溶酶体-细胞核信号机制通过mTOR和TFEB感应和调节溶酶体

mTORC1调节TFEB亚细胞定位

根据mTORC1存在于溶酶体膜上的观察，其活性取决于营养物质和溶酶体功能(Sancak等人，2010年;Zoncu等人，2011年a)我们推测溶酶体应激对TFEB核转位的影响可能由mTORC1介导。与这一想法一致，氯喹或SalA通过已知的mTORC1底物p-P70S6K水平测量抑制了mTORCl活性(图2A;Zoncu等人，2011年a). mTOR的参与与我们之前的观察结果形成对比，即已知的mTOR抑制剂雷帕霉素不影响TFEB活性。然而，最近的数据表明，雷帕霉素是mTOR的部分抑制剂，因为在该药物存在下，一些底物仍然有效磷酸化(Thoreen等人，2009年). 因此，我们使用了激酶抑制剂Torin 1和Torin2，它们属于一类新的分子，靶向mTOR催化位点，从而完全抑制mTOR活性(Feldman等人，2009年;Garcia Martinez等人，2009年;Thoreen等人，2009年).

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图2

mTORC1调节TFEB。(A类)溶酶体应激抑制mTOR信号传导。如图所示，对从HeLa细胞中分离的蛋白质提取物进行免疫印迹。用抗p-T202/Y204-ERK1/2、ERK1/2、p-T389-S6K和S6K抗体检测细胞膜，以测定ERK和mTORC1活性。(B)Torin 1诱导TFEB去磷酸化和核移位。从TFEB–3×FLAG HeLa细胞中分离的细胞溶质和核组分的FLAG免疫印迹在无氨基酸介质中饥饿，随后按指示刺激至少3小时。H3和微管蛋白抗体验证了正确的亚细胞分馏。(C类)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位的影响。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在96个平板中，培养12 h，然后用指定浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理。37°C下培养3小时后，使用OPERA自动共焦显微镜（Perkin-Elmer）处理细胞并采集图像。比例尺代表30μm。(天)ERK和mTOR抑制剂对TFEB核转位影响的剂量-反应曲线。将TFEB–GFP HeLa细胞接种在384孔板中，培养12 h，并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126或mTOR抑制剂雷帕霉素、Torin 1和Torin 2处理，范围从2.54 nM到50μM。该图显示了每种化合物在不同浓度下的核移位百分比（以浓度的对数表示）。使用Prism软件计算每种化合物的EC50（详见材料和方法）。(E类)用二甲基亚砜或Torin 1处理的HEK-293T细胞的免疫荧光，并用抗内源性TFEB和溶酶体蛋白RagC的抗体染色（合并中分别为绿色和红色）。DAPI包含在合并中。比例尺代表10μM。(F类)Rag GTPase敲除诱导TFEB核移位。稳定表达TFEB–3×FLAG的HeLa细胞感染慢病毒，慢病毒编码靶向荧光素酶（对照）或RagC和RagD mRNA的短发夹（Sh-）RNA。在所有样本中，感染后96小时，细胞未经处理（N=正常培养基）、饥饿（S=饥饿培养基）或用Torin 1（T=Torin 2）处理4小时，然后进行核/细胞溶质分离。用FLAG抗体检测TFEB定位，而微管蛋白和H3分别用作细胞溶质和核部分的对照；S6K磷酸化水平用于测试RagC和RagD敲除效率。(G公司)mTORC2缺失不影响TFEB磷酸化。从Sin1−/−或对照胚胎（E14.5）分离的小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）感染编码TFEB–3×FLAG的逆转录病毒；感染后48小时，用Torin 1（T）处理细胞4小时，进行核/细胞溶质分离，并对FLAG、tubulin和H3进行免疫印迹。(H（H）)TFEB与mTORC1的结合。对表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞进行裂解并进行FLAG免疫沉淀，然后对mTOR、mTORC1亚单位raptor和mTORC2成分rictor和Sin1进行免疫印迹。FLAG–Rap2A作为阴性对照。

我们用富含氨基酸的培养基（补充Torin 1（250 nM）、雷帕霉素（2.5μM）或ERK抑制剂U0126（50μM））刺激饥饿细胞，其中TFEB脱磷并定位于细胞核。仅用营养素刺激饥饿的细胞会导致TFEB分子量的显著改变和细胞质的重新定域(图2B). 在50μm浓度的ERK抑制剂U0126存在的情况下，营养刺激仅诱导TFEB分子量的部分转移，这表明ERK的磷酸化部分有助于TFEB的细胞质定位。2.5μM雷帕霉素处理也导致部分分子量改变，但不影响TFEB亚细胞定位(图2B)与我们之前的观察结果一致(Settembre等人，2011年). 然而，Torin 1（250 nM）处理完全阻止了营养物质引起的分子量变化，进而导致大量TFEB核积累。这一结论与最近的一项研究相反，该研究表明，mTOR介导的TFEB磷酸化促进而非抑制其核转位(Pena-Llopis等人，2011年). 相反，我们的数据表明，mTOR是TFEB核转位的有效抑制剂，TFEB是mTORC1的雷帕霉素耐药底物。

在之前的研究中，我们表明ERK2磷酸化TFEB，饥饿和ERK2抑制促进TFEB核移位(Settembre等人，2011年). 我们测试了溶酶体应激是否也通过ERK抑制导致TFEB核移位。用氯喹或SalA隔夜处理HeLa细胞对ERK活性没有任何影响(图2A)表明mTOR介导的调控是主要的。为了量化ERK和mTOR对TFEB亚细胞定位的影响，我们开发了一种基于细胞的高含量检测方法，使用稳定的HeLa细胞，该细胞过度表达TFEB并融合到绿色荧光蛋白（TFEB–GFP）（有关详细信息，请参阅材料和方法）。我们测试了每种抑制剂（U0126、雷帕霉素、Torin 1和Torin 2）的10种不同浓度，范围从2.54 nM到50μM。图2C和D显示了每种化合物每种浓度的TFEB核/细胞质分布，一式两份，用非线性回归拟合表示为剂量-反应曲线（详见材料和方法）。与上述数据一致，激活TFEB核转位的最有效化合物是Torin 1（EC50；147.9 nM）及其类似物Torin 2（EC50，1666 nM）。ERK抑制剂U0126仅显示部分作用，而雷帕霉素在常规使用的任何浓度（10 nM–10μM）下均无作用。此外，Torin 1处理能有效诱导HEK-293T细胞内源性TFEB的核积累(图2E)，证实了TFEB–GFP构造获得的观察结果。

由于Torin 1同时抑制mTORC1和mTORC2复合物，我们接下来评估了每个复合物对TFEB调节的贡献。三个主要观察结果表明，TFEB主要受mTORC1的调节：（1）用氨基酸刺激饥饿的细胞，激活mTORC2，但不激活mTORC 2，引起广泛的TFEB分子量变化，这极有可能是磷酸化事件(补充图S2); （2） RagC和RagD介导mTORC1的氨基酸信号，即使在保持在全营养培养基中的细胞中，RagC和RagD的敲除也会导致TFEB核积累(图2F); （3） 在mTORC2信号中断的细胞中（Sin1−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs））(Frias等人，2006年;哈辛托等人，2006年;Yang等人，2006年)在Torin 1处理后，TFEB发生了与对照细胞相似的分子量变化和核移位(图2G). 总之，这些数据表明，mTORC1而不是mTORC2通过阻止其核移位来调节TFEB。最后，在表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞中进行的联合免疫沉淀试验表明，TFEB与mTOR和mTORC1亚单位猛禽结合，但与mTORC2亚单位rictor和mSim1不结合，表明TFEB和mTORC 1在功能和物理上相互作用(图2H).

mTORC1通过S142的磷酸化控制TFEB的亚细胞定位

我们之前确定丝氨酸142的磷酸化是饥饿期间TFEB核移位的关键事件(Settembre等人，2011年). 为了测试mTORC1在S142是否磷酸化TFEB，我们生成了一种磷酸化特异性抗体，该抗体仅在S142磷酸化时识别TFEB。该抗体在过度表达S142A突变型TFEB的细胞中未检测到信号，从而证实了其特异性(补充图S3). 使用该抗体，我们观察到在稳定过表达TFEB–3×FLAG并在营养耗尽的培养基中培养的HeLa细胞中，TFEB在S142不再磷酸化，这与我们之前的结果一致(图3A).

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图3

mTORC1在丝氨酸142处磷酸化TFEB（S142）。(A类)Torin 1诱导S142去磷酸化。按照指示处理HeLa细胞，用TFEB p-S142磷酸抗体和抗FLAG抗体探测总提取物和核提取物。饥饿或Torin 1处理后TFEB S142磷酸化的消失与TFEB在核部分中的积累相关。(B)mTORC1型体外激酶分析。高纯度FLAG–S6K1、TFEB–3×FLAG或TFEB^S142A系列–3×FLAG与不含激酶的放射性标记ATP、纯化的mTORC1或mTORC1+Torin 1孵育，并通过放射自显影分析。下面板显示底物的FLAG免疫印迹。(C类)TFEB蛋白结构与预测的mTORC1磷酸化位点及其在脊椎动物中的保守性的示意图。编号依据人类亚型1。(天)磷酸位点的序列保守性得分以及mTOR共有基序和TFEB磷酸位点周围序列之间的定量一致性。(E类)S142和S211规定了TFEB定位。表达丝氨酸-丙氨酸突变型TFEB–3×FLAG的HeLa细胞的FLAG免疫染色（红色）。细胞核用DAPI（蓝色）染色。值是包含至少50个转染细胞的五个字段的平均值。学生的t吨-测试（未配对）^***P（P）<0.001. 比例尺代表30μm。

随后，我们分析了补充有或没有Torin 1或Rapamycin的正常培养基的饥饿细胞中S142磷酸化水平。虽然Torin 1明显减弱了营养素诱导的S142磷酸化，但雷帕霉素没有，这表明S142代表了雷帕霉素耐药的mTORC1位点(图3A). 事实上，mTOR激酶分析显示mTORC1磷酸化高度纯化的TFEB在体外与其他已知的mTORC1底物具有可比的效率，并且当mTORC2与S142A突变型TFEB孵育时，这种磷酸化显著下降(图3B). 这些结果清楚地表明，TFEB是mTOR底物，S142是mTOR磷酸化TFEB的关键残基。

最近的研究表明，mTORC1在多个位点磷酸化其靶蛋白(Hsu等人，2011年;Peterson等人，2011年;Yu等人，2011年). 为了识别可能被mTOR磷酸化的其他丝氨酸残基，我们搜索了mTORC1的共有磷酸受体基序(Hsu等人，2011年)在TFEB的编码序列中(图3C和D).

我们将所有被认为是mTORC1靶点的TFEB氨基酸残基突变为丙氨酸。然后我们测试了每个突变对TFEB亚细胞定位的影响，发现与S142A类似，211位（S211A）的丝氨酸-丙氨酸突变导致TFEB的组成性核定位(图3E). 其他丝氨酸残基的突变体表现出与野生型TFEB相似的行为(图3E;补充图S4;Settembre等人，2011年). 总之，这些数据表明，除S142外，S211还在控制TFEB亚细胞定位中发挥作用，并表明S211代表mTORC1的另一个靶位点。

mTORC1和TFEB在溶酶体表面相互作用

根据TFEB是mTORC1的底物的观察(图3A和B)这两种蛋白质在物理上相互作用(图2H)，我们测试了TFEB和mTORC1的相互作用是否发生在溶酶体膜上。对表达TFEB–GFP的HeLa细胞的仔细检查表明，在正常生长条件下，大多数细胞显示出以细胞质为主的TFEB定位，而一部分细胞显示出清晰可辨的细胞内TFEB-GFP荧光斑点，表明存在溶酶体定位(补充图S5). 这些观察结果在瞬时表达TFEB–GFP和晚期内体/溶酶体标记物mRFP–Rab7的MEF中得到证实(图4A). 在一组细胞中，TFEB–GFP明显与mRFP–Rab7阳性溶酶体共定位，并且随着溶酶体在细胞内流动，这种关联会持续一段时间(图4A和B;补充电影S1).

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图4

mTORC1结合并磷酸化溶酶体表面的TFEB。(A类)共表达TFEB–GFP和mRFP–Rab7的MEF细胞的旋转盘共焦图像（合并中分别为绿色和红色）。(B)年装箱区TFEB-和Rab7-阳性溶酶体的时间推移(A类). 时间间隔以秒为单位。(C类)表达TFEB–GFP的MEF细胞Torin 1治疗的时间推移分析。箭头表示添加Torin 1的时间。黄色箭头表示Torin 1诱导的TFEB–GFP溶酶体积累。时间间隔以分钟为单位。(天)二甲基亚砜处理后表达TFEB–3×FLAG的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或Torin1(底部)并用FLAG和mTOR抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(E类)对来自对照MEF（蓝色）或经Torin 1处理的MEF（红色）的TFEB–GFP阳性溶酶体进行FRAP分析。每个数据点代表五个独立点的平均值±标准差。(F类)对照处理MEF中TFEB–GFP阳性溶酶体光漂白和荧光恢复的时间进程(顶部)或用Torin 1处理的MEF(底部). 红色箭头表示光漂白时间。时间间隔以秒为单位。(G公司)Torin 1增加TFEB与mTORC1的结合。表达TFEB–3×FLAG以及HAGST-Rap2A或HAGST-Rags的HEK-293T细胞^{DN（公称直径）}用载体或Torin1处理，裂解并进行FLAG免疫沉淀，然后进行mTOR和猛禽的免疫印迹。FLAG–Metap2作为阴性对照。(H（H）)表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(顶部)或碎布^{DN（公称直径）}突变体(底部)用Torin 1处理，并用FLAG和LAMP2抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。在所有图像中，比例尺代表10μm。

我们推断，TFEB在溶酶体的部分定位可能是由于与mTORC1的短暂结合，然后是mTORC1-依赖性磷酸化和TFEB向细胞质的移位。为了验证这一想法，我们用Torin 1处理TFEB–GFP HeLa细胞，作为将TFEB的结合态“陷阱”到非活性mTORC1的一种方法。证实了我们的假设，Torin 1在溶酶体上引起了TFEB–GFP的大量和显著积累(补充图S5). 类似地，Torin 1对MEFs的治疗导致TFEB–GFP在给药几分钟内在溶酶体上的时间依赖性积累，随后逐渐积累到细胞核中(图4C;补充电影S2和第3章). 有趣的是，我们还注意到，与未经处理的细胞相比，Torin 1处理导致溶酶体上内源性mTOR的显著积累(图4D). 因此，两种机制有助于在Torin 1处理后TFEB在溶酶体上聚集：（1）将mTORC1-TFEB复合物捕获在非活性状态，（2）增加与溶酶体表面结合的mTORC1数量。非活性mTORC1在溶酶体表面的积累可能反映了一种反馈机制，通过其激酶活性mTORC调节其自身对溶酶体膜的靶向(Zoncu等人，2011年b).

为了动态定量地研究TFEB溶酶体捕获，我们对TFEB–GFP阳性溶酶体进行了光漂白后荧光恢复（FRAP）实验(图4E和F;补充电影S4). 在对照细胞中，TFEB–GFP阳性溶酶体的光漂白后，快速(t吨^1/2=0.35 min）和初始荧光的实质性（60%）恢复。相反，在经Torin 1处理的细胞中，TFEB–GFP阳性溶酶体更加突出且数量众多，荧光恢复较慢(t吨^1/2=0.57 min）和更小（初始荧光回收率30%）。因此，大部分TFEB通过与非活性mTORC1结合而被捕获到溶酶体表面，并且不再能够与细胞质交换。

总之，这些数据表明，TFEB和mTORC1在溶酶体表面上相互结合，在那里发生了TFEB的磷酸化。

mTORC1通过Rag GTPases调节TFEB

TFEB受mTORC1调控的观察促使我们确定Rag GTPases的激活状态是否在控制TFEB亚细胞定位中起作用，Rag GTPases与v-ATP酶一起通过氨基酸介导mTORCl激活。Rags的点突变体是可用的，它完全模拟氨基酸的存在（“Rags^{加利福尼亚州}'）或他们的缺席（'拉格^{DN（公称直径）}’) (Sancak等人，2008年). 我们利用这些突变体直接测试将TFEB隔离到溶酶体中对mTORC1的需求，并询问Rags^{DN（公称直径）}导致溶酶体表面mTORC1缺失的突变体(Sancak等人，2010年)，能够抑制Torin 1诱导的TFEB溶酶体积累以及TFEB-mTORC1结合。在联合免疫沉淀分析中，Torin 1明显增强了猛禽和mTOR与TFEB–3×FLAG的结合(图4G). 然而，Rags的共同表达^{DN（公称直径）}突变体将对照细胞和Torin 1处理细胞中TFEB–3×FLAG与mTORC1组分的结合降低到背景水平(图4G). 与这些结果一致，HEK-293T共表达TFEB–3×FLAG和Rags的免疫荧光实验^{DN（公称直径）}突变体显示，经Torin 1处理后，TFEB未能在溶酶体上聚集(图4H). 总之，这些数据强烈表明，TFEB和mTORC1只有在溶酶体表面发现时才会相互作用。

接下来，我们测试Rags的激活状态是否控制TFEB核转位。在共表达TFEB–3×FLAG和对照小GTPase（Rap2A）的HEK-293T细胞中，氨基酸缺失导致TFEB大量移位至细胞核(图5A和D)，如前所述(Settembre等人，2011年). 与mTORC1再激活一致，用氨基酸对饥饿的细胞进行短暂（20分钟）的再刺激，将TFEB从大多数细胞的细胞核中排出(图5A). 相反，在同时表达TFEB–3×FLAG和Rags的细胞中^{加利福尼亚州}突变体，TFEB定位始终是完全细胞质的，与细胞的营养状态无关(图5B和D). 最后，在同时表达TFEB和Rags的细胞中^{DN（公称直径）}突变体TFEB几乎只存在于细胞核中，在氨基酸刺激下不会移位到细胞质(图5C和D). 因此，Rags的激活状态完全凌驾于细胞的营养状态之上，足以确定TFEB的定位。

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图5

Rag GTPases控制TFEB亚细胞定位。(A类–C类)表达TFEB–3×FLAG以及对照GTPase或指示Rag突变体的HEK-293T细胞的免疫荧光。细胞被剥夺了氨基酸(顶部)或者被剥夺然后被刺激(底部)用于指示的时间，并为FLAG和mTOR染色（合并中分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(天)量化每种情况下带有核TFEB的细胞数量(A类–C类). (E类,F类)表达TFEB–3×FLAG和Rap2A的HEK-293T细胞的免疫荧光(E类)或碎布^{加利福尼亚州}突变体(F类)进行指示的治疗，并用FLAG和mTOR抗体染色（合并处分别为绿色和红色；DAPI为蓝色）。(G公司)DMSO和CQ处理的场中带有核TFEB的细胞数量的量化(E类)和(F类). 在所有字段中，比例尺代表10μm。在所有直方图中，每个值代表三个独立字段的平均值±标准差N个=300.

之前的研究表明，Rags^{加利福尼亚州}挽救不同溶酶体应激源对mTORC1激活的抑制作用(Zoncu等人，2011年a). 因此，我们问Rags^{加利福尼亚州}突变体能够阻止这些应激源促进的TFEB核移位(图1A–D和​和5E）。第五版). 在同时表达TFEB–3×FLAG和Rags的细胞中^{加利福尼亚州}突变体，经氯喹和SalA处理后TFEB完全保持细胞质(图5F和G)而绝大多数表达对照GTPase的细胞都是核细胞，并且接受同样的药物治疗(图5E和G). 重要的是，联合表达TFEB–GFP和Rag的细胞的治疗^{加利福尼亚州}Torin 1恢复了Rag^{加利福尼亚州}-诱导TFEB的细胞质定位并将TFEB大量驱动至细胞核，进一步证明Rag突变体对TFEB所起的作用是由mTORC1介导的(补充图S6).

总之，这些结果表明，TFEB定位是通过Rag GTPases的激活状态由氨基酸-mTORC1信号通路直接调节的。

生成Tcfeb公司flox鼠标线

我们使用了公开的胚胎干细胞克隆(网址：http://www.eucomm.org/)其中Tcfeb公司通过外显子4和5的同源重组进行靶向性。将重组ES细胞克隆注射到囊胚中，用于生成携带工程等位基因的小鼠系。将Flox/Flox小鼠与在Jackson实验室获得的白蛋白启动子（ALB-CRE）下表达CRE的转基因株系杂交，产生了肝特异性KO。所有涉及小鼠的程序都得到了贝勒医学院动物护理和使用委员会的批准。

质粒和细胞转染

用DNA质粒pRK5-mycPAT1、pRK5-HAGST-Rap2A、pRK-5-HAGST-RagB及其Q99L（CA）和T54N（DN）突变体、pRKW-HAGST-RagD及其Q121L（DN）和S77L（CA”突变体瞬时转染细胞；pTFEB-GFP和pCMV-TFEB-3×FLAG，根据制造商的协议使用脂质体2000或LTX（Invitrogen）。根据制造商说明（Stratagene）进行定点突变，通过测序验证正确的突变。

药物和细胞治疗

使用了以下药物：西格玛公司的雷帕霉素（2.5μM，另有说明）；来自Biomarine的Torin 1和Torin 2（250 nM，另有说明）；来自Cell Signaling Technology的U0126（50μM）；来自Sigma的氯喹（100μM）；水杨酸甲酰胺A（2μM）是Jeff De Brabander（犹他州西南部）赠送的一份礼物。

免疫印迹和抗体

小鼠抗TFEB单克隆抗体购自My Biosource目录号MBS120432。为了产生抗pS142特异性抗体，用以下与KLH偶联的肽免疫兔子：AGNSAPN{pSer}PMAMLHIC。第四次免疫后，处死兔子并收集血清。通过含有非磷酸化抗原的柱循环，从血清中清除非磷酸化抗体。接下来使用含有磷酸化肽的柱对磷酸化抗体进行亲和纯化。

用含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂（Sigma）的M-PER缓冲液（Thermo）溶解细胞；如前所述分离核/细胞溶质部分(Settembre等人，2011年). 蛋白质通过SDS–PAGE（Invitrogen；还原NuPAGE 4–12%双三凝胶，MES SDS缓冲液）分离。如果需要，在室温下使用20 ml帝国蛋白染色剂（Thermo Fisher）对凝胶染色1 h，并用水进行脱色。通过使用I-Blot（Invitrogen）将蛋白质转移到硝化纤维素膜上进行免疫印迹分析。在TBS-T缓冲液（TBS含有0.05%吐温-20）中用5%的非脂肪乳封闭膜，并在室温下用一级抗体抗FLAG和抗TUBULIN（Sigma；1:2000）、抗H3（Cell Signaling；1:10000）孵育2小时，而以下抗体在5%BSA中孵育为ON：抗TFEB（My Biosource；1:1000），抗P TFEB（1:1000）ERK1/2、P-ERK1/2、P-P70S6K、P70S6K（细胞信号传导；1:1000）。

用TBS-T缓冲液清洗膜三次，并在室温下用碱性磷酸酶结合IgG（Promega；0.2 mg/ml）孵育1 h。用TBS缓冲液清洗薄膜三次，通过添加10 ml Western Blue®稳定底物（Promeca）观察表达的蛋白质。

柠檬酸激酶分析

FLAG–S6K1、TFEB–3×FLAG和TFEB^S142A系列从用250 nM Torin 1处理1 h的瞬时转染HEK-293T细胞中纯化–3×FLAG，并在RIPA裂解缓冲液中进行裂解。将清除的裂解物与FLAG亲和珠（Sigma）孵育2 h，在含有500 mM NaCl的RIPA中洗涤4次，并使用竞争的FLAG肽在4℃洗脱1 h。利用FLAG亲和珠从稳定表达FLAG raptor的HEK-293T细胞中纯化出mTORC1。

在添加ATP之前，激酶分析在4°C下预培养10分钟，然后在30°C下在最终体积为25μl的激酶缓冲液中培养30分钟（25 mM HEPES，pH 7.4，50 mM KCl，10 mM MgCl₂)活性mTORC1，250–500 nM底物，50μM ATP，1μCi[γ-32P]ATP，当指示为250 nM Torin 1时。通过添加6μl样品缓冲液停止反应，煮沸5分钟，然后通过SDS-PAGE进行分析，然后进行放射自显影。

免疫沉淀分析

表达FLAG标记蛋白的HEK-293T细胞用冰镇PBS冲洗一次，并在冰镇裂解缓冲液中溶解（150 mM NaCl，40 mM HEPES（pH 7.4），2 mM EGTA，2.5 mM MgCl₂0.3%CHAPS和每25 ml一片不含EDTA的蛋白酶抑制剂（罗氏））。通过在微型离心机中以13000转/分的速度离心10分钟，从细胞裂解液中分离出可溶性组分。对于免疫沉淀，将35μl 50%的抗FLAG亲和凝胶（Sigma）浆液添加到每个裂解液中，并在4°C下旋转培养2-3小时。免疫沉淀物用裂解缓冲液洗涤三次。通过添加35μl样品缓冲液并煮沸5分钟，使免疫沉淀蛋白变性，用8–16%SDS–PAGE溶解，并用免疫印迹法分析。

HEK-293T细胞的免疫荧光分析

在35 mm组织培养皿中，将HEK-293T细胞以30万个细胞/皿的速度涂布在涂有纤维连接蛋白的玻璃盖玻片上。总之，12–16小时后，用100 ng TFEB–3×FLAG以及200 ng Rap2A或Rag GTPase突变体转染细胞。第二天，对细胞进行药物处理或饥饿处理，用PBS冲洗一次，然后用4%多聚甲醛在室温下的PBS中固定15分钟。用PBS清洗载玻片两次，用0.05%Triton X-100在PBS中渗透细胞5分钟，将载玻片与5%正常驴血清中的一级抗体在室温下孵育1h，用PBS冲洗四次，与驴产生的二级抗体（在5%正常驴血中稀释1:1000）在室温下在黑暗中孵育45min，再用PBS洗涤四次。使用Vectashield（Vector Laboratories）将载玻片安装在玻璃盖玻片上，并在旋转圆盘共焦系统（Perkin-Elmer）上成像。

高含量核易位分析

将TFEB–GFP细胞接种在384孔板中，孵育12小时，并用10种不同浓度的ERK抑制剂U0126（Sigma-Aldrich）和mTOR抑制剂雷帕霉素（Sigma-Aldrich）、Torin 1（Biomarin）和Torin 2（Biomarin）处理，范围从2.54 nM到50μM。在37°C的RPMI培养基中培养3h后，对细胞进行清洗、固定，并用DAPI染色。为了获取图像，使用共焦自动显微镜（Opera高内容系统；Perkin-Elmer）对384孔板的每个孔拍摄了10张照片。开发了一个专用脚本来分析不同图像上的TFEB定位（Acapella软件；Perkin-Elmer）。该脚本计算核TFEB–GFP荧光平均强度除以TFEB-GFP荧光细胞溶质强度平均值所得的比值。在同一个平板中使用阴性（RPMI培养基）和阳性（HBSS饥饿）对照样品对结果进行标准化。使用Prism软件（GraphPad软件），数据由每种化合物在不同浓度下的核移位百分比表示。使用非线性回归拟合（Prism软件）计算每个化合物的EC50。

活细胞成像和光漂白协议

通过核转染（Lonza）用TFEB–GFP和mRFP–Rab7瞬时转染MEFs。细胞以30万个细胞/皿的密度被镀在玻璃底35 mm皿（MatTek Corp.）上。第二天，将细胞转移到生理成像缓冲液中（130 mM NaCl，5 mM KCl，2.5 mM CaCl₂，2.5 mM氯化镁₂，25 mM HEPES）补充5 mM葡萄糖，并在旋转圆盘共焦显微镜（Andor Technology）上用488-nm和561-nm激光通过×63物镜成像。为了实现单个TFEB–GFP阳性溶酶体的光漂白，在选定的点周围绘制感兴趣的区域，并开始电影采集。60秒后，使用Andor FRAPPA装置用高功率（50 mM）488 nm脉冲（100μs/像素照明）对斑点进行光漂白。

FRAP分析

使用ImageJ（美国国立卫生研究院）中定制的插件分析光漂白TFEB-GFP阳性溶酶体的荧光恢复。在要分析的斑点周围画出感兴趣的圆形区域，并在整个电影中测量这些区域内的综合荧光。将每个条件下5到10个点的荧光强度迹线归一化为初始值并对齐时间，并使用Microsoft Excel计算其平均值和标准差。使用Prism（GraphPad）绘制最终绘图和曲线拟合。

RNA提取、定量PCR和统计分析

使用TRIzol（Invitrogen）从细胞中提取总RNA。使用TaqMan逆转录试剂（Applied Biosystems）进行逆转录。此前曾报道过溶酶体和自噬基因特异性引物(Settembre等人，2011年). 使用DDCt方法计算折叠变化值。简单地说，GAPDH和环菲林被用作“正常化”基因来计算DCt值。接下来，计算“对照”组和“实验”组之间的DDCt值。最后，使用2（-DDCt）计算折叠变化。在计算折叠变化值时，将生物复制品分组。未付款T型-测试用于计算统计显著性。图中的星号表示P（P）-值<0.05。

我们感谢G Diez-Roux批判性阅读手稿，感谢S Long测试TFEB抗体；I Peluso在高含量分析中提供帮助；T Kang和C Thoreen帮助进行mTORC1激酶分析。我们感谢意大利电视马拉松基金会（CS、DM和AB）的支持；Beyond Batten疾病基金会（CS、DM、FV、SUE、TH和AB）；欧洲研究委员会高级研究员批准号250154（AB）；Dimes三月拨款#6-FY11-306（AB）；美国国立卫生研究院（R01 CA129105、R01 CA103866和R37 AI047389）的拨款以及美国老龄联合会、斯塔尔基金会、科赫研究所前沿研究计划和埃里森医学基金会对DMS的奖励，以及简·科芬儿童医学研究纪念基金会（Jane Coffin Childs Memorial Fund for Medical Research）和LAM基金会（LAM Foundation）向霍华德·休斯医学研究所（Howard Hughes Medical Institute）研究员RZ DMS提供的研究金。

作者贡献：CS、RZ、DS和AB设计了实验。CS和RZ执行了大部分实验。DM使用激酶抑制剂进行高含量筛选。FV进行了诱变分析。SE进行了生物信息分析。SU和TH提供了技术支持。MF和GK产生TFEB磷酸抗体。MV检测的TFEB抗体。心室颤动产生SIN1−/−MEF。CS、RZ和AB撰写了论文。