII期小管的心尖ES处，表明心尖黏附复合体的保留(图4Bg–i类). 先前的研究表明，对FAK-Tyr³⁹⁷表达具有阶段特异性，并定位于VII–VIII期伸长/拉长精子细胞头部背面（凸面）的顶端ES(40,43). 与之前的报告一致，p-FAK-Tyr³⁹⁷在第VII–VIII阶段，对照睾丸顶端ES的表达上调(图4Bj公司,米). 观察到连接蛋白-3与p-FAK-Tyr共定位³⁹⁷第七阶段(图4Bj–l公司)在精子形成前的第八阶段，大多数连接蛋白-3蛋白在ES顶端缺失(图4B类,移动电话). 根据免疫印迹数据，p-FAK-Tyr³⁹⁷在睾丸内注射sFRP1后，发现第八阶段的心尖ES显著减弱(图4Bp与j,米). 有趣的是，弱化的p-FAK-Tyr³⁹⁷sFRP1处理的睾丸VIII期小管中的染色与异常强烈的连接蛋白3染色同时出现(图4Bp–r公司).

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图4。

sFRP1诱导的排卵延迟是由顶端ES复合体的保留介导的。A类)将BSA处理的对照组或sFRP1处理的大鼠冷冻睾丸切片固定1d，并对其进行连接蛋白-3（绿色）染色。细胞核用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI；蓝色）染色。a–d)在对照睾丸切片中，Nectin-3在VII期小管的ES顶端表达。e–h)就在第八阶段精子形成之前，ES顶端的连接蛋白-3染色显著减少，几乎无法检测到。i–l)sFRP1治疗1d后，VII期肾小管中的连接蛋白-3水平没有显著变化。百万英镑)然而，在sFRP1处理的睾丸中，连接蛋白-3染色在VIII期小管的顶端ES处仍然清晰可见。B类)使用Arp3（红色）和F-actin（绿色）（左侧面板）或p-FAK-Tyr进行双标记免疫荧光分析³⁹⁷（红色）和连接蛋白-3（绿色）（右侧面板）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。a–c)Arp3（红色）与F-actin（绿色）共定位于VII期控制小管中伸长精子细胞的腹侧（凹面）。b–f)在精子形成前不久，Arp3染色显著减弱，第VIII期小管中的F-actin随之消失，说明精子形成前心尖ES复合体的解体。g–i类)然而，在sFRP1诱导的精子形成延迟期间，Arp3和F-actin仍位于延长精子细胞的凹侧。j–l)对-FAK-Tyr³⁹⁷（红色）几乎只在顶端ES表达，与细长精子细胞背侧（凸侧）的连接蛋白-3（绿色）共定位。百万美元)在控制阶段VIII小管中，p-FAK-Tyr³⁹⁷在心尖ES处仍能检测到，而nectin-3染色几乎消失。对-对)相反，p-FAK-Tyr³⁹⁷与对照组相比，sFRP1处理的睾丸在第VIII期的ES在顶端明显较弱，但nectin-3染色明显强于相应的对照组。比例尺=60μm(澳大利亚,b条,e（电子）,（f）,我,j个,米,n个); 20微米(交流电,d日,克,小时,k个,我,o个,第页); 12微米(B类).

支持细胞生殖细胞与已建立的顶端ES共培养中sFRP1的过度表达导致p-FAK-Tyr的下调³⁹⁷

根据中报告的调查结果图2​2——4sFRP1处理后，连接蛋白-3在第VIII期小管顶端ES的持续表达和定位似乎与p-FAK-Tyr的下调有关³⁹⁷我们使用sFRP1处理的睾丸裂解物免疫沉淀总连接蛋白3，并探测对-Tyr，以评估磷酸化连接蛋白3水平是否有任何变化。然而，该实验并没有得出一致的结果，因为sFRP1诱导的精子发育缺陷仅限于第VIII期小管，其占成年大鼠睾丸总小管的<10%。因此，在第八阶段，连接蛋白3磷酸化的变化可能被其他阶段的连接蛋白3所掩盖。为了克服这一挑战，我们研究了sFRP1在Sertoli生殖细胞共培养系统中的作用，在该系统中，sFRP2蛋白很容易影响心尖ES通过重组sFRP1蛋白的使用或其使用慢病毒载体的过度表达。此外，该共培养系统的电子显微镜特征如图5消除了发现的阶段特异性问题体内。在在体外共培养系统中，原代支持细胞单独培养4 d，其中TJ和基础ES通过模拟支持细胞BTB的电子显微镜检测体内(图5A类,B类)在添加成人总生殖细胞以允许支持细胞和精子细胞（前8步）、精母细胞和精原细胞之间的桥粒组装之前(图5C类,D类)以及支持细胞和精子细胞之间的顶端ES组装（步骤8-19精子细胞），如所示图5E类,F类将重组sFRP1蛋白（2.5μg/ml）添加到共培养物中2d，以研究其对FAK和nectin-3磷酸化的影响。另外，sFRP1被慢病毒载体过度表达，慢病毒载体已被证明在Sertoli细胞中有效地产生高水平的重组蛋白体内和在体外(44,45). sFRP1是一种分泌性糖蛋白，在Sertoli生殖细胞共培养裂解液和条件培养基中均高水平存在(图6A类). 值得注意的是，在lacZ转基因过度表达的对照细胞中，内源性sFRP1蛋白低于检测极限(图6A类)可能是由于抗体滴度。与调查结果类似体内(图3)，sFRP1没有改变基础和顶端ES蛋白的稳态水平，但显著下调p-FAK-Tyr³⁹⁷当使用重组sFRP1蛋白或其在Sertoli生殖细胞共培养物中过度表达后(图6B类,C类). 在将重组sFRP1蛋白添加到共培养物中或在慢病毒转染后，我们没有进行电子显微镜检查支持细胞-精子界面的顶端ES，因为这些处理可以促进精子细胞的粘附。因此，本研究仅限于生化分析，如图6和图7.

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图5。

支持细胞-生殖细胞共培养中顶端ES的特征。支持细胞培养在0.5×10⁶细胞/厘米²在F12/DMEM中的Matrigel-coated 60-mm盘子上，按照材料和方法中的描述，在35°C下添加补充剂。大约36小时后，如前所述，对细胞进行低张处理以溶解残余生殖细胞(33).A类)这些高纯度的支持细胞单独培养4天，形成完整的上皮（SC-Nu，支持细胞核）。两个相邻的支持细胞（SC）与支持细胞质膜相对，用相对的灰色箭头标注。培养的支持细胞典型的细胞质过程在体外也可以看到（星号）。B类)紧密连接（白色箭头）的超微结构与基底ES共存[典型表现为肌动蛋白纤维束（黑色箭头）夹在对向支持细胞质膜（灰色箭头）的内质网（ER）池之间]，类似于支持细胞BTB体内试验。C–F类)在支持细胞单独培养后4天，将从成年大鼠睾丸分离的总生殖细胞（未经玻璃棉过滤步骤，包括伸长/伸长精子细胞）添加到支持细胞上皮上，并在终止电子显微镜检查前以1:5的支持细胞与生殖细胞比培养约2天。C类)生殖细胞（见突出的生殖细胞核，GC-Nu）附着在2个支持细胞上。支持细胞胞质突起可见（星号）。D类)中方框区域的放大视图C类桥粒（白色箭头）的典型特征是在支持生殖细胞界面上存在电子密度物质（灰色箭头表示支持生殖细胞质膜相对）。E类)在伸长精子细胞和支持细胞之间发现功能性顶端ES（盒状区）；星号表示培养的支持细胞的典型细胞质突起体外试验。F类)中方框区域的放大视图E类顶端ES的典型特征是肌动蛋白纤维束（垂直于支持细胞质膜，白色箭头）夹在内质网池和支持细胞和精子细胞的对应质膜之间（灰色箭头）。Sp-Nu，精子细胞核。比例尺=5μm(A类); 1微米(B类); 3微米(C类); 0.5微米(D类); 2微米(E类); 0.5微米(F类).

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图6。

sFRP1介导的FAK失活通过p-FAK-Tyr的下调³⁹⁷Sertoli生殖细胞共培养中的表达。A类)支持细胞（0.3×10⁶细胞/厘米²)培养2天并用慢病毒载体转导（感染的多重性=2）以过表达lacZ或sFRP1。细胞在转导后培养2天，然后添加总生殖细胞（支持细胞：生殖细胞=1:5），包括伸长/伸长的精子细胞和支持细胞，以启动顶端ES组装，如材料和方法所述（另见图5). 2天后收获支持-生殖细胞共培养物，以获得细胞裂解物和条件培养基。分别使用GAPDH和testin作为蛋白质负载对照，在支持生殖细胞共培养的细胞裂解物和条件培养基中都发现了高水平的sFRP1蛋白。B类)左面板：支持细胞（0.5×10⁶细胞/厘米²)在添加总生殖细胞（Sertoli：生殖细胞=1:5）和包含重组sFRP1（2.5μg/ml）之前培养4d。2天后在免疫沉淀裂解缓冲液中收集蛋白裂解产物，并探测基础ES(例如、N-钙粘蛋白、α-连环蛋白和β-连环素）和心尖ES(例如、nectin-3、afadin和JAM-C）蛋白，发现它们保持不变。右图：同样，在与sFRP1过度表达的Sertoli生殖细胞共培养物的蛋白裂解物中，这些蛋白水平没有显著变化与。lacZ公司。相反，FAK-Tyr的磷酸化³⁹⁷在重组或过度表达sFRP1蛋白的情况下显著下调。C类)条形图总结了3个独立实验的结果，其中每个目标蛋白都根据GAPDH进行了标准化，并与BSA或lacZ控制中的相对蛋白水平进行了比较，后者被任意设置为1。条形代表平均值±标准偏差. **P（P）< 0.01.

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图7。

在支持生殖细胞共培养中，sFRP1降低了连接蛋白-3的磷酸化。A类)用重组sFRP1（2.5μg/ml；左图）处理的支持生殖细胞共培养物的蛋白裂解物或通过慢病毒转导过度表达sFRP1（右图）后的蛋白裂解液用连接蛋白-3抗体进行免疫沉淀，以获得总连接蛋白-3。此后，通过使用抗磷酸化-Tyr抗体（对-Tyr-nectin-3）的免疫印迹来评估免疫沉淀连接蛋白-3的相对对-Tyr含量。两个治疗组的总连接蛋白-3水平和GAPDH均无显著变化与。它们相应的控件。B类)柱状图总结了3个独立实验的结果，表明sFRP1蛋白的存在降低了连接蛋白3的酪氨酸磷酸化。BSA或lacZ对照中对-Tyr-nectin-3的相对蛋白水平任意设置为1，并与之进行统计比较。条形代表平均值±标准偏差. **P（P）< 0.01.

作者感谢Naama Kanarek博士对慢病毒载体生产的有益讨论。作者还感谢gag-pol和pMD的慷慨捐赠。来自Yinon Ben-Neriah教授和Naama Kanarek博士（以色列耶路撒冷希伯来大学）的G质粒。

这项工作得到了美国国家卫生研究院（国家儿童健康与人类发展研究所）的资助，R01-HD-056034; 致C.Y.C；U54-HD-029990项目5至C.Y.C.）。