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分子生物学细胞。2010年11月15日；21(22): 3998–4008.
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预防性维修识别码：项目经理2982105
PMID：20861302

高尔基体-内体系统向酵母自噬体的膜递送

大桥洋平和肖恩·蒙罗通讯作者
本杰明·格利克，监控编辑器
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

完整的膜蛋白Atg9被输送到酵母和哺乳动物细胞中的自噬体。我们发现，Atg9并非来源于线粒体，不能直接从内质网到达自噬体。相反，Golgi-endosomal交通成分的成对突变组合会导致饥饿时Atg9传递的缺陷。

摘要

虽然自噬所需的许多蛋白质已被鉴定，但自噬体膜的来源仍未确定，内质网（ER）、内体和线粒体均已被激活。完整的膜蛋白Atg9在饥饿期间被传递到自噬体，并在酵母中组成的相关细胞质-空泡（Cvt）途径中被传递。我们检查了将含有Atg9的膜传递到酵母自噬体的要求。Atg9似乎并非来源于线粒体，并且Atg9不能直接从内质网或早期高尔基体到达形成的自噬体。已知高尔基体和内体之间的交通成分是Cvt途径所必需的，但在饥饿细胞中似乎不需要自噬。然而，我们发现，高尔基体内体交通成分的突变的成对组合，显然仅是Cvt途径所需的，可能会导致饥饿细胞中Atg9递送和自噬的严重缺陷。因此，含有Atg9的膜似乎是从Golgi-endosomal系统而不是从ER或线粒体传递到自噬体的。这被单个突变体的检测低估了，为酵母和哺乳动物对Atg9定位和自噬小体形成的研究之间的差异提供了可能的解释。

简介

自噬允许真核细胞通过包裹在双层膜中形成自噬体，然后与溶解的细胞器融合进行消化，从而回收蛋白质和细胞器。自噬最初被确定为对饥饿的反应，现已被发现参与许多重要的生物过程，包括病原体和细胞质聚集体的清除、脂质储存的动员和组织的重塑(鲁宾斯泰因等。, 2007;谢和克林斯基，2007年;法雷等。, 2009). 通过筛选影响饥饿诱导的自噬的酵母突变或正常生长期间向液泡输送寡聚酶的相关Cvt途径，已经确定了形成自噬体所需的蛋白质(Tsukada和Ohsumi，1993年;图姆等。, 1994;哈丁等。1995年;中川县等。, 2009). 然而，自噬体双层膜的起源还不太清楚(Juhasz和Neufeld，2006年;Longatti和Tooze，2009年). 有人认为，膜可以从内质网（ER）延伸出来，包裹消化靶点，或者自噬体可以通过输送从线粒体或内体等其他细胞器中萌发的囊泡载体而生长(雷焦里等。，2004年b;斧头等。, 2008;Hayashi-Nishino先生等。, 2009;Ylä-安蒂拉等。, 2009;海利等。, 2010).

在酵母和哺乳动物中形成的自噬体上发现了一种完整的膜蛋白Atg9(冗长的等。2000年;野田佳彦等。2000年;年轻等。, 2006)因为它有六个跨膜结构域，所以它的传递必须伴随着膜的传递。在酵母中，Atg9存在于形成自噬体和被认为是线粒体的外围位点(雷焦里等。，2004年a;他等。, 2006;雷吉奥里和克林斯基，2006年). 酵母Atg9似乎在形成的自噬体和外周位点之间循环，但这些位点的确切性质和Atg9的膜转运途径尚不清楚。自噬所需蛋白质的遗传筛选只发现了膜交通的几个已知成分，这些是典型的蛋白质，如SNARE Vam3，作用于液泡，以介导与完整的自噬体融合(达尔索等。, 1997). 已发现相关的Cvt通路需要参与高尔基体和内体之间交通的几种蛋白质，包括SNARE Tlg2、GARP/VFT系留复合物、分选连接蛋白Atg20和Atg24以及TRAPP亚基Gsg1/Trs85(阿贝利奥维奇等。, 1999;不错等。, 2002;雷焦里等。, 2003;梅岭-韦斯等。, 2005). 然而，这些蛋白质不是大量自噬所必需的，因此与饥饿期间向自噬体传递膜无关(Juhasz和Neufeld，2006年). 在哺乳动物细胞中，Atg9存在于TGN和内体系统中，并被提议从构成该系统的一个或多个隔间传递到形成的自噬体(年轻等。, 2006;拉济等。, 2009). 然而，这种自噬体膜的来源似乎缺乏酵母研究的支持，因为在Golgi-endosomal系统中调节交通的成分只需要用于Cvt途径。

我们已经检查了Atg9的贩运，以进一步了解饥饿期间细胞膜到达形成自噬体的途径。抑制Atg9对内质网和早期高尔基体的作用表明，它必须移动到内膜系统的后期才能到达自噬体并发挥其功能。对一系列膜交通成分的检查表明，SNARE Gos1是高尔基体交通的另一个组成部分，是Cvt途径所必需的，但与之前发现的一样，它似乎不需要用于饥饿诱导的自噬。然而，我们发现，似乎只影响Cvt途径的组合突变会导致饥饿细胞自噬的深度协同缺陷。这表明在酵母中，Golgi-endosome系统，而不是ER或线粒体，为形成自噬体提供了含有Atg9的膜。

材料和方法

酵母菌株和质粒

酵母菌株基于BY4741（MATa他的3Δ1列2Δ0米15Δ0乌拉3Δ0)，所有单缺失菌株均为BY4741背景，并从Open Biosystems（AL Huntsville，AL）获得。使用KanMX或S.pombe HIS5号机组标记物和荧光标记物RFP-APE1,ATG9-GFP公司,RFP-SCS2,樱桃-TLG1、和TOM20-RFP协议是通过同源重组引入的[RFP是TagRFP（Evrogen，Moscow，Russia）或tdTomato(坎贝尔等。, 2002)如补充表S1]所示。在TPI1型启动子构建如下：自动液位计9发起人-TPI1型发起人-自动液位计9-pBluescriptII（KS-）中的EGFP-NatMX（补充表S2）。利用ATG9启动子区中的独特XbaI位点进行同源重组。携带这种结构的菌株显示出Atg9-EGFP的分布与前面描述的相似(势喜门等。, 2009). 对于GFP-Atg8和ALP分析，携带EGFP-ATG9-MYC、KKXX和RxR的整合质粒是通过在TPI1型pYOintF8的启动子和NatMX，并通过atg9启动子中的同源重组导入Δatg9基因组。

酵母生长与蛋白质提取

YEPD（1.1%酵母提取物、2.2%杆菌肽、2%葡萄糖和0.0055%硫酸腺嘌呤）或-URA培养基用于营养期生长。对于氮饥饿，将YEPD或-URA中的过夜培养物稀释1/50，并在30°C下在YEPD和-URA培养基中生长至早期对数阶段，然后在氮饥饿培养基（SD-N，0.17%酵母氮碱，缺乏硫酸铵和2%葡萄糖的氨基酸）中重新悬浮，并培养4小时。对于蛋白质提取，5 OD600收集细胞，并将其重新悬浮在100 ml样品缓冲液中，使用均质器（FastPrep-24，MP Biomedicals，Aurora，OH，45 s，强度6.5）用等体积的玻璃珠打碎。免疫印迹是用抗Ape1（Dan Klinsky，密歇根大学）、兔抗GFP或抗FLAG（Sigma-Aldrich，St.Louis，MO，A-8592）进行的。如前所述执行CPY脉冲相位(萨珀斯坦等。, 1996)，使用抗CPY（Rockland，Gilbertsville，PA 100-401-135）。

碱性磷酸酶测定

如前所述，使用细胞溶质形式的Pho8（Pho8Δ60）对自噬进行磷酸酶分析(Noda和Ohsumi，1998年). 简言之，1–2×107通过离心收集细胞，用水冲洗，并将其重新悬浮在0.2 ml的分析缓冲液中（250 mM Tris-HCl（pH 9.0），10 mM MgSO4，10μM硫酸锌4)和玻璃珠漩涡。离心后，将50μl上清液转移到0.5 ml分析缓冲液中。添加50微升55 mMα-磷酸萘酯（Sigma）以开始反应，在30°C培养后，通过添加0.5 ml 2 M甘氨酸-NaOH（pH 11.0）停止反应。在345nm激发后472nm处的荧光发射用荧光计测量（加利福尼亚州福斯特市佩金-埃尔默）。一个单位是1μmolα-萘酚/min/mg蛋白质的释放。使用Bradford方法测量蛋白质浓度（Bio-Rad，Hercules，CA）。

酵母菌株的显微镜检查

使用CCD相机（CoolSNAP-HQ2，Roper Scientific，Tucson，AZ）以及RFP和GFP过滤器（Chroma Technology，Rockingham，UT），在尼康Eclipse TE2000外荧光显微镜上用100×1.49 NA物镜拍摄表达荧光融合蛋白的细胞。使用MetaMorph和ImageJ获取和分析图像，并使用Adobe Photoshop调整图像的级别。对于FM4-64，标记细胞在8μM FM4-64（Molecular Probes，Eugene，OR）中于30°C孵育，洗涤两次，并在缺乏FM4-64的培养基中于30°C孵育，时间如图图例所示。

结果

Atg9可以保留在ER和高尔基早期

为了研究Atg9是否可以通过直接从内质网传递膜到达自噬体，我们试图创造一种定位于该细胞器的蛋白质。RXR和KKXX基序都通过引导从顺式-COPI包被囊泡中的高尔基体。Atg9的C端细胞质尾部相对较长（约250个残基），尽管COPI外壳对KKXX信号的识别因与膜的分离增加而减少，但RXR的识别显然与距离无关(Shikano和Li，2003年). Atg9通常存在于形成的自噬体和周围的小结构池中(他等。, 2006;雷吉奥里和克林斯基，2006年). 当Atg9在其C末端用RXR基序表达时，它反而在内质网和一些额外的点中积累，这可能反映了循环通过顺式高尔基(图1A） ●●●●。为了检查向自噬体的传递，我们比较了GFP-Atg9和氨肽酶1（Ape1）。Ape1在细胞质中形成低聚物，在正常生长条件下通过Cvt途径和饥饿时通过大量自噬直接传递到液泡(哈丁等。1995年). 在这两种情况下，Ape1聚集体都与自噬体的形成有关(真谷等。, 2002). 与RFP-Ape1的比较表明，添加RXR抑制了Atg9-GFP向Ape1聚集体的传递(图1B类；95%的RFP-Ape1结构用GFP-Atg9标记，而8%的RFP-Atg9-RXR标记，n=100）。正如预期的那样，Atg9细胞质尾部太长，无法识别C末端的KKXX基序。然而，当尾部被截断到只有38个残基时，Atg9保留了一些功能(他等。, 2008)当KKXX基序连接到C末端时，发现该截断形式被重新定位到ER（补充图S1A）。

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Atg9不能直接从内质网到达形成的自噬体。（A） 表达GFP-Atg9的酵母的荧光显微照片，带有C末端myc标签，后面没有或有RXR基序[KLRRRRI(米歇尔森等。, 2007)]. 融合用来自着丝粒载体的TPI1启动子表达，细胞也表达RFP-Ape1或ER蛋白RFP-Scs2。RXR基序增加了内质网中Atg9的量，并减少了mRFP-Ape1聚集体中存在的Atg9的量。比例尺=2μm。（B） 野生型细胞或自动液位计9缺失菌株用空质粒或A中显示的相同GFP-Atg9质粒转化，也用C末端myc-tag后跟KKXX基序（SKKSL）的质粒转化。细胞在富培养基中生长后或氮饥饿四小时后收获，以诱导自噬。在这两种条件下，RXR基序与Atg9的连接都会阻断其活性。（C） 表达GFP-Atg8的细胞裂解物的抗-GFP免疫印迹自动液位计8CEN质粒上的启动子。酵母菌株如A和B中所示，但带有自动液位计9融合到基因组中。细胞生长到中期，收获（0）或饥饿氮气4小时。Atg9的缺失会阻止GFP-Atg8传递到液泡并释放游离GFP。（D） 表达胞浆形式Pho8（Pho8Δ60）的菌株的碱性磷酸酶活性，该菌株缺乏跨膜结构域，因此只有在通过大量自噬传递到液泡时才具有活性(Noda和Ohsumi，1998年). 应变与C中相同，但具有电话13已删除和电话8截断为电话8Δ60通过积分TDH3型发起人。细胞在C中生长并饥饿4小时（误差条表示三个独立实验的SD）。

Cvt途径和自噬依赖于Atg9能够离开ER/高尔基早期

接下来我们研究了Atg9重新定位到内质网是否会导致自噬缺陷。我们最初检测了Ape1从前体（proApe1）到成熟形式的转化，成熟形式发生在自噬体融合到液泡时。GFP-Atg9在Atg9空株中拯救Ape1成熟的过程被RXR信号的附着所阻断，因此ER在富培养基和氮饥饿期间都会滞留(图1C） ●●●●。虽然正如预期的那样，全长Atg9的活性不受KKXX基序的影响，但带有38个残基尾的版本（可由KKXX重新定位到内质网）在附着该基序时也表现出活性丧失(图1B和补充图S1A）。自噬过程中缺乏对proApe1的处理可能反映了货物特有的缺陷。因此，我们检查了另外两个广泛使用的报告员，以研究饥饿诱导的自噬。第一种是从融合到蛋白Atg8的游离GFP的释放，Atg8共价连接到自噬体中的脂质，并在融合到液泡后被消化(Shintani和Klonsky，2004年). 第二种是液泡输送，因此激活了细胞溶质形式的碱性磷酸酶原(Noda和Ohsumi，1998年). 通过这两种分析，我们再次发现RXR基序阻断了GFP-Atg9在饥饿状态下允许自噬的能力(图1、C和D）。综上所述，这些结果表明Atg9通常可以进入内质网和早期高尔基体，但它必须超越早期高尔基才能到达自噬体。

Atg9的细胞内分布

内质网直接递送并不是将膜递送至形成自噬体的唯一途径。在酵母中，Atg9位于外周点和形成的自噬体中，有人认为这些点对应于线粒体(雷焦里等。，2004年a;他等。, 2006;雷吉奥里和克林斯基，2006年;日元等。, 2007). 当我们检测Atg9-GFP的分布时，我们能够检测到一些靠近线粒体的标记点，特别是在饥饿条件下(图2A） ●●●●。然而，当线粒体形态发生遗传改变时，Atg9-GFP并没有伴随大规模重定位(图2A） ●●●●。此外，延时成像显示，Atg9-GFP点状物比线粒体更易移动，似乎正在经过它们，并且在没有线粒体的情况下也会穿过细胞的其他部分（补充视频1）。Sekito及其同事最近也报告了类似的观察结果(势喜门等。, 2009)Atg9-GFP点和线粒体的明显瞬时共定位可能与有丝分裂有关，或者仅仅反映了这两种结构都可以沿着肌动蛋白电缆移动的事实(弗雷德里克和肖，2007年;莫纳斯塔斯卡等。, 2008). 当我们将Atg9-GFP与其他细胞器标记物进行比较时，我们观察到的唯一实质性共定位是通过晚期内体钠/质子交换剂Nhx1标记的内吞区室(鲍尔斯等。2000年)，内吞荧光染料FM4-64(Vida和Emr，1995年)或SNARE Tlg1，其稳态分布主要在内体中，在内体和高尔基体之间循环(霍特威斯等。1998年) (图2、B和C）。这种共定位是在缺乏Atg11的情况下维持的，而Atg11是形成自噬体所必需的，而不是Atg9的外周池(图2C） 在多泡体形成蛋白Vps4的缺失所诱导的扩大内胚体中也可见(图2C） ●●●●。这些结果表明，Atg9通过高尔基体运输，然后驻留在形成的自噬体中，至少部分驻留在内吞小室中，而不是线粒体中。

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Atg9-GFP的细胞内分布。（A） 如图所示，在野生型细胞或缺乏线粒体融合蛋白Ugo1的细胞中，比较Atg9-GFP和线粒体外膜标记Tom20-RFP的荧光显微照片，这些细胞生长在YEPD中，或饥饿四小时[SD（-N）]。Ugo1的丢失导致线粒体形成碎片团块(Sesaki和Jensen，2001年)但Atg9-GFP仍然分散，仅偶尔观察到共定位，通常在形成芽时。（B） 荧光显微照片，将Atg9-GFP与富含培养基的野生型细胞中的晚期高尔基体蛋白Sec7-RFP或晚期内体蛋白Nhx1-RFP进行比较。（C） 在富含培养基的野生型细胞中比较Atg9-GFP与RFP-Ape1、内吞示踪剂FM4-64（10分钟脉冲，10分钟追踪）或mCherry-Tlg1（Chry-Tlg1）的荧光显微照片。（D） 至于C，除了细胞缺乏自噬体支架蛋白Atg11外，Atg11是细胞膜在自噬体内积聚所必需的(Shintani和Klonsky，2004年)或缺乏内吞室膨胀的内吞体蛋白Vps4(巴斯特等。, 1997).

SNARE对Cvt通路和自噬的需求分析

为了进一步了解含有Atg9的膜到达自噬体的途径，我们寻找了自噬所需的运输成分。我们最初检测了SNARE蛋白，因为这些蛋白在内膜系统内的所有已知贩运步骤中起作用。为了全面了解SNARE蛋白在Cvt途径和自噬中的参与情况，对所有11种SNARE的单个突变体中的Ape1成熟度进行了检测，这些突变体对生存能力并不重要(图3A） ●●●●。如前所述，介导自噬体与液泡融合的液泡SNARE Vam3和Vam7是自噬和Cvt途径所必需的(图3A；达尔索等。, 1997). 此外，我们发现高尔基SNARE Gos1的缺失导致proApe1在富培养基中的积累，与之前报道的在Cvt途径中起作用的SNARE Tlg2的缺失相比(阿贝利奥维奇等。, 1999). 成熟Ape1的稳定性意味着，在静止期饥饿期间生成的成熟蛋白在对数期生长开始后很长时间内仍存在于液泡中，但缺乏Gos1或Tlg2菌株的GFP-Apel成像证实了未处理Ape1聚集体的积累，因此Cvt途径存在缺陷，在富介质中对数生长期间(图3B） ●●●●。然而，当饥饿诱导自噬时，Ape1处理既不需要Gos1也不需要Tlg2(图2A） ●●●●。

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高尔基SNARE和COG亚单位参与Cvt途径。（A） 在富培养基（YEPD）中生长三小时或在氮饥饿条件下生长四小时的SNARE突变体的Ape1免疫印迹分析[SD（-N）]。Vam3和Vam7参与液泡膜的融合，因此是Ape1在营养和饥饿条件下成熟所必需的。Pep12的缺失抑制了Ape1的成熟，这至少部分是因为它在液泡水解酶传递中的已知作用(贝切勒等。, 1996). 在饥饿的细胞中，在液泡内未消化的自噬体中可以看到一些GFP-Ape1（补充图1B），但在富培养基中，我们也观察到在液泡附近聚集了GFP-Ape1聚集体，因此Cvt途径中的自噬体形成也可能存在缺陷。（B） 通过荧光显微镜在指示菌株中定位GFP-Ape1。细胞在YEPD或SD（-N）中生长，并用FM4-64标记。在YEPD中，4%的野生型细胞中观察到GFP-Ape1的点状突起，但在Δatg1（31%）、Δcog8（29%）、△gos1（12%）和Δtlg2（24%）中增加。在SD（-N）中，除Δatg1外，所有菌株的GFP信号主要出现在液泡内。（C） 野生型（WT）或指示缺失突变体的Ape1免疫印迹分析。缺乏COG叶B亚单位的突变，或YPT6型或其交换因子RIC1（风险、信息、理赔及代收）仅在营养期（YEPD），Ape1成熟度降低。

COG复杂子单元有助于Cvt路径的有效运行

SNARE Tlg2和Gos1在不同的途径中起作用，将膜从内体再循环回高尔基体或高尔基体本身，并被认为参与不同的SNARE复合物(霍特威斯等。1998年;McNew公司等。1998年;帕拉蒂等。, 2002). Gos1被提议与包含两个叶A和B的八聚体COG复合体相互作用，后者叶包含四个非必需亚基（Cog5-8），似乎参与从内体再循环回高尔基体(怀特和蒙罗，2001年;安加等。, 2006). 因此，我们询问B叶亚单位中的突变体是否在Cvt通路和自噬中显示缺陷。图3C表明，在缺乏任何一种Cog5-8的突变体中，未处理的Ape1在丰富（即非保存）培养基中有少量但可复制的积累。在这些COG亚单位突变体中，GFP-Ape1聚集在细胞质中的细胞数量也增加了(图3B） ●●●●。与Δgos1突变体一样，当饥饿诱导大量自噬时，COG突变体中的proApe1积累消失(图3、B和C）。因此，Cog5-8似乎只需要在非活化条件下形成自噬体，而本文正在制备中，Klionsky及其同事报道了Cog5-8突变体对Cvt途径中Ape1加工的类似作用，但不是自噬(日元等。, 2010).

综合遗传相互作用揭示了Cvt途径成分在自噬中的作用

上述结果表明，Atg9需要通过早期高尔基体到达饥饿细胞中的自噬体，并且它似乎没有在线粒体中积聚，而是至少部分位于内体。然而，Cvt途径所需的唯一内体/高尔基体SNARE，Gos1和Tlg2，似乎不是饥饿期间自噬所需的。尽管如此，先前关于高尔基体和内体之间再循环的研究已经揭示了大量冗余，许多双突变体表现出协同作用(用钳子钳起等。, 2004;西奥拉等。, 2005;伯斯顿等。, 2009). 这似乎是由于内体和高尔基体之间存在多条路径，以及一些货物蛋白质在其正常路径缺失时使用不同路径的能力(赫特玛等。, 2003;昆尼维尔等。, 2006). 这让我们想知道，以前被认为只参与Cvt途径的高尔基体和内胚体蛋白是否也参与了自噬，但这种方式是多余的，因此只有当一种以上的蛋白质缺失时才可见。我们首先分析了缺乏SNAREs Gos1和Tlg2以及COG亚单位Cog8的菌株。不仅在单突变体中观察到的Cvt缺陷在双突变体中增强，而且现在在饥饿条件下，在Δcog8Δgos1双突变体的情况下可以清楚地看到缺陷(图4A） ●●●●。

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高尔基-内体突变的组合导致自噬缺陷。通过免疫印迹在所指示的突变体中分析YEPD和SD（-N）中的Ape1成熟。（A） 分析Δcog8和两个SNARE突变体Δgos1和Δtlg2。（B） 分析三个相关排序连接蛋白Atg20、Atg24和Snx41的Δcog8和单个突变体。（C） 两个SNARE突变体（Δgos1和Δtlg2）和两个排序连接蛋白突变体的分析。

接下来我们研究了Atg20和Atg24（Snx4）的排序关系。这些蛋白质形成异二聚体，并在从内体到高尔基体的一条通路中起作用，是Cvt途径所必需的，但不是大量自噬(不错等。, 2002;赫特玛等。, 2003). Atg24还与Atg20的近亲形成异二聚体，称为Snx41，但Atg24/Snx41复合物似乎只参与内切体到高尔基体的运输，而不是Cvt途径(赫特玛等。, 2003).图4B表明，Δcog8Δatg24双突变在自噬方面有明显缺陷，尽管任何一个单一突变都没有可检测到的缺陷。同样，将Atg20或Atg24的突变体与SNAREs Gos1或Tlg2的突变体结合起来，会导致饥饿细胞中Ape1成熟缺陷，ΔGos1ΔAtg24和ΔTlg2Δatg 24几乎完全阻断，尽管个别突变几乎没有缺陷(图4C） ●●●●。这些强表型是由于缺失基因的丢失，因为它们可以被质粒上的相关基因挽救（补充图S2）。

为了测试这些发现是否与Cvt特异性蛋白普遍相关，我们检测了一系列其他基因中的双突变体，这些基因编码内切体-高尔基体交通的组成部分，似乎对Cvt途径有贡献，但对自噬没有贡献。这些是GTPase Ypt6、其效应器GARP/VFT亚基Vps51和TRAPP亚基Gsg1（Trs85）(Siniossoglou和Pelham，2001年;雷焦里等。, 2003;梅岭-韦斯等。, 2005;林奇日等。, 2010). 我们还检测了Cvt通路所需的PtdIns（3）P结合蛋白Atg21，但没有报道其在交通中的作用(克里克等。, 2008). 在每一种情况下，将这些蛋白的突变与连接蛋白亚基分类的突变结合起来，都会再次导致自噬的协同缺陷(图5).

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Cvt途径突变的组合会导致自噬缺陷。通过免疫印迹在所指示的突变体中分析YEPD和SD（-N）中的Ape1成熟。（A） 缺乏GARP/VFT亚基Vps51或招募GARP/VFT的Ypt6的突变体的分析，以及分选连接蛋白（Δatg20和Δatg24）。（B） Cvt组分Atg21和排序连接蛋白（Δatg20和Δatg 24）突变分析。（C） TRAPP亚单位Gsg1的突变体分析和Atg24的分选。

Cvt通路成分的双突变体对其他自噬检测的影响

为了证实上述Cvt途径成分组合对饥饿诱导的自噬的协同作用并不局限于Ape1处理，我们用其他自噬分析测试了一些突变组合。强协同组合Δgos1Δatg24和Δtlg2Δatg 24在GFP-Atg8处理试验和Pho8Δ60空泡活化试验中均显示出单一突变体所未见的阻滞(图6、A和B）。此外，GFP-Atg8在双突变体的胞浆中积累了不止一个点(图6，C和D），一种与自噬体形成缺陷相关的表型(雷焦里等。，2004年b;梅岭-韦斯等。, 2005;日元等。, 2010).

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Golgi-endosomal组分中的组合突变体在饥饿诱导的自噬中表现出协同缺陷。（A） 表达GFP-Atg8的指示菌株的抗-GFP免疫印迹。细胞在没有尿嘧啶（富培养基）的情况下生长到生长中期，然后收获或转移到饥饿条件下4小时（SD-N）。GFP-Atg8的位置和自噬输送到液泡后释放的游离GFP的位置都被显示出来。（B） 所示表达Pho8Δ60的菌株中的碱性磷酸酶活性缺乏跨膜结构域，因此只有在通过自噬传递到液泡后才被激活。饥饿和紧张（电话13删除）如A所示，误差条表示三个独立实验的SD。（C） 定量GFP-Atg8在A中生长的细胞中的分布。对每个菌株>150个细胞进行计数。这些值显示了GFP-Atg8有一个或多个点的人口比例，并基于六个焦平面的投影。在所有双突变体中，具有多个GFP-Atg8点的细胞的频率增加具有统计学意义（χ2检验，双尾值p<0.0001）。（D） 在C中量化的细胞的代表性单焦平面图像。SNARE和Atg24突变的组合导致GFP-Atg8出现多个点状突起，与自噬体形成缺陷一致。

Ape1加工试验、GFP-Atg8裂解试验和Pho8活化试验均取决于SNARE Vam3和液泡中存在的活性水解酶(达尔索等。, 1997). 然而，脉冲相分析表明，空泡水解酶羧肽酶Y的成熟在表现出强烈Ape1加工缺陷的双突变体中不受影响（例如，Δgos1Δatg24和Δtlg2Δatg 24），而正如预期的那样，它在Δvam3对照中被阻断（补充图S3A）。同样，双突变也没有表现出严重的液泡破碎缺陷，或生长速度的扰动（补充图S3、B和C）。内胚体成分的缺陷也可通过液泡降解导致膜蛋白的周转增加，但在双突变体中未检测到FLAG标记的Atg9形式的水平降低（补充图S3D）。综上所述，这些数据表明，这些双突变体中的液泡具有融合能力，并含有活性水解酶，因此Cvt途径成分双突变体的自噬缺陷必须位于液泡处理的上游，因此反映了自噬体形成的缺陷。

Cvt通路成分双突变体破坏自噬体中Atg9-GFP的积累

由于Atg9-GFP似乎至少部分位于内胚小室中，因此影响自噬的Golgi-endosomal交通成分的上述突变组合可能会影响Atg9向自噬体的传递。为了研究各种双突变体对Atg9向形成的自噬体传递的影响，我们比较了Atg9-GFP和RFP-Ape1的分布。在单个突变体中，用Atg9-GFP标记Ape1聚集体的细胞数量没有实质性变化(图7、A和B）。然而，在Ape1加工严重缺陷的双突变体中，Atg9-GFP与RFP-Ape1在富培养基和饥饿条件下共定位的细胞数量通常会大幅减少。这表明，即使在饥饿条件下，结合Cvt途径的突变也会导致Atg9向形成的自噬体的传递受到损害，这将为自噬中观察到的缺陷提供解释。这种普遍趋势的唯一例外是那些含有Atg20的突变体，尽管Ape1的加工有缺陷，但Atg9仍能在富培养基中到达形成的自噬体。这可能反映了Atg20在将Atg9回收到外周位点中的作用，升高的Atg9对自噬体成熟有害。这是之前针对Atg18提出的建议(雷焦里等。，2004年a)，和Atg20突变体始终显示出与Ape1聚集体相关的Atg9水平升高(图7A） ●●●●。

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在Golgi-endosomal贩运成分的双突变体中，Atg9未到达包含Ape1的自噬体。（A） 荧光显微照片比较了Atg9-GFP和RFP-Ape1在YEPD或SD（-N）中指示的代表菌株中的分布。箭头表示未与Atg9-GFP共定位的RFP-Ape1点。（B） YEPD（富）和SD（-N）中Atg9-GFP和RFP-Ape1共定位的量化。对每个菌株50–100个包含RFP-Ape1的结构进行了检查。

Atg9回收的不同步骤需要SNAREs Gos1和Tlg2

在Atg9被输送到自噬体后，它似乎又被送回外周池，可能允许它参与多轮自噬小体的形成(雷焦里等。，2004年a). 因此，必须有膜运输途径将Atg9传递到形成的自噬体，并将其移除并传递回外周位点，我们认为至少其中一些是内吞体。因此，如果一个突变组合减少了Atg9在形成的自噬体中的积累，这可能反映了传递中的直接缺陷，或者可能是传递是正常的，但在Atg9退出自噬体内后发生的回收途径有缺陷。这些可能性可以通过基于Atg1激酶的上位性分析来区分，即所谓的“去除Atg1蛋白激酶（TAKA）”分析(Shintani和Klonsky，2004年). Atg1是Atg9在回收途径开始时从自噬体中退出所必需的(雷焦里等。，2004年a). 因此，如果突变体或突变体组合影响递送，当Atg1从突变体背景中去除时，Atg9在自噬体的积累应保持抑制状态。然而，如果缺陷位于取回路径中，那么去除Atg1会导致Atg9在自噬体中积聚，因为它无法进入缺陷取回路径。

因此，我们检查了在显示强烈自噬缺陷的Cvt突变体组合中删除Atg1的效果。图8表明，当从Δtlg2Δatg24菌株中去除Atg1活性时，Atg9的递送仍然受到实质性抑制。相反，当SNARE Gos1与Δatg24结合缺失时，去除Atg1会导致Atg9在形成的自噬体中积累。这表明，当细胞通过去除Atg24而致敏时，Atg9必须到达形成自噬体的途径依赖于Tlg2，而不是Gos1。相反，自噬体的提取途径对Gos1有要求，但对Tlg2没有要求，这似乎发生在Atg1依赖的Atg9从自噬体内退出之后。Gos1和Tlg2的不同作用也与已知的两种SNARE参与不同的SNARE复合体以及不同的贩运过程相一致(McNew公司等。1998年;帕拉蒂等。, 2002;Burri和Lithgow，2004年). 这些结果表明，在饥饿诱导的自噬过程中，Cvt组分对含Atg9的膜向形成的自噬体的传递以及对自噬体的恢复都做出了多余的贡献。

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Atg24的损失与不同SNARE的损失相结合会影响Atg9回收路线的不同部分。（A） 荧光显微照片，比较Atg9-GFP和RFP-Ape1在删除或不删除Atg1的指示菌株中的分布。细胞生长于YEPD中期，并在饥饿条件下培养4小时（SD-N）。Atg1的缺失阻止了Atg9从围绕Ape1聚集物形成的自噬体中退出(雷焦里等。，2004年a). 在缺乏Atg11的情况下，自噬体不会形成，因此这可以作为阴性对照。在Δgos1Δatg24中，大多数形成的自噬体在缺乏Atg1（箭头）的情况下显示Atg9的积累，而在Δtlg2Δatg 24中，形成的自吞噬体往往缺乏Atg9（箭头），这表明递送而非回收有缺陷。（B） A中实验的量化，其中通过计数有多少Ape1聚集体与Atg9-GFP相关来量化Atg9在形成自噬体中的存在。对每种情况下的100–200 mRFP-Ape1 punta进行分析。

讨论

这里报道的结果表明，在酵母中，Atg9必须超越内质网和早期高尔基体才能在自噬中发挥作用。这一发现表明，大量的双层膜并没有直接从内质网输送到形成的自噬体，尽管我们不能排除这样的可能性，即存在一种在不包括Atg9的载体中将一些双层直接从内质网输送到自噬体的过程。结论是，至少Atg9必须通过高尔基体从内质网流出，这与之前的报告一致，即阻断内质网到高尔基体流量的条件突变会影响自噬(石原等。, 2001;雷焦里等。，2004年b)尽管在本例中可能有人认为，这些实验中使用的一般性、最终致命的分泌阻断可能影响了除Atg9递送以外的其他过程，或者可能反映了通过已知分泌被阻断时诱导的应激途径介导的间接效应(瑞塔和华纳，1994年;Nanduri和Tartakoff，2001年;耿等。, 2010). 此外，我们没有发现证据支持先前的观点，即Atg9定位于线粒体，因此双层膜可以从线粒体传递到形成的自噬体(雷焦里等。，2004年a;他等。, 2006;雷吉奥里和克林斯基，2006年;日元等。, 2007)这条路线需要前所未有的膜贩运流程和机器。

相反，我们的结果表明，在饥饿期间，连接高尔基体和内体系统的膜运输路线的成分组合被移除，从而干扰了Atg9和膜向自噬体的传递。这些成分先前已被证明是Cvt途径有效功能所必需的，但似乎不是饥饿诱导的自噬所必需的(阿贝利奥维奇等。, 1999;不错等。, 2002;雷焦里等。, 2003;梅岭-韦斯等。, 2005). 酵母Golgi-endosomal系统在实验室条件下补偿许多单基因缺失的能力，可以解释为什么在自噬缺陷变得明显之前，需要将这些基因中的一些组合删除，以及为什么在鉴定调节和调控蛋白质的精原遗传筛选中没有发现这些基因启动自噬(Tsukada和Ohsumi，1993年;图姆等。, 1994;哈丁等。1995年;中川县等。, 2009). 单个突变体仅在Cvt途径中显示缺陷，而在饥饿条件下不显示缺陷，这可能反映了这样一个事实，即在饥饿期间，从Golgi-endosome系统中的更多来源传递膜可能变得很重要，这样当自噬流量较大时，内吞运输的任何一个方面都不会耗尽通路。这也解释了为什么从内质网到分泌途径的膜流动受阻会迅速影响自噬，但对Cvt途径的影响较慢(石原等。, 2001;雷焦里等。，2004年b).

我们的结果表明，Cvt-pathway与饥饿诱导的自噬更为相似，因此这两个过程在速度上的差异大于机制上的差异。大多数被认为是Cvt-pathway特有的细胞成分是Golgi-endosomal交通的组成部分，我们在这里展示的这些成分对自噬也很重要。在剩下的部分中，Atg19是一种特定货物（Ape1）的受体，需要有效引导其在非供体细胞中形成自噬体，如果Atg17缺失，Cvt特异性支架蛋白Atg11似乎也需要用于自噬(铃木等。, 2007). 此外，Atg11与FIP200（S.M.，未发表的观察结果）密切相关，FIP200是一种哺乳动物蛋白质，是饥饿诱导自噬所必需的(哈拉等。, 2008).

高尔基体成分和饥饿诱导的自噬之间的联系也与形成的自噬体具有内吞室的许多特性相一致，包括PtdIns（3）P及其效应蛋白的富集(赫特玛等。, 2003;克里克等。, 2008;奥巴拉等。, 2008)Golgi-endosome系统中膜与隔室的明显交换，以及成熟后与液泡融合的能力。事实上，我们注意到，Atg2是一种在自噬体上发现的蛋白质，是自噬所必需的，与内体转运成分Vps13有着远缘关系（S.M.，未发表的观察结果）。从内吞系统的隔室递送膜和Atg9也将与最近的发现一致，即基本高尔基体GTPase活性Arf1/2或Ypt31/32的条件失活抑制自噬，因为这些活动可能直接或间接地需要通过高尔基体的交通以及从内吞小室再循环(希克等。, 1997;耿等。, 2010;范德法特等。, 2010). 这一要求似乎并不反映需要将Atg9输送到细胞表面，事实上，我们没有看到Atg9在诸如Δend3在内吞突变体的表面积聚（YO和SM，未发表的观察结果）。我们的发现是，当连接到Atg9时，RXR基序被识别，这表明该蛋白必须通过顺式COPI作用于高尔基体，将含有RXR的蛋白质再循环至内质网。需要进一步的工作来确定Atg9离开高尔基体的位置，因为最近的研究表明，晚期高尔基体Arf交换因子Sec7的失活不会导致Atg9在晚期高尔基体内积聚(范德法特等。, 2010). 鉴于酵母高尔基体系统的复杂性，还需要进一步的工作来绘制Atg9可以使用的精确路线和时间，事实上，有些成分可能对自噬体本身起作用，也可能是Atg9进入高尔基体后隔室和自噬体内所必需的。最近有人认为COG复合体的基本（叶A）亚单位是这样的(日元等。, 2010)，但由于这些亚单位也是膜蛋白通过高尔基体的运输所必需的，因此需要进一步的工作来确定这些特定突变阻断Atg9传递的点(范莱恩等。, 1999;猛撞等。, 2002).

总的来说，我们的结果表明，含有Atg9的双层是在形成的自噬体和高尔基-内体系统中的多个隔室之间循环，而不是在内质网或线粒体之间。这可能解决了以前在酵母方面的研究与最近在哺乳动物细胞方面的研究之间的差异，在哺乳动物细胞中发现Atg9的两个同源序列定位于TGN和内体(年轻等。, 2006;拉济等。, 2009). 应该补充的是，虽然我们的结果表明双层可能不会直接从内质网传递到自噬体，但这并不排除一些磷脂通过细胞溶质载体蛋白从内质网上或线粒体转移(Voelker，2009年). 我们证明，高尔基体-内体系统而不是内质网或线粒体显然参与了Atg9向形成的酵母自噬体的递送，这将有望使酵母系统能够指导酵母和哺乳动物细胞中这些和其他问题的研究。

补充材料

【补充资料】

鸣谢

我们感谢Alison Gillingham和Maki Ohashi对手稿的评论，感谢Daniel Klonsky对试剂的评论。这项工作得到了医学研究委员会（给S.M.）的资助，以及欧洲分子生物学组织、人类前沿科学计划和日本科学促进会（给Y.O.）的博士后研究金的支持。

脚注

这篇文章在年印刷之前在网上发表媒体中的MBoC(http://www.molbiolcell.org/cgi/doi/10.1091/mbc.E10-05-0457)2010年9月22日。

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文章来自细胞分子生物学由以下人员提供美国细胞生物学学会