线粒体是源自原始需氧细菌的内共生细胞器。健康的线粒体是大多数后生动物细胞功能的基本能量发生器，而衰老或受损的线粒体是有毒活性氧的来源。因此，线粒体的生物发生和有丝分裂的消除是精心安排的，它们的突变破坏会导致慢性退行性疾病(1). 遗传学研究已将帕金森氏病与两个有丝分裂基因的突变联系起来，这两个基因是E3泛素连接酶Parkin和丝氨酸-三烯蛋白激酶PINK1（PTEN诱导的假定激酶蛋白1）(2). 线粒体内膜电化学梯度的丧失使受损细胞器上的PINK1稳定下来，并标记它们进行Parkin结合、泛素化和有丝分裂消除(三). PINK1和Parkin之间分子相互作用的具体性质尚不清楚，受损线粒体上的Parkin受体蛋白尚未确定。
线粒体外膜融合蛋白和Parkin泛素化底物(4,5). 小鼠心脏中Mfn1和Mfn2的联合基因消融导致线粒体功能障碍和断裂，这将刺激有丝分裂清除，但反而导致异常细胞器的增殖(6). 因为有丝分裂是由Parkin介导的线粒体蛋白泛素化刺激的(7,8)，我们测试了Mfn1或Mfn2是否可能介导PINK1-Parkin的信号传导活性。Parkin与Mfn 2共同免疫沉淀，而不是Mfnl，是从转染有标记的丝裂原融合蛋白和Parkin的人胚肾（HEK）细胞的提取物中沉淀的。在转染过表达PINK1的细胞中，Mfn和Parkin-的结合也大大增强(,图S1)。
Mfn2与Parkin的PINK1依赖性相互作用及其对Parkin向去极化线粒体移位的要求（A）和B）用Flag-Mfn1（A）或Mfn2（B）、PINK1和/或HA-Parkin转染成纤维细胞，用抗Flag和免疫印迹（IB）进行免疫沉淀。右侧面板显示输入匀浆的IB。（C）野生型、Mfn1缺陷型和Mfn2缺陷型小鼠心肌细胞中由FCCP线粒体去极化诱导的亚细胞Parkin再分配（绿色）。
氧化磷酸化抑制剂羰基氰化物4-（三氟甲氧基）苯腙（FCCP）使线粒体去极化，并刺激PINK1介导的Parkin向线粒体的移位，从而针对受损的细胞器进行有丝分裂(三) (图S2). 与Mfn2在这一过程中的作用一致，FCCP治疗刺激Parkin与内源性成纤维细胞Mfn1结合(图S3). PINK1的过度表达增强，而RNAi抑制PINK1(图S3). 我们在心肌细胞中建立了这种途径的体外模型，因为它们大量表达内源性Mfn2和Parkin，并且有丰富的线粒体。在遗传正常的心肌细胞中，线粒体与FCCP解偶联(图S4)Parkin定向重新分布到细胞内点状突起，特别是富含线粒体的核周区(，左侧面板）。FCCP刺激Mfn1-null，而非Mfn2-null心肌细胞的Parkin易位(、中间和右侧面板）。在Mfn2-null细胞中，Parkin保持弥散的细胞溶质状态，这表明内源性Mfn2需要促进Parkin定位到去极化线粒体。因为Mfn1和Mfn 2在缺乏对应物的心脏中均以正常数量表达(图S5)，重组Mfn1不结合Parkin()，Parkin招聘似乎是Mfn2的独特财产。
Mfn2可以是Parkin泛素化底物(8). 这可能需要PINK1刺激Parkin和Mfn2与线粒体的结合，因此我们测试了PINK1-Mfn2-Parkin相互作用对泛素化的功能意义。我们观察到HEK细胞中泛素化与PINK1刺激的Mfn2与Parkin结合完全一致()以及FCCP刺激的离体灌流小鼠心脏内源性心脏Mfn2与Parkin的结合(). 相反，心肌细胞中Mfn2（而非Mfn1）基因消融降低了线粒体去极化刺激的线粒体泛素化，与Parkin易位的模式相同(,图S6). 此外，在FCCP治疗的Mfn2缺乏的心肌细胞中，作为丝裂原适配器蛋白p62（也称为隔离体1[SQSTM1]）的点状积聚而测量的丝裂原反应受到损害(,图S6). 总之，这些数据支持一种模型，即Mfn2作为一个受体发挥作用，细胞溶质Parkin与去极化线粒体结合，引发线粒体蛋白质泛素化，靶向细胞器进行自噬消除。
Mfn2缺乏小鼠心脏的缺陷泛素化和有丝分裂（A）PINK1/含Parkin的HEK细胞免疫复合物中Mfn2的泛素化（左）。输入蛋白质在右边。（B）FCCP刺激小鼠心脏Mfn2/Parkin免疫复合物中的蛋白质泛素化。（C）FCCP在野生型、Mfn1-和Mfn2-缺陷小鼠心肌细胞中诱导的线粒体泛素化（绿色）。单元格边框轮廓为白色。（D）丝裂原适配体蛋白p62/SQSTM1（绿色）的平行研究。
PINK1增强Mfn2-Parkin结合表明Mfn2可能被磷酸化。我们注意到，当PINK1被联合转染时，Mfn2的一部分电泳迁移率略有改变，这表明可能存在翻译后修饰(，顶部）。Phos-Tag凝胶上的这种迁移率变化增强，表明Mfn2可能在一个或多个位点被磷酸化(，底部；图S7). 事实上，在过度表达PINK1的细胞中，免疫沉淀Mfn2的磷酸丝氨酸免疫反应性也增加(). 如果Mfn2-Parkin相互作用需要PINK1介导的Mfn2磷酸化，那么催化活性的PINK1-应该无效。与这一概念一致的是，具有催化活性的PINK1 K219A/D362A/D384A突变体(9)在Phos-Tag凝胶上未能促进Mfn2-Parkin结合或诱导Mfn2迁移率的特征性变化()。
Mfn2 T111和S442的PINK1磷酸化决定Parkin结合(A类)PINK1在SDS-PAGE（顶部）和Phos-Tag（底部）凝胶中诱导的Mfn2电泳迁移率偏移（箭头）。右侧显示了车道4和车道5的分解图。(B类)PINK1通过抗磷酸丝氨酸免疫印迹（IB）介导的Mfn2磷酸化（箭头）。(C类) (左边)Mfn2-Parkin与功能性和激酶缺陷型（KD）PINK1联合免疫沉淀研究；(正确的)功能性和KD PINK1的Mfn2磷酸标记磷酸化研究。(D类)Mfn2 T111A和S442A突变对PINK刺激的Mfn2-Parkin结合的影响。(E类)通过Mfn2 T111A/S442A突变消除PINK1刺激的Mfn2-Parkin结合，通过Mfn 2 T111E/S442E突变诱导PINK1-依赖性Mfn2-Parkin的结合。
为了确定Mfn2是PINK1的底物和Parkin的线粒体结合伙伴，我们绘制了Mfn2-PINK1-磷酸化位点并检查了其功能后果。生物信息学分析确定了三个高度保守的潜在Mfn2磷酸化位点：T111、S442和Y448(图S8和S9). 由于PINK1是一种丝氨酸-三嘌呤激酶，我们将Mfn2 T111和S442突变为丙氨酸，防止其磷酸化。两种Mfn2突变都降低了PINK1刺激的Mfn2-Parkin结合，但没有消除它()而同时突变这两个残基（T111A/S442A）完全消除了PINK1刺激的Mfn2和Parkin之间的相互作用(). 与这些功能丧失数据一致，Mfn2突变模拟Mfn1的PINK1磷酸化（T111E/S442E），赋予PINK1-依赖于Parkin的结合活性(). 总之，这些研究揭示了Mfn2调控PINK1-Parkin线粒体质量控制装置的潜在机制。
我们测试了由于缺乏其线粒体结合伙伴而导致Parkin易位减少是否会对线粒体长期内稳态产生不利影响。由于Mfn1不具有Parkin结合活性，因此Mfn 1的缺失对心肌细胞的线粒体形态计量学或呼吸功能没有影响(图S10 A和B). 然而，Mfn2缺失引起线粒体增大，我们通过超微结构检查进行了测量(,图S10A)和流式细胞仪前向光散射(图S10C). Mfn2-null心肌细胞也表现出底物依赖性O降低2消耗，表明线粒体呼吸障碍()。
Mfn2缺乏小鼠心脏和Parkin缺乏果蝇心脏管的进展性心肌病（A）小鼠心肌细胞线粒体的透射电镜检查（5000x）。（B）全电池O2从野生型（黑色）或Mfn2缺乏型（红色）小鼠心脏分离的心肌细胞的消耗研究。（C）小鼠心脏M型超声心动图。（D）共焦成像果蝇属心肌细胞线粒体。（E）O（运行）2从野生型（黑色）或帕金缺乏型（红色）分离的心脏导管的消耗研究果蝇属。（F）光学相干层析成像果蝇属心脏导管。(G）FCCP诱导野生型和Parkin缺乏型线粒体泛素化（绿色）果蝇属心肌细胞。
衰老心脏的线粒体功能随着时间的推移而恶化，导致心力衰竭的发病率随年龄增长而增加(10). 由于Mfn2消融术引起的线粒体异常与年龄相关性心肌病相似，我们评估了心肌特异性Mfn1和Mfn 2基因敲除小鼠体内心脏随时间的心室扩张和收缩功能。心脏Mfn1缺乏似乎正常(图S11A)通过无创超声心动图评估心脏功能正常(图S11B)或有创血流动力学收缩性测量（+dP/dt）(图S11C). 然而，缺乏Mfn2的心脏随着年龄的增长而扩张(图S11D)，通过超声心动图评估收缩性能受损(,图S11E)和对β肾上腺素能刺激不敏感(图S11F). 如果缺乏Mfn2的心脏中的心肌病是由Parkin信号缺陷引起的，那么原发性Parkin缺陷应该重述细胞器和器官表型。的确，在果蝇属缺少Parkin(11)心肌细胞线粒体增大()，心脏导管出现呼吸缺陷()、腔室扩张和收缩障碍(,图S12)FCCP刺激后，缺乏Parkin的心肌细胞线粒体未有效泛素化(). Mfn2缺乏小鼠心脏和Parkin缺乏小鼠心脏的共同特性果蝇属心脏导管具有适应性重塑不良和扩张型心肌病的特征。Parkin在两种模型中均不能促进泛素依赖性有丝分裂，这可能导致异常线粒体积聚，最终损害细胞呼吸并损害心脏功能。
我们的结果表明线粒体融合蛋白Mfn2是受损线粒体上的Parkin受体，将线粒体再生与选择性细胞器剔除联系在一起。研究表明Mfn2在Parkin下游的有丝分裂中起作用(4,5)，但它似乎也在上游发挥作用，帮助翻译用于Parkin易位的PINK1信号。我们设想PINK1稳定在去极化线粒体磷酸化Mfn2中，Mfn1可以吸引并结合Parkin促进有丝分裂。在缺乏Mfn2的情况下，有丝分裂质量控制的PINK1-Parkin通路中断，异常线粒体积聚，继而发生心脏毒性。肝和神经特异性Mfn2消融术中观察到的线粒体异常也表明了Mfn2-作为Parkin受体的广泛作用(12,13). 缺乏Mfn2的培养胚胎成纤维细胞Parkin易位到线粒体(8)表明一种或多种代偿性Parkin结合机制具有活性，尽管呼吸系统损害表明这些次要机制不完全有效(图S13). 就像内质网的栓系(14)Mfn2独特的Parkin受体功能将其与Mfn1区分开来。Parkin结合缺陷在遗传性神经病中可能具有重要意义，该疾病与Mfn2突变有关，以异常线粒体增生为特征(15). 阻断Parkin介导的心脏有丝分裂的不良后果也可能为老年人帕金森氏病和心肌病之间先前未解释的流行病学联系提供线索(16,17)。
