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.2008年8月5日；105(31):10762-7.
doi:10.1073/pnas.0805139105。 Epub 2008年7月31日。

有丝分裂磷酸化定量图谱

诺亚·德普霍尔 1, 周春水, 朱迪特·维伦, 肖恩·博索利尔, 科里·E·巴卡拉斯基, 斯蒂芬·J·埃尔奇, 史蒂文·普·吉吉
附属公司

有丝分裂磷酸化定量图谱

诺亚·德普霍尔等。 美国国家科学院程序. .

摘要

真核细胞分裂周期的特征是一系列有序且高度调控的事件，导致所有细胞物质复制并分离为两个新形成的子细胞。细胞周期蛋白依赖性激酶（CDKs）的蛋白质磷酸化驱动这个循环。为了进一步了解磷酸化如何调节细胞周期，我们试图鉴定磷酸化受细胞周期调节的蛋白质。使用稳定同位素标记以及磷酸肽富集的两步策略和高质量精度质谱，我们检测了在细胞周期的G（1）和有丝分裂期阻滞的人类细胞系中的蛋白质磷酸化。我们报告了超过14000个不同磷酸化事件的鉴定，据我们所知，其中一半以上的事件以及大多数这些位点的相对定量数据在文献中没有描述。我们观察到有丝分裂过程中有超过1000个蛋白磷酸化增加，包括许多已知的细胞周期调节因子。受调控磷酸肽上的大多数位点位于[S/T]P基序，这是CDK所需的最小序列，表明许多蛋白质可能是CDK底物。对非脯氨酸位点磷酸肽的分析确定了两个独特的基序，表明至少存在两个未发现的有丝分裂激酶。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

图1。
图1。
定量细胞周期磷蛋白组分析的样品制备和数据分析。异步HeLa细胞在含有13C类615N个2-赖氨酸和13C类615N个4-精氨酸，裂解，并与双胸苷或诺卡唑的裂解产物按细胞数1:1混合，将细胞在标准培养基中培养并用胰蛋白酶在溶液中消化。对每个实验中的肽进行强阳离子交换色谱，并在每次运行中收集12个部分的洗脱液。用IMAC和TiO分离并富集每个组分的磷酸肽2富集洗脱液按分数重组，并在混合线性离子阱-轨道探测器、质谱仪上进行重复分析。在进一步自动化分析之前，使用SEQUEST搜索MS/MS光谱并过滤至1%的假发现率，以确定磷酸化位点定位并进行量化。过滤后的数据集包含68379个磷酸肽，错误发现率为0.3%。这些肽含有14265个独特的磷酸化位点。
图2。
图2。
磷酸肽丰度分布。(A类和B类)日志2-G中所有定量磷酸肽的转化轻：重（滞留：异步）比率1(A类)和M(B类)细胞停滞期。垃圾箱宽0.5个单位；例如，“0”箱从−0.25延伸至+0.25。(插图)显示了每个实验中未磷酸化肽的分布。(C类)变化≥2.5倍的肽被认为是受调节的，而变化≤1.5倍的肽则不受调节。(D类和E类)日志2对于G，显示了具有不同磷酸化基序的肽的磷酸肽丰度分布1相位传感器(D类)有丝分裂细胞(E类). 磷酸化位点分为3个基序中的1个，即[pS/pT]-P、[pS/pT]-X-X-[D/E]或[K/R]-X-X-[pS/t]。缺乏这些基序的位点被分为“其他”。只有包含单个基序类别的肽被纳入分析。
图3。
图3。
基底基序发现。我们使用Motif-X（9）从有丝分裂调控肽中提取磷酸-氨基酸基序。仅Ascore≥13且丰度比中值（L:H）≥4的地点(n个=2949）。(A类)其中超过一半（1670个）的位点位于pS-P基序中。(B类和C类)我们确定了两个与有丝分裂激酶相似的基序(B类)极光激酶A和(C类)Polo-like激酶1，其一致性底物序列分别为[K/N/R]-R-X-[pS/pT]-Φ和[D/E]-X-[pS/pT]-Φ-X-[D/E]，其中Φ表示任何疏水残基。注意这两种情况下亮氨酸在+1位置的偏差。(D类和E类)我们还发现了两个显著的基序，其中包括+3的基本残基，但缺少+1脯氨酸。
图4。
图4。
蛋白质调节磷酸化（P-RePh）评分。P-RePh评分是对分配给数据集中每个蛋白质的调节磷酸化位点的累积评估。(A类)绘制了所有G的M期P-RePh评分高于给定阈值的分数1（黑色痕迹）和M期（红色痕迹）磷酸蛋白，以及GO:0000278（有丝分裂细胞周期）（绿色痕迹）注释蛋白和文献中确定的已知有丝分裂磷酸蛋白（蓝色痕迹）。(B类和C类)G中上调磷酸化的整个蛋白质组地形图1(B类)和M相(C类)单元格。人类蛋白质组中的每个蛋白质都表示为连续138×138平面上的一个点。P-RePh分数显示在z（z）轴。绘图比例相同，最大P-RePh为500。有丝分裂图中的剪切峰对应于Ki-67（P-RePh=1103）。
图5。
图5。
有丝分裂磷酸化和人类蛋白质相互作用网络。显示了Polo-like kinase 1的第一邻人类蛋白质相互关系网络（41）。在我们的有丝分裂数据集中发现黄色节点磷酸化。每个节的大小与其有丝分裂P-RePh评分相对应，较大的节在有丝分裂中被磷酸化程度更高。具有重黑色边界的节点也包含受调控的候选Plk1位点。Cdc2、AurkA和AurkB的其他网络如所示图S4.
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