开发老年药物的临床策略和动物模型

摘要

1.简介

衰老与多种慢性病的发病倾向增加有关：动脉粥样硬化、癌症、痴呆、糖尿病、关节炎和其他许多疾病(Goldman等人，2013年；柯克兰，2013年a；柯克兰，2013年b；研究，2012年). 年龄是许多此类疾病的最大风险因素，在某些情况下，年龄比所有其他已知风险因素的总和更能预测疾病。细胞衰老是一个基本的衰老过程，通常在慢性年龄相关疾病的病理部位起作用(柯克兰，2013年a；Tchkonia等人，2013年).

细胞衰老是指由潜在的致癌和代谢损伤引起的基本上不可逆的细胞周期停滞(Tchkonia等人，2013年). 衰老细胞可以获得衰老相关分泌表型（SASP），包括释放促炎细胞因子、趋化因子、促血栓形成因子和导致组织损伤的细胞外基质蛋白酶，以及可能导致组织结构失调或纤维化的细胞外矩阵蛋白。因此，细胞衰老可促进组织层面的不良致病机制包括慢性炎症、功能性祖细胞丧失、凝血和细胞外基质功能障碍。

随着年龄的增长，衰老细胞在多个组织中积累(Tchkonia等人，2013年；Waaijer等人，2012年). 衰老细胞负担反过来又与寿命有关。18个月大时，长寿的艾姆斯侏儒、斯内尔侏儒和生长激素受体敲除（GHRKO）小鼠脂肪组织中的衰老细胞少于年龄匹配的对照野生型动物，而长寿的生长激素过表达小鼠的衰老细胞更多(Stout等人，2014年). 热量限制足以延长小鼠寿命与p16表达降低有关^墨水4a，一种衰老标记，在多个组织中与随意-喂食动物(Krishnamurthy等人，2004年). 孕激素小鼠，包括Werner和Hutchinson-Guilford孕激素小鼠模型，以及纺神星-缺陷，Ercc^−/−和BubR1^高/高小鼠衰老细胞增多(贝克等人，2008年；Chen等人，2013；Eren等人，2014b；Tchkonia等人，2013年). 在较长时间的比较中-与短寿命小鼠队列，肝和肠隐窝中的衰老细胞积累预测平均寿命和最大寿命(Jurk等人，2014年). 细胞衰老可以发生在生命的任何阶段，甚至在囊胚中(Meuter等人，2014年)还有胎盘(Rajagopalan等人，2012年). 事实上，衰老在胚胎发生期间的重构中很重要(Munoz-Espin等人，2013年；Storer等人，2013年).

细胞衰老、衰老和与年龄相关的病理学之间的这些联系促使测试衰老细胞清除是否能改善功能障碍。基因靶向衰老细胞INK-ATTAC；丁腈橡胶R1^高/高仅在衰老细胞中表达药物激活的“自杀”基因的进展期小鼠可提高健康寿命(贝克等人，2011年)，生命中免于痛苦、残疾和依赖的那部分(Kirkland等人，2009年). 即使只清除这些小鼠约30%的衰老细胞，也能部分逆转与年龄相关的脂肪营养不良，并减少虚弱、少肌症和白内障形成的进展(贝克等人，2011年；Tchkonia等人，2013年).

这些发现刺激了小分子衰老因子和其他方法的发展，以减少衰老细胞负担，包括肽、RNA干扰和疫苗。要使这项工作取得成功：1）需要开发适当的人类年龄相关疾病的动物模型。2） 必须建立模型来证明有益效果实际上是通过假定的衰老因子清除衰老细胞而产生的。如果没有这一证据，候选药物可能会导致衰老细胞清除，但表型的改善是由于对非新生细胞的“非靶向”效应，而不是直接通过衰老细胞清除。3） 需要模型来测试衰老剂的可能副作用。值得注意的是，尽管在20个月的观察期间，持续清除小鼠衰老细胞的基因并没有导致任何明显的副作用(Baker等人，2011年)有证据表明，细胞衰老在某些情况下具有有益的作用。例如，细胞衰老可以防止癌症的发展，有助于解决愈合过程中的组织纤维化，参与免疫反应，并有助于组织重塑(Krizhanovsky等人，2008年；Tchkonia等人，2013年；Xue等人，2007年).

2.人类疾病与细胞衰老的关系

细胞衰老与许多慢性疾病和残疾有关，这些疾病和残疾是发病率、死亡率和健康成本的主要驱动因素(柯克兰，2013年a；Tchkonia等人，2013年；Zhu等人，2014年). 在许多此类疾病的病理部位已发现衰老细胞，并且可能具有易感染其他疾病的全身效应。这些包括：1）代谢状况（糖尿病、肥胖、代谢综合征和年龄相关性脂肪营养不良(Minamino等人，2009年；Tchkonia等人，2010年))2）心血管疾病（动脉粥样硬化、高血压、心力衰竭和外周血管疾病(Holdt等人，2011年；柯克兰，2013年a；Minamino等人，2002年; 王等，2012；Westhoff等人，2008年))，3）虚弱（肌肉减少(贝克等人，2011年；Tchkonia等人，2013年))4）失明（白内障、青光眼、黄斑变性(贝克等人，2011年；科兹洛夫斯基，2012年；Liton等人，2005年))，5）恢复力丧失（化疗或放疗后不久或多年后的副作用，择期手术后恢复延迟或心肌梗死等急性事件(柯克兰，2013年a；Le等人，2010年；Marcoux等人，2013年；Roninson，2003年；Tchkonia等人，2013年))6）神经退行性疾病（阿尔茨海默病和“tau-opathies”、帕金森氏病、顺铂、HIV痴呆后的“化学脑”(Chinta等人，2013年; Golde等人，2009年；柯克兰，2013年a；Krull等人，2013年))7）骨疾病（骨质疏松、骨关节炎、骨折不愈合(Bajada等人，2009年；Chen等人，2013年；Freund等人，2010年；普莱斯等人，2002年))，8）肺部状况（特发性肺纤维化、博莱霉素肺和其他药物或环境毒素相关的肺部疾病，以及慢性阻塞性肺病（青石坝等，2009年；巴恩斯，2013年；Minagawa等人，2011年a；Tsuji等人，2004年；Tsuji等人，2009年))，9）肝病（原发性胆汁性肝硬化(Tabibian等人，2014年)，10）泌尿生殖功能障碍（年龄相关性肾小球硬化，易发生急性肾小管坏死，糖尿病肾病，前列腺肥大(卡斯特罗等人，2003年；Choi等人，2000年；Clements等人，2013年；柯克兰，2013年a；Kitada等人，2014年))11）皮肤疾病：黑色素细胞痣、慢性皮肤溃疡（褥疮）(Gray-Schopfer等人，2006年；Vande Berg等人，2005年)，12）癌症(Campisi等人，2007年；柯克兰，2013年a; Liu等人，2007年），13）毒素暴露和药物或放射治疗（药物：烷基化和其他化疗药物(Roninson，2003年)，HIV蛋白酶抑制剂（Torres等人，2014），激素：长期生长激素治疗(Stout等人，2014年)，毒素(Welford等人，2010年)治疗性或意外辐射的长期影响(Marcoux等人，2013年))，14）遗传性疾病（如早衰(Benson等人，2010年))15）感染（尤其是HIV（Torres等人，2014）），以及16）年龄老化本身(Tchkonia等人，2013年；Waaijer等人，2012年). 其中一些情况可能会成为senolytics概念验证临床研究的主题，以测试清除衰老细胞是否具有临床益处。

3.衰老因子初步概念验证研究的潜在场景

衰老药物的初步临床研究很可能涉及短期给药对已有症状的受试者产生可测量临床益处的适应症，而不是寿命或健康寿命的研究。如果第一批临床研究涉及非专利的重新用途药物，则可能需要在学术环境中获得公共资助。现有代理人仍处于专利、可申请专利的管理方法之下(例如.、气雾剂、局部用药或滴眼液）、新型药物组合或新型化学实体将对制药行业更有吸引力。新的化学物质达到基本验证研究的时间将比批准的、重新调整用途的试剂更长。然而，拥有专利授权代理的公司可能愿意探索新的适应症。

需要能够反映最初人类研究设计的动物模型，以便于对候选衰老药物进行临床前测试。第一项人体研究可能是对已被批准用于其他具有衰老活性的应用的重新用途药物的小型初步验证试验。如果这个假设是正确的，这些药物可能首先被测试的可能情况包括：A）多种共病、虚弱或丧失弹性的改善，B）加速衰老样条件，C）与细胞衰老相关的其他致命条件，以及D）与衰老相关的局部条件。

4.细胞衰老相关疾病的动物模型

在进行初步人体试验之前，需要进行临床前研究，以反映上述人类抗衰老药物潜在适应症的动物模型。在某些情况下，转基因小鼠或相关的诱导疾病的遗传、药理学或饮食操作是可用的。然而，在许多情况下，要么没有模型，要么只有不完善的模型。对于由单基因突变导致的人类进展期或其他综合征，可以使用相当好的近似值的小鼠模型。增加衰老细胞的进展期小鼠包括层粘连蛋白A突变的小鼠，纺神星-不足，Ercc公司⁻⁻、和丁腈橡胶R1^高/高老鼠(贝克等人，2008年；Chen等人，2013；Eren等人，2014b；Tchkonia等人，2013年). 可以在这些小鼠中测试候选解衰老药物，以确定药物是否能解决多种类似衰老和健康的表型，如握力受损、运动耐力、活动、葡萄糖稳态和其他代谢功能障碍以及认知功能障碍。

在多基因、多因素的人类疾病中，如果单基因突变的动物在早期出现表面上类似的综合征，那么药物开发可能会遇到问题。例如，单基因突变导致幼鼠出现类似阿尔茨海默病的结果。也许在以后的生活中可以诱发功能异常突变的动物更适合检测衰老因子。至少可以在这种小鼠中模拟衰老组织微环境的环境。这在衰老相关疾病的情况下可能特别重要，因为衰老细胞可以深刻影响周围的组织，因为它们分泌的SASP、基质蛋白和代谢物，以及它们化学吸引的适应性免疫细胞。

可用于实验动物诱导细胞衰老和模拟人类衰老相关疾病的操作包括：；高脂肪喂养、局部或全身辐射、全身药物干预(例如、烷基化剂或其他化疗、HIV蛋白酶抑制剂、链脲佐菌素、帕金森诱导剂）、局部药物干预(例如吸入博莱霉素或香烟烟雾、补肾素）、局部致癌物、异种癌症移植、皮肤损伤和手术关节损伤。在这些模型的小组中，候选衰老药物的作用可能有助于测试候选药物，并为每种新的衰老药物选择潜在的临床应用。在某些情况下，如阿尔茨海默病，在人类细胞培养系统中对衰老因子的测试可能比目前可用的动物模型更能反映疾病的病理学(Choi等人，2014年).

这些模型各有优缺点。例如，虽然豚鼠在某些方面可以发展成与人类骨关节炎类似的状况，但人类骨关节病并没有精确的小鼠对应物(Vincent等人，2012年). 关节炎小鼠模型通常涉及某种形式的手术或化学创伤。这种方法在建模人类创伤后关节炎方面可能很有价值，但在建模与年龄相关的常见人类骨关节炎时可能不太可靠。

候选解感剂在缓解临床相关稳态扰动影响方面的有效性可以在动物身上建模，以测试其对恢复力的有效性。例如，年龄较大、肥胖或进展型小鼠可以使用候选药物进行治疗。稳态扰动可能包括化疗、辐射、手术创伤、食物或水缺乏、红藻氨酸、心脏刺激物，如肾上腺素、异丙肾上腺素或多巴酚丁胺、心脏或肾脏损伤/再灌注、癌症异种移植物、致癌物、干细胞或器官移植，或后肢悬浮物固定。这些扰动对一系列身体、代谢、心血管和认知衰老相关健康跨度表型的影响可以确定。

在开始基本的人体研究之前，需要检查候选消衰剂的并发症和副作用。部分肝切除术、皮肤伤口、肺纤维化、血管斑块和其他模型将有助于寻找潜在的纤维化、斑块破裂或其他候选衰老药物的不良反应。需要使用多个物种进行潜在并发症、毒性和有效性的临床前研究。在上述每个模型中，候选衰老因子对同一动物内多个年龄相关终点的影响与可对安慰剂进行评估。然后可以将它们组合成一个整体的“健康跨度”分数，以增强统计能力。

一种显示衰老细胞清除是否与表型改善相关的方法是比较候选衰老药物与p16基因模型清除的效果^墨水4a-相关衰老，如油墨-附件小鼠，或在p53通路中具有衰老相关启动子的模型中，如PAI-1。基于PAI-1启动子自杀基因构建体的小鼠可能是有信息的，因为PAI-1与诱导细胞衰老和衰老在细胞间的扩散有关(Eren等人，2014a). 最近，PAI-1抑制剂被证明可以延长进展期的寿命纺神星-缺陷小鼠与衰老细胞负荷降低(Eren等人，2014b)PAI-1与衰老细胞的发生、扩散或生存有关。为了进行这些研究，需要充分开发衰老相关疾病的动物模型，将其培育成可以追踪衰老细胞的动物模型体内或者在组织中，并且可以使用诱导自杀基因作为阳性对照清除衰老细胞。

5.结论

我们认为，适应症对于初步临床研究的初步证据可能特别有希望，因为抗衰老或SASP保护剂将用于缓解化疗或放疗的短期或长期影响，气雾剂治疗特发性肺纤维化，治疗原发性胆汁性肝硬化，和注射治疗骨关节炎。对反映上述每一种情况的疾病模拟动物模型，对这些模型和油墨-附件在开始初步临床研究之前，需要用小鼠或其他小鼠来清除衰老细胞，并证明候选的衰老药物既能清除衰老细胞又能解决疾病。抗衰老药物预防效果的研究与治疗衰老相关疾病需要在这些临床前动物模型中进行测试。这将为确定在临床试验期间何时开始服用抗衰老药物提供重要信息。

一个关键的挑战是，对于声称候选衰老因子实际上通过清除衰老细胞而起作用的说法，将证明观察到的衰老细胞负荷减少是药物表型效应的原因(图1). 必须将因果机制与衰老细胞负荷减少和表型改善之间的非因果关系区分开来。许多药物，包括高度选择性的小分子甚至抗体，可以通过“非靶向”机制发挥作用，通过靶向以外的细胞类型中的途径发挥作用，可能导致表型效应。表明与服用候选药物相关的表型变化与模型中衰老细胞的遗传清除导致的表型变化平行，例如油墨-附件这表明清除衰老细胞与表型改善之间存在关联。然而，这种比较不足以证明因果关系。例如，布洛芬等药物可以减少衰老的扩散，因此最终也会减少衰老细胞的丰度(Jurk等人，2014年)，但这样做可能不会真正衰老。布洛芬可以缓解炎症引起的表型，模仿去除衰老细胞的预期效果。为了明确排除非目标机构，需要开发新型模型。

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图1

因果关系与.关联

候选抗衰老药物是否通过靶向衰老细胞而导致表型改善？或者，它们是否影响非基因细胞以改善表型，并作为一种副现象同时诱导衰老细胞的丢失？由于衰老细胞清除导致的候选药物的因果效应可能与对非遗传细胞的“非靶向”效应相结合，从而导致表型效应。

建立因果关系的一种方法是建立动物模型，其中组成型活性药物靶标仅在衰老细胞中表达。然后，这些动物可以用来测试衰老相关表型是否受到正在研究的潜在衰老因子的影响。如果药物确实具有衰老作用，那么这些表型不应该在组成性表达药物靶点的动物中得到解决。然而，对于不表达组成活性药物靶点的动物，应使用衰老药物进行纠正。这种方法可以用来估计衰老细胞清除的相对贡献与.“偏离目标”机制的影响。此外，还需要这种方法来证明因果关系。仅仅通过寻找候选衰老药物治疗后表型消退之间的相关性并不能证明因果关系与在基因修饰小鼠中诱导衰老细胞自杀基因后的消退。

除已知的缺陷外，抗衰老治疗很可能存在无法预见的缺陷，可能包括纤维化加剧。需要使用动物模型对每种候选药物的副作用进行搜索，这些动物模型能够概括药物临床使用的背景。例如，如果目标是开发一种特殊的衰老因子作为治疗特发性肺纤维化的气雾剂，则有必要证明该因子不会使纤维化恶化，例如，在老年（而非年轻）小鼠中，肺纤维化是由博莱霉素或烟雾吸入诱导的。

与其他治疗方法相比，清除衰老细胞有许多潜在的重要优势。与改善SASP的药物不同，间歇性地进行衰老治疗可能是可行的，可能每隔几个月进行一天或两天，或者在健康期间每年进行一次。因为与癌细胞或微生物不同，衰老细胞不会分裂，所以在治疗癌症或传染病时遇到的对衰老药物的耐药性不太可能是一个问题。只针对一部分衰老细胞可能会产生有益的效果。与这种可能性一致，只有30%的p16^墨水4a-表达衰老细胞从INK-ATTAC；丁腈橡胶R1^高/高AP20187小鼠。去除这部分衰老细胞可显著提高健康寿命(贝克等人，2011年). 可能，那些易被去除的衰老细胞与那些在基因或药物靶向作用后残留的细胞不同。易感人群可能是导致功能损害和疾病的主要原因。

需要更多地了解衰老细胞的周转。所有细胞都可以通过脉冲标记永久标记的动物模型，例如在AdipoChaser小鼠中表达谱系追踪结构的动物（Wang等人，2014），可以与可以追踪衰老细胞的模型交叉，例如油墨-附件(贝克等人，2011年)或p16^墨水4a荧光素酶小鼠(Burd等人，2013年). 这些动物可用于评估衰老细胞随年龄增长的更新以及与衰老相关的疾病状态或条件(例如、高脂肪喂养、放疗或化疗后，或衰老相关慢性病动物模型）。有关衰老细胞在不同条件和疾病下的周转的信息对于设计适当的适应症特定的给药间隔非常重要。然而，虽然通过将谱系追踪结构与衰老相关启动子相结合，可以在动物研究中估计更替率的第一近似值，但人类的更替可能与具有与人类不同的适应性免疫系统的小鼠大不相同。免疫功能似乎是衰老细胞清除的主要机制(Xue等人，2007年). 在临床分析中，需要做大量工作，尤其是对老年药物给药间隔的微调。

总之，由于以下原因，需要一系列动物模型，包括小鼠以外的物种。1） 一个特别具有挑战性的问题是证明与解衰老药物治疗相关的衰老细胞数量的减少是否真的会导致表型解析，而不是通过药物对其他细胞类型的脱靶效应。2） 需要更好的人类衰老相关疾病、虚弱和恢复力的动物模型。这些模型应与临床试验策略一起设计，以便进行最能反映特定临床试验策略的最相关的临床前测试。3） 需要为每种与衰老相关的疾病状态确定衰老细胞的生成或再现率，作为确定衰老治疗脉冲之间间隔的指南。这可以通过动物模型近似估计，但需要在临床研究中更精确地确定。4） 需要在与年龄相适应的临床前动物模型中，在每种与衰老相关的慢性病的背景下，彻底研究衰老药物的副作用，并比较不同衰老药物的不良反应。开发合适的衰老药物动物模型和临床试验范式值得深入探索，因为衰老药物如果能成功延缓、预防、缓解或逆转与年龄相关的主要疾病，将具有革命性作用。

致谢

缩写

脚注

参考文献