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细胞科学杂志。2014年3月15日；127(6): 1263–1278.
数字对象标识：10.1242/jcs.140087年
预防性维修识别码：PMC3953816
PMID：24424030

泛素-蛋白酶体系统和自噬在可溶性和聚集TDP-43物种清除中的差异作用

艾玛·L·斯科特，1 卡罗琳·万斯，1 阿格尼斯·西村，1 李永博，1 Han-Jou Chen先生，1 黑兹尔·乌文，1 瓦伦蒂娜·萨尔多，1,2 杰奎琳·米切尔，1 鲍里斯·罗杰尔，1,三 大卫·C·鲁宾斯泰因，4和克里斯托弗·肖1,*
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摘要

TAR DNA结合蛋白（TDP-43，也称为TARDBP）是肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）的主要病理蛋白。ALS和FTD患者剩余神经元的细胞质中可以看到用降解衔接蛋白修饰的大TDP-43聚集体验尸后TDP-43的积累和降解途径中的ALS相关突变表明TDP-43清除失败是一种主要的疾病机制。在这里，我们报道了泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬在TDP-43清除中的不同作用。我们研究了UPS抑制剂和自噬抑制剂对可溶性和不溶性TDP-43降解、定位和迁移的影响。我们发现可溶性TDP-43主要由UPS降解，而聚集TDP-43的清除需要自噬。当UPS和自噬都具有功能时，细胞大聚集体是可逆的，它概括了患者聚集体的许多病理特征。它们的清除涉及寡聚TDP-43的自噬清除。我们推测，除了与年龄相关的通路活性下降外，UPS或自噬通路中的第二次撞击也会导致ALS和FTD中TDP-43的积累。因此，清除多余TDP-43的治疗应针对这些途径的组合。

关键词：TDP-43、ALS、自噬、蛋白酶体、聚集吞噬、UPS

简介

肌萎缩侧索硬化（ALS）和额颞叶痴呆（FTD）是神经退行性疾病，其特征是由TAR DNA-结合蛋白43（TDP-43或TARDBP）组成的病理性蛋白聚集体沉积(Neumann等人，2006年). 这些“TDP-43蛋白病”跨越了临床范围，从ALS的主要上下运动神经元病理到FTD的主要皮质神经元病理，再到两者的混合表现。TDP-43是一种DNA和RNA结合蛋白，调节mRNA的加工和运输、应激颗粒反应和microRNA的生物生成(Buratti等人，2010年;科伦布里塔等人，2009年;Gregory等人，2004年;Tollervey等人，2011年). TDP-43突变导致ALS的发现证实了TDP-43在疾病中的致病作用，约占家族性病例的3%，占散发病例的0.5%(拉盖尔·图伦和克利夫兰，2009年). 在没有基因组突变的情况下，90%的ALS患者的大脑和脊髓以及60%的FTD患者的大脑中发现野生型TDP-43聚集体(Neumann等人，2006年).

TDP-43失调可导致疾病的证据来自许多动物模型。在苍蝇、鱼类和小鼠中，TDP-43的过度表达或敲低都会产生神经退行性ALS样表型(Kabashi等人，2010年;Li等人，2010年;Schmid等人，2013年;Wils等人，2010年;Wu等人，2012年). 事实上，各种证据表明人类ALS和FTD中TDP-43清除失败。ALS和FTD组织中聚集的TDP-43被磷酸化、泛素化并被泛素-1和-2标记(邓等人，2011;Neumann等人，2006年)和螯合体-1（SQSTM1或p62）(Arai等人，2003年)所有这些都以蛋白质为降解目标。此外，ubiquilin-2的突变(邓等人，2011)，隔离体-1(Fecto等人，2011年)或另一种降解途径衔接蛋白，含缬氨酸蛋白（VCP）(Watts等人，2004年)，可导致以TDP-43聚集为特征的ALS和FTD。细胞研究表明，TDP-43的原发突变也使其对降解产生抗性(Ling等人，2010年).

细胞蛋白质降解的两个主要途径是泛素-蛋白酶体系统（UPS）和大自噬，本文称为“自噬”。研究表明，自噬可降解过大而无法进入UPS孔的可溶性和聚集蛋白质底物(Verhoef等人，2002年). 泛素化可将蛋白质导向UPS或自噬命运，因此人类ALS和FTD组织中的泛素病理学无法区分哪种途径与疾病发病有关。连接蛋白固碳体-1和泛素-2修饰TDP-43聚集体，也与UPS和自噬相关(Lamark和Johansen，2010年).

由于这两种蛋白质降解途径之间的复杂相互作用，确定这两种蛋白降解途径在维持TDP-43蛋白质平衡方面的相对重要性具有挑战性，但对于理解疾病中TDP-43积累的机制至关重要。尽管TDP-43大聚集的作用仍有争议，但TDP-43的细胞质积累肯定与毒性有关，旨在提高TDP-43清除率的治疗策略极具吸引力。因此，我们试图研究TDP-43蛋白降解是如何调节的，以及作为ALS和FTD治疗靶向降解途径的潜力。

结果

TDP-43蛋白病细胞模型的建立

基于多西环素（DOX）诱导各种TDP-43结构表达的ALS和FTD的稳定细胞模型(图1A)在人类神经母细胞瘤（SH-SY5Y）细胞和人类胚胎肾（HEK293）细胞中生成。在两种细胞类型中，与之前的报告一致，在1诱导后µg/ml DOX、HA标记野生型（WT）TDP-43主要为部分核，具有缺失核定位序列（ΔNLS）的TDP-43同时为核和细胞质，TDP-43的C末端片段（氨基酸181-414；CTF）主要为细胞质(图1B、C). ΔNLS TDP-43的部分核定位可能是由于其与内源性TDP-43二聚化，导致共同输入。表达增强型GFP（EGFP）标记的TDP-43 WT、ΔNLS和CTF的稳定SH-SY5Y和HEK293株系重述了这些定位剖面。TDP-43在SH-SY5Y和HEK293细胞系中的表达依赖于DOX的剂量(图1D、E，欧共体50; HEK293，0.97纳克/毫升；SH-SY5Y，0.35纳克/毫升）。

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建立TDP-43蛋白病的细胞模型。（A） 本研究中使用的TDP-43结构示意图。NES，核出口信号；RRM，RNA识别基序。（B，C）TDP-43在稳定的SH-SY5Y（B）和HEK293（C）细胞系中的表达和定位的免疫细胞化学分析，通过用DOX诱导48小时来诱导表达HA–TDP-43构建体，显示细胞核定位（WT）、细胞质定位（CTF）或两者兼有（ΔNLS）。比例尺：10µm。（D，E）用DOX（EC）诱导48小时后，基于细胞的ELISA验证稳定SH-SY5Y（D）和HEK293（E）系中HA–TDP WT的DOX剂量依赖性表达50; HEK293，0.97纳克/毫升；SH-SY5Y，0.35 ng/ml）。

TDP-43降解

接下来，我们试图调查TDP-43结构的相对降解率。因为它有自动调节的能力(Ayala等人，2011年)，内源性TDP-43蛋白降解的定量无法通过稳态分析进行。我们利用细胞模型的诱导性进行非放射性脉冲追踪实验，以检测去除DOX诱导剂后HA–TDP-43蛋白的相对降解。在所有实验中，使用10 ng/ml DOX诱导HA–TDP-43表达24小时，以实现几乎最大的表达。

在72小时内对HEK293株系进行分析(图2A)，野生型TDP-43降解，半衰期为32.5小时。TDP-43的25-kDa CTF（主要是细胞质）翻转得更快，半衰率为11小时。核和细胞质TDP-43ΔNLS的降解速度适中，半衰度为24.4小时h.先前对未标记野生型TDP-43半衰期的估计范围为4 h至≥34 h(Ling等人，2010年;Pesiridis等人，2011年;Watanabe等人，2013年).

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TDP-43降解。（A） 通过DOX脉冲追踪实验评估稳定HEK293细胞中HA–TDP-43蛋白的降解。TDP-43 CTF的降解速度远快于TDP-43ΔNLS或TDP-43 WT(t吨1/2; HA–TDP-43重量，32.5小时；HA–TDP-43ΔNLS，24.4小时；HA–TDP-43 CTF，11小时）。（B） HA–TDP-43蛋白在较短时间内在稳定的SH-SY5Y细胞中降解，并允许mRNA转录物清除后的延迟。HA–TDP-43蛋白降解率与HEK293细胞中的降解率密切相关(t吨1/2; HA–TDP-43重量，29.2小时；HA–TDP-43ΔNLS，16.6小时；HA–TDP-43 CTF，10.2小时）。（C） 通过定量逆转录酶PCR评估稳定SH-SY5Y细胞中HA–TDP-43 mRNA转录物的降解。DOX洗脱后，所有三个结构的转录都迅速衰减，8小时后达到最小值（显示了一个代表性实验，n个 = 2). （A–C）示意图上的箭头表示采样的时间点。

为了验证该分析不是简单地测量细胞分裂对HA–TDP-43蛋白的稀释或DOX诱导转录物的缓慢衰减，我们在SH-SY5Y细胞系中进行了一项改进的实验(图2B)，并使用定量PCR评估DOX洗脱后的转录水平(图2C). SH-SY5Y细胞的倍增时间为~48小时，而HEK293细胞的倍增时间为~24小时。此外，在DOX洗脱后24小时开始的24小时内对蛋白质水平进行了分析（见示意图图2B)，以确保DOX诱导的转录物不再作为持续蛋白质合成的底物。事实上，使用实时逆转录酶PCR，我们验证了HA–TDP-43转录物在DOX洗脱后迅速衰减(图2C). 不同细胞类型内源性TDP-43转录物的公布半衰期为1.9小时至10.3小时(Ayala等人，2011年;Schwanhäusser等人，2011年;Sharova等人，2009年). 与HEK293细胞相比，SH-SY5Y细胞中三种HA–TDP-43蛋白的翻转速度非常相似，尽管这些细胞系的细胞分裂速度不同，并且在使用SH-SY5细胞的实验中使用的时间更短(t吨1/2; HA–TDP-43 WT，29.2小时；HA–TDP-43ΔNLS，16.6小时；HA–TDP-43 CTF，10.2小时）。

UPS和自噬参与TDP-43的降解

在确定了细胞系和时间进程之间TDP-43的降解速率一致后，我们接下来使用HEK293细胞系分析了TDP-43降解的途径。当蛋白质降解时，在DOX洗脱期的最后48小时内加入UPS或自噬抑制剂（示意图见图3A). 抑制剂用于支持遗传方法，以实现细胞群体的时间控制和同质性。

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UPS和自噬参与TDP-43的降解。（A） DOX洗脱后72小时，相对HA–TDP-43残留在稳定的HEK293细胞中，最后48小时内包括自噬抑制剂或UPS 3MA，3-甲基腺嘌呤；Baf，巴非霉素；环氧树脂；MG、MG132；车辆，车辆。−DOX控制车道表示72小时冲刷点处的HA–TDP-43含量，未诱导表达（“泄漏”）。每个构件的所有车道都来自相同的螺栓，如图所示拼接。（B） 用自噬抑制剂3MA和巴非霉素短期治疗后LC3水平的Western blot显示，LC3-I和II与3MA累积，LC3-II与巴非霉素累积。（C） 经过DOX脉冲追踪的稳定HEK293细胞中残留的相对HA–TDP-43，在48小时追踪期的最后24小时内含有自噬激活剂。氯化锂、氯化锂；雷帕霉素；Tre，海藻糖；车辆，车辆。条形图表示平均值±标准误差*P（P）≤0.05, **P（P）≤0.01, ***P（P）在载体和抑制剂处理的细胞之间≤0.001（双向ANOVA，Bonferroni后检验）。

这些检测检测了TDP-43的总补体，其中约90%是洗涤剂可溶性的(图4D，E). 所有三种TDP-43的降解都被测试的抑制剂组不同程度地抑制(图3A). 自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3MA）显著抑制CTF TDP-43的降解(P（P）≤0.05），并且在较小程度上，野生型和ΔNLS TDP-43的降解。在测定TDP-43水平所选的时间点（48小时3MA），3MA对自噬报告物p62和LC3（微管相关蛋白1轻链3β）的影响最小；然而，3MA治疗的较短时间表明出现了自噬抑制(图3B). 自噬体-溶酶体融合抑制剂bafilomycin（Baf）仅对每个TDP-43物种的降解有轻微的抑制作用，尽管如LC3-II的积累所示，LC3-II是与自噬体膜相关的LC3的修饰形式，可有效抑制自噬(Kabeya等人，2000年). 与自噬抑制剂的中等作用相反，UPS抑制剂MG132显著抑制了所有三种TDP-43构建体的降解(图3A、重量、，P（P）≤0.05; ΔNLS，P（P）≤0.05; CTF、，P（P）≤0.001). 相关的UPS抑制剂环氧肟酸也导致野生型ΔNLS和CTF TDP-43（所有P（P）≤0.05). 两种降解途径的抑制（通过与3MA和MG132联合处理）并不比单独使用MG132更能抑制任何蛋白质结构的降解。自噬途径的激活物证实了这些发现，因为在DOX洗脱期间添加海藻糖和氯化锂大大加速了CTF TDP-43的降解(图3C).

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 UPS的抑制，而非自噬，诱导TDP-43的耐洗涤剂细胞质聚集物的形成。（A） 在UPS或自噬的各种抑制剂存在下，DOX诱导48小时表达HA–TDP-43构建物诱导的稳定SH-SY5Y系的免疫细胞化学分析。单独使用时，UPS抑制剂（而非自噬抑制剂）诱导形成泛素（Ub）阳性TDP-43大聚集体（箭头）。比例尺：10µm。（B） 从转染FLAG–Ub的HEK293稳定株系中免疫沉淀HA–TDP-43 WT，然后用1µg/ml DOX单独或与3MA或MG132一起诱导24小时kDa）用3MA治疗，再用MG132治疗。变性裂解物的免疫沉淀（右）表明，与FLAG–Ub直接共价连接的HA–TDP-43仅在MG132处理后积累。IB，免疫印迹。（C） TDP-43聚集体是非淀粉样蛋白。在无MG132或有MG132的情况下，用DOX诱导48小时，诱导稳定的SH-SY5Y细胞表达HA–TDP-43结构。在MG132处理的细胞中，硫黄素T染色检测到淀粉样聚集体，这些聚集体独立于HA–TDP-43的大聚集体（虚线）。MG132处理亲本SH-SY5Y细胞诱导了内源性（Endo）TDP-43水平低的大聚集体（虚线），可能是由于TDP-43蛋白水平的自动调节。比例尺：10µm。（D，E）用DOX诱导48小时，诱导表达HA–TDP-43构建体的稳定SH-SY5Y系的四步分级。WT，上部白色箭头；ΔNLS，中间黑色箭头；CTF，下部黑色箭头。CTF主要溶于低盐（LS）馏分（TX，Triton X-100；Sark，sarkosyl）。请注意，每个步骤中的颗粒以不同的体积重新悬浮，以确保检测到所有部分。各组分的相对浓度为：Lys，1；LS，1；TX，0.5；萨克，3.33；尿素2.5。条形图表示按A处理的细胞的平均值±s.e.m.（F，G）溶解度分级，显示HA–TDP-43 WT（F）和ΔNLS（G）的裂解物（L）、RIPA-可溶物（R）和尿素可溶（U）分数。尿素馏分浓缩10倍。联合使用UPS和自噬抑制剂（†）增加了不溶性高分子量（HMW）TDP-43的数量，尤其是TDP-43ΔNLS（G）。3MA，3-甲基腺嘌呤；Baf，巴非霉素；环氧树脂；MG、MG132；车辆，车辆。

UPS（而非自噬）抑制诱导胞质TDP-43大聚集体

我们试图评估TDP-43在自噬或UPS抑制下积累的表型结果。在SH-SY5Y细胞中进行了平行的生化和免疫细胞化学研究，因为它们的大细胞质比HEK293细胞更容易成像。

为了研究TDP-43的定位和积累，在存在UPS抑制剂或自噬48小时的情况下，用1µg/ml DOX在稳定的SH-SY5Y细胞中诱导其表达。对于野生型和ΔNLS，UPS的抑制，而非自噬，导致TDP-43积累，从而形成大聚集体(图4A). UPS抑制剂MG132诱导约20%的细胞形成大的细胞质聚集物[WT，17.4%±1.3（计数224个细胞）；ΔNLS，25.6%±3.4（计数368个细胞）（±s.e.m.）]。Epoxomicin也诱导TDP-43大聚集体。相比之下，自噬抑制剂3MA或巴非霉素均未诱导形成泛素化TDP-43大聚集体。有趣的是，与单独使用MG132相比，MG132和3MA的联合应用在表达HA–TDP-43 WT或HA–TDP43ΔNLS的细胞中产生的聚集物更为强烈。

如所示图1B、C，HA–TDP-43 CTF在SH-SY5Y和HEK293细胞中均以极低水平表达，免疫细胞化学几乎无法检测到，可能是因为其快速降解（如图2A、B). 因此，没有进一步调查HA–TDP-43 CTF的定位。我们发现，与野生型或ΔNLS TDP-43类似，等效的EGFP标记的TDP-43 CTF在UPS抑制下形成聚集，但在自噬抑制下不形成聚集。然而，考虑到我们和其他人，EGFP标记片段的生理相关性尚不清楚(Li等人，2011年)发现它的稳态水平远远超过带有小标签的CTF。

为了更敏感地检测泛素化TDP-43积累的条件，我们在天然或变性条件下用3MA或MG132治疗后进行了联合免疫沉淀(图4B). 在转染有FLAG-tagged ubiquitin（FLAG–Ub）的HEK293 HA–TDP-43 WT稳定细胞系中，然后用1µg/ml DOX单独诱导，用抗HA抗体免疫沉淀产生少量FLAG–Ub，作为高分子量涂片（>100 kDa）。DOX加3MA诱导24小时后，HA–TDP-43 WT联合免疫沉淀FLAG–Ub的量略有增加，而MG132治疗24小时后增加更为显著。这一发现是在保存蛋白质复合物的非变性免疫沉淀条件下出现的，可能反映了含有HA–TDP-43和泛素化分子的复合物的形成，而不是HA–TDP-43的直接泛素化。事实上，使用变性条件（其中裂解物与0.5%SDS一起煮沸以使非共价相互作用变性），在MG132处理后观察到FLAG–Ub与HA–TDP-43的直接相互作用，但在基础或3MA处理条件下没有观察到。这些发现表明，当UPS被阻断时，泛素化TDP-43主要积聚。

人类ALS和FTD中的TDP-43聚集体最初被描述为非淀粉样蛋白(凯恩斯等人，2007年); 然而，最近的研究发现，TDP-43聚集体至少在一部分病例中是淀粉样蛋白(Bigio等人，2013年;Robinson等人，2013年). 我们使用硫黄素T染色来确定UPS抑制诱导的TDP-43聚集体是否为淀粉样蛋白。UPS抑制诱导多个淀粉样小聚集体的形成，这些小聚集体有时镶嵌在TDP-43阳性大聚集体内；然而，TDP-43大聚集体本身对硫黄素T呈阴性(图4C). 这些发现表明，大聚集体是无定形和非淀粉样蛋白的。

接下来，我们研究了免疫细胞化学检测到的大聚集体与western blot上的洗涤剂不溶物之间的关系。Neumann及其同事将不溶性高分子量TDP-43和不溶性片段TDP-43描述为ALS和FTD的特征(Neumann等人，2006年). TDP-43蛋白的顺序生化分馏（通过用1µg/ml DOX）表明，在基础条件下，HA-标记野生型或ΔNLS TDP-43显示出与内源性TDP-43相似的生化特征，其中少量（7–21%）可溶于低盐部分，大部分蛋白质位于Triton X-100可溶部分（72–89%）还有一小部分蛋白质仅可溶于沙克糖或尿素（4–11%）(图4D，E). 本研究中使用的HA标记CTF TDP-43几乎完全溶于低盐和Triton X-100馏分（>99%）。鉴于HA–TDP-43 CTF的低表达水平、缺乏聚集形成和高基础溶解度，因此没有进一步研究其溶解度。

使用一个简化的溶解度方案，该方案之前已经过验证，用于分离不溶性聚集TDP-43(Winton等人，2008年)，我们分析了抑制UPS或自噬对野生型和ΔNLS TDP-43溶解度的影响(图4F、G). 至于免疫细胞化学实验，在存在自噬抑制剂或UPS的情况下，用1µg/ml DOX诱导稳定SH-SY5Y细胞中TDP-43的表达48小时。UPS抑制剂对总TDP-43水平（裂解物）的影响比图3A这可能是由于不同的实验范式导致的结果——在洗脱过程中应用抑制剂图3A与持续过度表达抑制剂的应用图4F、G。由于形成聚集物的细胞比例较低，在产生免疫检测大聚集物的条件下，我们无法检测到不溶性部分中TDP-43的增加。然而，联合UPS和自噬抑制（通过3MA和MG132治疗）显示增加了不溶性高分子量（低聚物）TDP-43的水平，表明这些物种可能受自噬调节。同样值得注意的是，即使在实验条件下，TDP-43通过免疫细胞化学（Veh、3MA、Baf）呈弥散状态，也有大量单体TDP-43不溶于RIPA缓冲液。

UPS抑制或UPS和自噬双重抑制诱导的TDP-43聚集体类似于人类疾病中的聚集体

接下来，我们通过以TDP-43大聚集体为降解目标的分子标记来表征其特征。考虑到UPS和自噬的双重抑制增加了不溶性TDP-43的水平，并且比单独的UPS抑制增强了宏观聚集，我们比较了双重抑制诱导的聚集标记和单独的UPS抑制剂诱导的聚集的标记。

我们首先使用未经处理的SH-SY5Y细胞来表征降解衔接蛋白ubiqulin-1和-2（UBQLN）和p62（其中两个，UBQLN2和p62，在人类ALS和FTD的聚集体中可见）以及具有不同内部赖氨酸连接的多泛素链（K48和K63）的基本染色模式(图5A). 这些适配器在未经处理的细胞中广泛定位，但与野生型聚集体共定位(图5B、C)或ΔNLS TDP-43(图5D、E)用1µg/ml DOX加上MG132和3MA或MG132单独诱导。虽然3MA增强了MG132处理诱导的HA–TDP-43 WT向核周聚集物的募集(图5，强度图），它没有改变骨料的标记轮廓。

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 UPS抑制或UPS和自噬双重抑制诱导的TDP-43聚集体类似于人类疾病中的聚集体。（A） 未经处理的SH-SY5Y细胞的免疫细胞化学分析显示降解途径蛋白ubiqulin-1或-2（UBQLN）和p62以及K48-和K63-连接形式的泛素（Ub）的扩散定位。比例尺：25µm。（B–E）对稳定的SH-SY5Y系进行免疫细胞化学分析，在UPS抑制或UPS和自噬的联合抑制下，通过DOX诱导48小时表达HA–TDP-43。（B） 用DOX加蛋白酶体抑制剂MG132处理稳定的SH-SY5Y细胞后，HA–TDP-43 WT形成细胞质大聚集体（箭头）。这些聚集体对翻译后修饰（PTM）阳性，包括K48-和K63连接的泛素、泛素-1和-2以及p62。（C） DOX、MG132和自噬抑制剂3MA的联合治疗增强了HA–TDP-43 WT向大聚集体的募集，这与单独使用MG132治疗的标记物相同。（D） 在稳定的SH-SY5Y细胞中，经DOX加MG132处理48小时后，HA–TDP-43ΔNLS也形成了细胞质聚集体。如HA–TDP-43 WT所示，这些聚集物对K48和K63连接的泛素、泛素-1和-2以及p62呈阳性。（E） DOX加MG132和3MA的联合治疗并未显著改变HA–TDP-43ΔNLS向大聚集体的募集。B–E中图像底部行上的箭头表示图像下方所示强度分布的截面。比例尺：10µm。

UPS功能恢复后，TDP-43宏聚集被清除

接下来，我们试图具体调查不溶性TDP-43的处理。我们使用1µg/ml DOX和MG132（其作用可逆）来诱导不溶性TDP-43 WT或ΔNLS细胞聚集物的形成，然后我们跟踪MG132洗脱后这些聚集物的去向。洗脱期间，DOX在培养基中的浓度保持在1µg/ml，以确保我们的研究结果反映了TDP-43持续表达时TDP-43的聚集处理。端点成像显示，对于两个WT(图6A)和ΔNLS TDP-43(图6B)与MG132处理后直接固定的细胞形成鲜明对比的是，MG132治疗后48小时冲洗期的细胞缺乏TDP-43阳性和p62阳性聚集物。这与MG132洗脱后耐洗涤剂的高分子量TDP-43减少有关(图6C、D). 这些发现可能表明，没有TDP-43聚集物的细胞存在选择性存活，或者聚集的TDP-43在UPS功能恢复后发生折叠或降解。

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UPS功能恢复后，TDP-43宏聚集被清除。对稳定SH-SY5Y系进行免疫细胞化学分析，通过DOX加MG132诱导48小时，然后固定或经受MG132洗脱（wo），然后将细胞再保留48小时，诱导形成HA–TDP-43 WT（A）或HA–TDP43ΔNLS（B）聚集体（箭头）。比例尺：10µm。（C，D）稳定HA–TDP-43 WT（C）或HA–TDP43ΔNLS（D）SH-SY5Y系的溶解度分馏，用DOX诱导，用DOX+MG132处理48小时后诱导形成聚集体，或诱导形成聚合体，然后进行MG132洗脱，然后再将细胞保留48小时h.显示了赖氨酸盐（L）、RIPA可溶性（R）和尿素可溶性（U）级分。尿素馏分浓缩10倍。MG132（*）增加了高分子量不溶性TDP-43（HMW）的比例，这在MG132洗脱（48小时）后是可逆的。（E） 验证EGFP标记的TDP-43 WT在稳定SH-SY5Y细胞中与HA–TDP-43 WT在同一时间段内降解(t吨1/2; HA–TDP-43重量，29.2小时；EGFP–TDP-43重量，29.3小时）。（F） 验证HA和EGFP标记的TDP-43 WT（灰色箭头）都具有功能，并且可以调节稳定SH-SY5Y细胞中内源性TDP-43（黑色箭头）的水平。黑色条表示内源性TDP-43，灰色条表示外源性TDP-43。UT，未转染。（G） 用DOX加MG132诱导48小时形成EGFP–TDP-43ΔNLS聚集物的稳定SH-SY5Y线的活细胞成像，然后进行洗脱，然后再进行15小时。在清除聚集物的细胞中，聚集物在清除前破碎。比例尺：10µm。

因此，我们使用转染EGFP标记的TDP-43的稳定SH-SY5Y细胞检测活细胞中聚集物的清除。我们通过多西环素脉冲相位实验验证了用EGFP替换N末端HA-tag不会改变TDP-43降解的时间进程(图6E，t吨1/2; EGFP–？TDP重量，29.3小时；HA？–TDP重量，29.2小时）。我们还验证了EGFP标记的TDP-43具有功能性，其下调内源性TDP-43的能力证明了这一点(Ayala等人，2011年) (图6F). 接下来，我们用MG132诱导的EGFP–TDP-43ΔNLS聚集物对细胞进行了活细胞成像，这表明大多数聚集物负载的细胞在15小时的洗脱期内死亡（69.3%±5.6），并且聚集物被存活的细胞迅速清除(图6G;补充材料电影1). 由于EGFP–TDP WT聚集体的荧光强度较低，因此无法在活细胞中测量其清除率。

TDP-43聚集清除是由于低阶聚集物种的流动性增强，而不是大聚集TDP-43的清除

以前对其他易聚集蛋白质的研究表明，一些聚集物（例如，并置核质控聚集物，JUNQ）是可移动的，容易与扩散蛋白质池交换，并且可以通过UPS清除(Ben-Gedalya等人，2011年;Kaganovich等人，2008年). 为了确定TDP-43的情况是否属实，我们对扩散和大聚集EGFP–TDP-43ΔNLS进行了光漂白后的荧光恢复（FRAP）(图7A)在稳定的SH-SY5Y细胞中。FRAP通过检测荧光蛋白迁移回荧光被漂白的区域来测量给定的可流动蛋白质库的比例和流动率。

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 TDP-43聚集清除是由于低阶聚集物种的流动性增强，而非大聚集TDP-43的流动性。（A） FRAP期间采集的共焦图像。EGFP–TDP-43-ΔNLS显示扩散细胞溶质形式（Cyt TDP）的荧光快速恢复，但聚集形式（Agg TDP）没有恢复，这表明大聚集TDP-43是不动的，不太可能与扩散池交换。白色虚线包围了漂白区域。比例尺：10µm。（B） FRAP恢复曲线，漂白温度为t吨 = 0和100%代表预漂白荧光强度。在用MG132（MG）处理但没有聚集体（Cyt TDP−Agg）的细胞中，胞质TDP-43的可移动部分略有降低，而在含有聚集体（Cyt TDP+Agg）的细胞中则大大降低。（C） TDP-43在各种条件下可移动的部分。用MG132处理并含有聚集体（Cyt TDP+Agg）的细胞在洗脱（洗涤）后8-10小时，其流动分数的下降被挽救。洗脱后大聚集体TDP-43没有动员。（D） FRAP回收率[如下所示K（K） = ln（2）/t吨1/2]适用于各种条件下的流动物种。在用MG132处理的细胞中，含有聚集物（Cyt-TDP+Agg）的FRAP率显著降低，而在洗脱后，这种情况被逆转。条形图表示平均值±s.e.m。；不另作说明，不重要**P（P）≤0.01, ***P（P）在对照组和处理过的细胞之间≤0.001，或如图所示（单向方差分析，Bonferroni后验）。

我们检测了单独使用1µg/ml DOX诱导表达EGFP–TDP-43的细胞，使用1µg/ml DOX加MG132诱导形成聚集体的细胞，以及诱导形成聚集体的细胞，然后冲洗掉并在含有1µg/ml DOX的新鲜培养基中放置8-10h.首先，通过漂白弥漫性细胞溶质EGFP–TDP-43ΔNLS，我们发现不间断电源的抑制降低了弥漫性TDP-43蛋白的流动比例，无论是在缺乏聚集物的细胞中，还是在含有大聚集物的电池中(图7B、C; 可移动TDP-43的百分比：仅DOX，69%±0.9；不含骨料的MG132，64%±1，P（P）≤0.01; MG132，含骨料，48%±1.6，P（P）≤0.001; ±s.e.m.）。此外，我们发现聚集物中的TDP-43几乎完全不动，在FRAP成像期间聚集物的漂白部分保持黑暗，并且没有与扩散池明显交换(图7A–C; 可移动TDP-43的百分比：2.7%±0.1，P（P）≤0.001). 在MG132洗脱后8–10小时，弥漫TDP-43在仍含有大聚集体的细胞中流动的比例显著增加，这表明以前不动的物种被动员或清除（流动的TDP百分比：洗脱前为48%±1.6，洗脱后为61%±0.7，P（P）≤0.001). 然而，大聚集体TDP-43的直接漂白表明，该物种没有被动员，因为它在洗脱后的流动部分没有增加。

接下来，我们检查了TDP-43蛋白的流动物种的荧光恢复率（分子运动速度）(图7D). 车用处理细胞中的弥漫TDP-43显示出快速恢复(t吨1/2 = 3.4秒）。暴露于UPS抑制但没有聚集物的细胞中的弥漫TDP-43显示出相似的恢复率(t吨1/2 = 3.6 s），而含有聚集物的细胞中TDP-43的恢复速度明显较慢(t吨1/2 = 6.9秒）。荧光回收率的降低表明TDP-43颗粒的结合增加或尺寸增加，这与TDP-43的齐聚反应一致。在MG132洗脱后8–10小时，具有大聚集体的细胞中弥散TDP-43的回收率增加(t吨1/2 = 冲刷前6.9秒与冲刷后4.0秒），表明缓慢移动物种已被移除或分离。

TDP-43聚集清除需要自噬

我们的研究结果表明，在冲刷过程中，缓慢移动和不移动的物种要么被分解为移动或快速移动的物种，要么被直接清除。低聚或微聚物种不能由UPS直接清除，清除它们可能需要聚集自噬或“聚集”(拉马克和约翰森，2012年;Øverbye等人，2007年). 因此，为了测试聚集清除是否涉及自噬，我们首先确定TDP-43聚集的细胞是否包含自噬体，即自噬的双膜效应器。与对照组相比，转染自噬体标记物mCherry–GFP–LC3的细胞显示，诱导形成TDP-43聚集体（1µg/ml DOX+MG132）的细胞中自噬体量（GFP阳性点）显著增加(图8A、B; 每个细胞的自噬体：WT，36±8 MG132 vs 2±1 DOX，P（P）≤0.01; ΔNLS，31±9 MG132对6±2 DOX，P（P）≤0.05; ±标准偏差）。

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 TDP-43骨料清除需要自噬。（A） 含有TDP-43聚集体的细胞中的自噬体。用mCherry–GFP–LC3转染稳定的SH-SY5Y系，然后用DOX+MG132诱导48小时，诱导形成HA–TDP-43 WT或ΔNLS聚集体（箭头）。（B） 按A处理的细胞中每个细胞GFP–LC3阳性自噬体数量的量化。条形代表平均值±标准偏差*P（P）≤0.05, **P（P）控制细胞和处理细胞之间≤0.01（未配对学生的t吨-Welch修正后的测试）。（C） 稳定SH-SY5Y线的活细胞成像，这些线通过DOX+MG132的48小时诱导形成EGFP–TDP-43ΔNLS聚集体（箭头），然后进行冲洗，然后在巴非霉素（Baf）的存在下再进行15小时。骨料破碎但未清除。（D） 洗涤过程中存在或不存在自噬抑制剂时（wo）[3MA，3-甲基腺嘌呤；Baf，bafilomycin；Veh，vehicle；Pearson’s第页 = 0.72（车辆）；0.70（不含3毫安）；0.23（Baf wo）]。在没有（但没有）自噬抑制剂的情况下，小聚集体被迅速清除。在Baf-wo细胞中，可以看到在成像结束时（评分为15小时）未清除的明显聚集物（虚线）。（E） 根据D中所示线的斜率，EGFP–TDP-43ΔNLS骨料的相对清除率。注意，Baf wo的斜率包括“非清除”人口。单因素方差分析结果不显著。比例尺：10µm。

接下来，我们通过实时成像检查了自噬抑制对聚集清除的影响。使用1µg/ml DOX和MG132诱导细胞形成EGFP–TDP-43ΔNLS聚集体，并在洗脱期添加自噬抑制剂(图8C). 如前所述，大多数聚集细胞在成像过程中死亡。死亡的含聚集物细胞的聚集负荷显著高于存活细胞（平均聚集综合强度为7328±1661，而存活细胞的聚集综合强度则为1961±522，P（P）≤0.01，学生t吨-用韦尔奇修正进行测试；±标准偏差）。对于在成像期存活的细胞，我们绘制了聚集蛋白负荷与细胞清除率之间的关系(图8D). 在缺乏自噬抑制剂的情况下，我们发现聚集蛋白负荷与清除所需时间之间存在正线性关系(图8D，Veh）。当存在自噬抑制剂时，大聚集体仍被分解成较小的离散聚集体，这表明存在一个与自噬无关的解聚步骤(图8D，Baf；补充材料电影2). 然而，这些聚集物随后在细胞中持续存在。因此，在存在自噬抑制剂的情况下，与初始骨料荷载和清除时间相关的线的斜率变平(图8D、E，相对坡度3MA，0.74；Baf，0.15）。在含有巴非霉素的情况下，在15小时内完全无法清除的聚集物的存在，无论其大小如何(图8D，虚线），表明聚集清除强烈依赖于自噬。

讨论

ALS和FTD的许多遗传原因集中于TDP-43蛋白降解所涉及的途径。TDP-43本身的突变赋予其抗降解性(Kabashi等人，2008年;卢瑟福等人，2008年;Sreedharan等人，2008年)而p62、ubiquilin-2和VCP的突变(邓等人，2011;Fecto等人，2011年;Watts等人，2004年)破坏自噬和UPS途径，这两者都参与TDP-43的降解。然而，这些途径对维持TDP-43蛋白平衡的相对贡献尚不清楚。先前的研究提供了相互矛盾的证据，发现野生型TDP-43主要由UPS降解(Caccamo等人，2009年;Crippa等人，2010年;Wang等人，2010年;Zhang等人，2010年)或者主要通过自噬(Urushitani等人，2010年)，并且没有人专门检查聚集TDP-43的降解。在此，我们证明全长TDP-43可溶性补体的降解主要由UPS介导，而聚集的TDP-43需要自噬清除。

与许多蛋白质的情况一样，细胞TDP-43可以作为几种不同的物种存在，具有不同的显微镜外观和不同的溶解度和迁移率特征。在这项研究中，我们发现了TDP-43的可溶单体、可溶低聚物、不可溶微聚集和不可溶大聚集形式的证据。可溶性单体呈弥漫性，可溶于洗涤剂，并表现出快速的FRAP。可溶性低聚物也表现为弥漫性，是洗涤剂可溶性的，但表现出缓慢的FRAP。在FRAP实验中，不溶性微集料也呈弥散状，但不溶于洗涤剂且不流动。不溶性大聚集体仅在UPS抑制剂处理的细胞中可见，因为免疫可检测实体由不溶于洗涤剂的高分子量物种组成，不显示FRAP流动性。

我们提出的不同条件下这些物种存在的模型概述如下图9通常，在存在功能性UPS的情况下，去除可溶性单体可将平衡充分推向左侧，以利于小的可溶性物种，并阻止大聚集体的形成。因此，在细胞培养模型和人类对照组织中，只有一小部分TDP-43基本上不溶于洗涤剂(Neumann等人，2006年). 相比之下，UPS阻断会导致缓慢移动的低聚物和不溶性固定TDP-43物种的积累，这些物种可能出现扩散（微聚集）或明显聚集（大聚集）。大聚集体的清除包括分裂成较小的片段，这与自噬无关，然后通过自噬去除低阶物种。低聚物、微聚集体或两者都可以作为自噬的底物，因为自噬阻断有利于碎片大聚集体的持续存在。

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TDP-43物种差异降解的工作模型。上面板；在正常条件下，TDP-43以几种不同的物种存在，具有不同的外观（扩散或大聚集体）、溶解度和流动性（快速或缓慢）。当UPS起作用时，可溶单体的去除推动平衡，有利于小可溶物种，并阻止大聚集体的形成。相反，UPS封锁会导致低聚物和不溶物的积累，其中不溶物包括“微聚集”和大聚集TDP-43；在FRAP实验中，微聚集体在视觉上呈弥散状，但不流动，而大聚集体通过免疫荧光可见且不流动。下面板；大骨料形成后TDP-43清除的工作模型。在正常条件下，通过诱导自噬清除大聚集体，从而去除寡聚物和微聚集体。单体被UPS清除。自噬阻滞阻止了低聚物和微聚集体的去除，尽管大聚集体仍然会发生碎裂。

先前已经证明，抑制UPS可以诱导全长TDP-43的聚集(Kim等人，2012年;van Eersel等人，2011年). 然而，据我们所知，全长TDP-43从未在细胞内仅在自噬抑制条件下聚集。类似地，具有TDP-43蛋白病的ALS也可以建模体内在小鼠中，通过敲除蛋白酶体亚单位（Rpt3，也称为PSMC4）而不是通过敲除自噬诱导中的关键分子Atg7(Tashiro等人，2012年). 这支持了一个模型，即可溶性TDP-43的水平主要由UPS调节，这些物种的积累可能导致聚集物的“成核”。因此，细胞系中蛋白酶体降解的损伤概括了TDP-43的积累、聚集和包涵体的形成体内.自噬的随后损害阻止了聚集的TDP-43的去除。

神经退行性变研究人员就可见蛋白大聚集体是否是“有毒物种”、是否具有保护作用或是否与疾病相关但不是致病原因的副现象展开了激烈的科学辩论。正在形成的共识是，大聚集体可能是真正有毒物种的“汇”，这些物种主要是低阶低聚物，具有更大的流动性和表面积，因此增加了异常相互作用的可能性(考基和兰斯伯里，2003年;Haass和Selkoe，2007年). 然而，大聚集体可以作为评估这些低聚物物种水平的替代物。我们在这里报道的大的TDP-43大聚集体很可能是“聚集体”，一种较小聚集体的聚集体，沿着微管主动转运到核周区域(科皮托，2000年). 聚集物的形成依赖于几个分子，这些分子的基因组突变与ALS和FTD有关，包括VCP、p62和dynein–dynactin(Johnston等人，2002年;Puls等人，2003年;Seibenhener等人，2004年)以及与ubiquilin-2相关的分子ubiquinin-1(Heir等人，2006年). 聚集物被认为不仅可以隔离较小的聚集物以降低其毒性，还可以通过自噬来协调聚集物的清除，这一过程被称为“聚集”(拉马克和约翰森，2012年). 因此，聚集性正在成为ALS和FTD药物研发的关键目标(Thomas等人，2013年).

在这项研究中，我们首次表明全长TDP-43大聚集体被K48和K63连接的多泛素链标记。具有这些不同连接的泛素链被认为可以将蛋白质导向不同的命运，因为特定连接的结合伙伴具有特异性。K48连接的多泛素链与UPS降解相关(Xu等人，2009年). 相比之下，K63连锁链与自噬命运相关。自噬衔接蛋白p62对K63链具有选择性(Seibenhener等人，2004年)并招募LC3阳性自噬体(Pankiv等人，2007年). 泛素-2可以结合任何一种泛素链标记的蛋白质(Rothenberg等人，2010年). TDP-43聚集体上两种类型的链的存在可能与一种模型一致，即K48–泛素标记的底物不能被UPS降解，随后用K63–泛素进行标记以引起聚集(山本和西蒙森，2011年).

聚集的TDP-43的自噬清除模式与其他神经退行性疾病蛋白质的自吞噬清除模式相呼应。野生型亨廷顿蛋白的可溶性片段被蛋白酶体降解，但聚集的膨胀-重复片段无法被蛋白酶体获得，并通过自噬降解(秦等，2003). 突变雄激素受体是导致脊髓和延髓肌萎缩（SBMA）的蛋白质，对苍蝇有毒，当自噬与UPS一起被阻断时，这种毒性会增强(Pandey等人，2007年).

尽管自噬是在对聚集蛋白的沉重负担作出反应时诱导的(丁等人，2007;岩手等人，2005年;Laussmann等人，2011年;Rideout等人，2004年)在我们的模型中，在持续的UPS抑制下，自噬诱导无法清除TDP-43大聚集体。UPS抑制剂和自噬抑制剂的双重治疗表明，自噬一直有助于减少仅由UPS抑制剂引起的TDP-43聚集负担。然而，只有在UPS抑制剂被洗脱后才能完全清除聚集物，这表明自噬不能完全补偿UPS损伤。尽管我们使用低剂量的慢性不间断电源抑制来试图更接近地模拟人类的缓慢退行性过程，但不间断电源损伤的程度可能远远超过衰老或在一些ALS和FTD病例中检测到的基因突变可能引起的程度。因此，激活自噬仍然是治疗人类ALS和FTD的一种有前途的治疗方法。事实上，自噬激活已被证明可以清除初级有丝分裂后神经元中的α-突触核蛋白内含物，即使使用乳胱氨酸持续适度抑制UPS(Rideout等人，2004年). 令人兴奋的是，在基于TDP-43过度表达的小鼠FTD模型中，雷帕霉素（一种mTOR抑制剂，因此可激活（去抑制）自噬））被用于诱导TDP-43的清除，增加运动神经元存活率和运动功能(Wang等人，2012年).

随着年龄的增长，UPS和自噬的效率都会下降(Gamerdinger等人，2009年;Tydlacka等人，2008年;Zhou等人，2003年). 然而，在没有ALS或FTD的老年人中，TDP-43聚集体通常不会累积。在受ALS和FTD影响的人中，TDP-43内含物形成并在寿命结束时仍然存在，这使我们推测，除了正常衰老外，UPS或自噬还存在继发性损伤，促进错误折叠物种的积累并阻止其清除。增强UPS功能可能有助于恢复TDP-43蛋白稳定，并且在UPS损伤持续的情况下，自噬的激活可能会减少聚集的TDP-43蛋白负荷。因此，识别选择性增强每一个过程的分子，并结合使用以减少TDP-43的积累，是一种有效的治疗策略。

材料和方法

质粒

构造如图所示图1A这些结构允许多西环素诱导标记的（HA或EGFP）TDP-43野生型（WT）、核定位序列缺失的[ΔNLS（Δ82–98）]或C末端片段[CTF（181–414）]的表达。所有构造均由网关克隆生成（Invitrogen Life Technologies，Carlsbad，CA）。根据制造商的说明（Invitrogen Life Technologies），使用BP克隆酶II将AttB侧翼PCR产物亚克隆到pDONR221中，然后使用LR克隆酶II亚克隆到p DEST30中。N末端HA.11标记的TDP-43 WT、ΔNLS和CTF从现有结构中扩增(Nishimura等人，2010年). 首次使用pEGFP-C1生成N末端EGFP标记的TDP-43 WT(Xho公司我/巴姆HI）然后子克隆到网关。EGFP标记的TDP-43ΔNLS是通过pDONR（QuikChange II，Stratagene）中WT结构的定点突变产生的。可根据要求提供引物序列。

所有构建物都通过使用Big-Dye进行DNA测序进行内部验证®ABI3130基因分析仪上的终结者v1.1（英国佩斯利Invitrogen Life Technologies）（英国沃灵顿应用生物系统有限公司）。使用Geneius v5.4.6（新西兰奥克兰Biomatters）对序列色谱图进行分析。所有引物均来自Sigma-Aldrich（英国多塞特）。mCherry–GFP–LC3质粒(Pankiv等人，2007年)由泰耶·约翰森（挪威特罗姆瑟大学）提供。FLAG–Ub质粒(Tan等人，2008年)是Lim Kah-Loong（新加坡国立大学）的一份礼物。

UPS和自噬修饰药物

从Acros Organics（比利时Geel）购买了3MA（10 mM用量）、bafilomycin（400 nM）和氯化锂（10 mM）。MG132（0.5µM）、环氧霉素（100 nM）和雷帕霉素（0.2µg/ml）购自开曼化学公司（英国剑桥）。海藻糖（100mM）购自Sigma-Aldrich。

哺乳动物细胞系培养、转染、电镀和诱导

使用T-REx系统，在人类神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞（CRL-2266；ATCC，Middlesex，UK）和人类胚胎肾脏HEK293（T-REx HEK293#R710-07，Invitrogen Life Technologies）中生成稳定的四环素诱导（Tet-ON）克隆细胞系。简单地说，用脂质体2000转染pcDNA6/TR（编码组成性表达的Tet-阻遏蛋白）的稳定克隆系，用pDEST30-TDP-43构建物转染，该构建物使用600µg/ml基因素筛选并克隆分离。

SH-SY5Y细胞保存在DMEM/F12加谷氨酰胺中，补充10%胎牛血清（FBS）（无Tet-free，S0115T，BioChrom AG，Berlin，Germany），100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素。HEK293细胞（稳定的Tet-ON）保存在DMEM加谷氨酰胺中，补充10%FBS（无Tet-free）、100 U/ml青霉素和100µg/ml链霉素。所有细胞保持在37°C，5%CO下2.

按照制造商的说明，使用Lipofectamine 2000将mCherry–GFP–LC3瞬时转染到稳定的SH-SY5Y细胞系中。按照制造商的说明，使用Fugene HD（英国南安普敦Promega）将FLAG–Ub瞬时转染到稳定的HEK293细胞系中。为了进行实验分析，SH-SY5Y线以75000个细胞/厘米的速度电镀2，HEK293线以25000个细胞/厘米的速度电镀2并且使用1µg/ml DOX诱导TDP-43表达，除非另有说明。除非另有说明，否则所有试剂均购自Invitrogen Life Technologies。

免疫荧光和成像

为了进行免疫荧光分析，将SH-SY5Y线镀在未经处理的13-mm盖玻片（1.5厚度）上。HEK293管线被镀在聚-D-赖氨酸处理的盖玻片上。处理后，将细胞固定在4%多聚甲醛（PFA，VWR International Ltd，Leicestershire，UK）中10分钟，并用磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗。将细胞与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后在室温下与荧光二级抗体孵育6小时，每个二级抗体在PBS中用0.2%Triton X-100和1%血清（山羊或驴，视情况而定）稀释。对于硫黄素T染色，用新制备和过滤的0.1%硫黄素T（Acros Organics）在PBS中对细胞染色10分钟并冲洗。免疫检测后，使用荧光固定介质（Dako，Carpenteria，CA）将盖玻片固定在载玻片上，并放置一夜使其变硬。

用于免疫荧光的抗体针对TDP-43（小鼠：sc-100871，1∶500，Santa Cruz Biotechnology，Heidelberg，Germany；兔子：1078-2-2-AP，1∶5000，ProteinTech Europe，Manchester，UK），HA.11（小鼠；MMS-101P，1比1000，Covance，Leeds，UK：兔子；#3724，1∶1000，Cell Signaling Technology，Beverly，MA），p62（#610833，1∶1000，BD Biosciences，San Jose，CA），泛素（Z0458，1∶200，Dako UK Ltd，Ely，UK），K48-连接泛素（#05-1307，1∶500，Millipore，Temecula，CA）、K63-连接的泛素（#05-1308，1∶5000，Millipose），泛碱-2（sc-100612，1∶2000，Santa Cruz Biotechnology；也通过western bloting检测泛素-1）。Invitrogen Life Technologies山羊二级抗体（Alexa-Fluro-488−anti-mouse-IgG，A11001；Alexa-Ffuro-568−anti rabbit-IgG，Al1011）或Jackson ImmunoResearch驴二级抗体，Alexa-Ffluor-649−anti-muse-Ig，715-495-150）的使用比例为1∶500。

使用蔡司Axiovert S100（英国赫特福德郡卡尔蔡司有限公司）和×63/NA 1.25 Plan Neofluar油浸物镜进行广域成像，该物镜配备CoolSnap EZ数码相机（亚利桑那州图森市Photometrics）。使用Leica TCS SP5共焦激光扫描显微镜（Leica Microsystems，白金汉，英国）获得共焦图像，该显微镜具有×63/NA 1.4 Plan Apo油浸物镜和95.6µm的针孔（Airy 1）。使用徕卡LAS-AF软件和405 nm、488 nm和633 nm激光线，以400 Hz的频率采集图像（1024×1024像素），线平均值为8。

使用ImageJ（版本1.45e，NIH，Bethesda，USA，网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/)代表性实验的合并RGB图像。GFP–LC3自噬体使用Metamorpha中的粒度工具进行定量（英国沃金汉分子器件7.7版），并通过手动计数GFP阳性细胞将颗粒归一化为转染细胞的数量。在典型实验中，在20–50个转染细胞中计数113–622个颗粒。

多西环素脉冲追逐试验

如前所述，使用多西环素（DOX）脉冲追踪法研究各种TDP-43结构体的降解率(Ravikumar等人，2002年). 简言之，使用10 ng/ml DOX诱导TDP-43表达24小时，以实现几乎最大表达(图1D、E). 为了清洗，细胞在新鲜的无DOX培养基中冲洗两次。为了初步表征HEK293细胞中的降解速率，在DOX冲洗前（0小时）以及冲洗后24、48和72小时采集样品(图2A). 为了验证SH-SY5Y细胞中的降解率，在冲洗后24、28、32和48小时采集样品(图2B). 为了研究TDP-43在HEK293细胞中的降解途径，在DOX洗脱前（0 h）采集样品，然后在洗脱24 h后添加抑制剂、活化剂或载体对照，再在48 h后采集样品(图3A). 将细胞收集到1×SDS加载缓冲液[Laemmli缓冲液(莱姆利，1970年)不含溴酚蓝或还原剂]，煮沸10分钟，然后在−20°C下冷冻。用MG132、环氧霉素或巴菲尔霉素处理过的微孔以两倍于降解试验所用密度进行电镀，以降低毒性(Bar等人，2004年). 退化时间过程数据拟合为一个单相指数衰减，并使用GraphPad Prism 6.02（GraphPad-Software，San Diego，CA）绘制。

定量聚合酶链反应

使用RNeasy Lipid Tissue Mini Kit（英国西苏塞克斯郡齐根市）提取总RNA并进行DNA酶处理，使用寡核苷酸（dT）引物和SuperScript逆转录cDNA®III第一股合成SuperMix（Invitrogen Life Technologies）。使用FASTStart SYBR Green Mastermix在运行SDS v.2.3软件的7900HT快速实时PCR系统（Applied Biosystems）上进行定量PCR。用于检测HA–TDP WT和ΔNLS转录物的引物为5′-TACCCATACGTTCCAGATTACTC-3′和5′-GCATGCAGATATCTACCT-3′。使用相同的HA-特异性正向引物和反向引物5′-CCCCGTACTGAGAGAACT-3′对HA–TDP CTF转录物进行定量。GAPDH公司作为参考转录本，使用引物5′-CAGCCTCAAGATCATCAGCA-3′和5′-GGCATGGACTGTGGTCATGAG-3′。PCR循环条件为：95℃下活化10min；循环，95°C下15 s，60°C下30 s，72°C下30s，40个循环；其次是热变性方案。HA–TDP转录物的表达水平与GAPDH公司使用Pfaffl方法测定转录本（参考），并将其归一化为无DOX（对照）(Pfaffl，2001年).

溶解度分级

如前所述，对ALS和FTD脑匀浆进行细胞蛋白的顺序生化分级(Sampathu等人，2006年)，对单元格进行了一些修改。颗粒最初在低盐（LS）缓冲液中重新悬浮，然后依次在以下缓冲液中再次悬浮（体积显示为相对于LS体积的体积）：Triton X-100，200%；沙克西林，30%；尿素，40%。以14000 rpm在4°C下离心30 min。髓磷脂浮选缓冲步骤被省略。

按照Winton及其同事的描述进行RIPA/尿素溶解度分级(Winton等人，2008年)，在4°C下以14000 rpm离心30分钟，并忽略超声作用。将最终（尿素）颗粒重新悬浮在原始溶解体积的10%中。

蛋白质印迹和密度测定分析

使用BioRad DC蛋白质测定法（BioRad，Hemel Hempstead，UK）对蛋白质浓度进行定量，并为每个样品加载等效蛋白质（HEK293，5µg；SH-SY5Y，10微克）。在溶解度实验中，对全水解蛋白质进行定量，并加载可溶性和不溶性部分的等效液体体积。使用iBlot（Invitrogen Life Technologies）将凝胶转移到硝化纤维素上，用Ponceau S染色，然后用0.05%吐温-20（TBS-T）和5%无脂奶粉（NFDM，Sigma-Aldrich）在TBS中封闭30分钟。用一级抗体在4°C下过夜探测斑点，然后用3在室温下用二级抗体（全部在TBS-T中加上1%NFDM）培养h。在Li-Cor Odyssey凝胶扫描仪（英国剑桥Li-Cor生物技术公司）上对印迹进行扫描，然后使用相同的抗体条件和扫描协议对装载控制蛋白进行重制（无剥离）。

用于印迹的抗体是针对TDP-43（小鼠：sc-100871，1∶1000）、HA.11（#3724，1∶000）、组蛋白H3（H0164，1∶10000，Sigma-Aldrich）、p62（#610833，1∶100）、GAPDH（G9545，1∶1000Sigma-Aldrich），GFP（小鼠：sc-9996，1∶千，Santa Cruz）、LC3B（#2775，1∶500，Cell Signaling Technology）的和Dylight荧光二级抗体（35521，山羊抗鼠IgG–Dylight 680，1∶5000；35568，山羊抗兔IgG-Dylight 700，1∶10000，英国莱斯特郡Fisher Scientific UK Ltd）。

使用ImageJ中的凝胶分析仪工具量化TIF格式的印迹图像。将积分带强度归一化为加载控制的带强度，以及溶解度分析的相对输入。

TDP-43骨料清除分析

通过RIPA/尿素溶解度分级和免疫荧光（HA标记的构建体）以及活细胞成像和光漂白后荧光回收（FRAP）（EGFP标记的构建体）来评估TDP-43聚集体的清除率。对于所有集料清除率分析，稳定的SH-SY5Y TDP-43 WT或ΔNLS细胞以100000个细胞/cm的速度培养2并在一夜之间恢复。用DOX诱导TDP-43表达24小时，然后用DOX和0.5µM MG132再诱导48小时形成聚集物。对于洗脱实验，然后将细胞清洗并放在含有DOX但不含MG132的新鲜培养基中，在存在或不存在抑制剂的情况下保持规定的时间。

实时细胞成像

使用实时成像评估EGFP–TDP-43ΔNLS聚集物是否被清除。将稳定的SH-SY5Y细胞镀到Hi-Q4培养皿上（德国Ibidi GmbH）。在成像之前，立即清洗细胞并将其置于不含MG132的新鲜培养基中，该培养基含有DOX和载体（0.05%DMSO）、3MA（10 mM）或巴非霉素（400 nM）。

使用配备有×20/NA 0.5平面荧光物镜的BioStation IM-Q（尼康英国有限公司，萨里郡，英国）每小时两次采集带有聚集物的选定细胞的外荧光和相位图像（1280×960像素），并将其保持在37°C，5%CO下2使用ImageJ分析图像集。骨料荷载定义为给定单元中所有骨料的总集成密度（面积×强度），骨料边界由强度阈值确定。清除时间被定义为聚集物与弥漫TDP-43无法区分的时间。

光漂白后的荧光恢复

将稳定的SH-SY5Y EGFP–TDP-43 WT或ΔNLS电池镀在18-mm盖玻片（1.5厚度）上。为了研究MG132洗脱后的蛋白质流动性，在FRAP之前将细胞清洗并放置在含有DOX但不含MG132的新鲜培养基中8–10小时。

FRAP是使用尼康A1 plus激光扫描共聚焦显微镜进行的，该显微镜配有一个保持在37°C的环境室（英国塞根斯沃思索伦特科学公司）。使用×60/NA 1.4 Apo油浸物镜、34.8µm（Airy 1.2）的共焦针孔和488-nm激光线获得共焦图像。FRAP是使用NIS-Elements AR软件执行的（v.4.00.04）。采集512×512像素的图像。在使用2µm的方形感兴趣区域（ROI）漂白EGFP–TDP-43（70毫秒，50%氩激光）之前，以1–3%的激光功率采集了五个预漂白帧2。荧光恢复后1分钟，激光功率为1–3%，以尽量减少采集漂白。

使用ImageJ和Bio-Formats插件进行数据分析(Linkert等人，2010年). 在每个时间点测量漂白ROI以及背景和相邻未漂白细胞中ROI的平均强度，以校正采集漂白。漂白ROI的FRAP恢复曲线是通过首先减去每个时间点的背景并校正采集漂白，然后使用方程归一化为预漂白和漂白来计算的

方程式图像

哪里我t吨是ROI在给定时间的荧光强度，我0是漂白后ROI的荧光强度，以及我我是漂白前ROI的平均荧光强度。数据拟合为单相指数衰减，并使用GraphPad Prism 6.02绘制。

统计分析

除非另有说明，否则使用Microsoft Excel进行数据处理和图形表示。使用GraphPad Prism 6.02执行图图例中所述的统计分析。Bartlett等方差检验后进行单因素方差分析。对于单因素方差分析和双因素方差分析，使用Bonferroni后验比较所选数据集。双尾学生的t吨-测试是在如果-在规定的地方进行了等方差检验和韦尔奇修正。在D'Agostino和Pearson正态性检验后进行Pearson相关检验。统计显著性设置为P（P）≤0.05(*P（P）≤0.05; **P（P）≤0.01; ***P（P）≤0.001). 所有图片均使用Adobe Photoshop CS3制作。

补充材料

补充材料：

致谢

作者感谢Sophie Morris、Vicky Strzelczyk、Jamie Wright和John Harris（伦敦国王学院尼康成像中心）提供的技术和行政支持。

脚注

竞争性利益

作者声明没有相互竞争的利益。

作者贡献

E.L.S.构思、设计和执行实验；C.V.、A.L.、Y.B.L.、H.J.C.、V.S.、B.R.、D.C.R.和C.E.S.构思和设计实验；E.L.S.、C.V.、A.L.和H.U.生成的质粒构建物和细胞系；E.L.S.、V.S.和J.C.M.进行了分析；E.L.S.、C.V.、A.L.、B.R.、D.C.R.和C.E.S.撰写了手稿。

基金

这项工作得到了Wellcome信托和医学研究委员会（MRC）的战略拨款奖的支持[拨款编号089701]；由美国ALS协会和伦敦国王学院精神病学研究所精神病理学研究信托基金资助。D.C.R.是威康信托首席研究员。E.L.S.得到了欧洲委员会玛丽·居里奖学金（编号PIIF-GA-2009-252096]。存放在PMC中，以便立即发布。

补充材料在线提供http://jcs.biologies.org/lookup/supl/doi:10.1242/jcs.140087/-/数据中心1

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