AMBRA1与动力蛋白运动复合体的动态相互作用调节哺乳动物自噬

AMBRA1在自噬诱导后从动力蛋白-运动复合物中释放

因为AMBRA1在调节自噬中起着重要作用(Cecconi和Levine，2008年;Cecconi等人，2008年)，我们决定在自噬诱导时分析其与DLC1的相互作用。将共表达AMBRA1和DLC1的2F细胞在无营养培养基中培养4 h，并通过相互作用的co-IP分析进行分析。如所示图2 A，AMBRA1–DLC1相互作用不会因自噬刺激而改变。因此，AMBRA1在2F细胞中与DLC1显著共定位，且不依赖于营养物质供应（图S1 B）。

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图2。

自噬过程中AMBRA1–动力蛋白相互作用的调节。（A） AMBRA1–自噬诱导后DLC1相互作用。与编码HA标记的DLC1和AMBRA1蛋白的逆转录病毒载体共同感染的2F细胞营养缺乏4小时（+）或未经治疗（-）。蛋白质提取物用抗HA标记抗体（IP-HA；DLC1）进行IP处理，或作为阴性对照，用无关抗体进行IP处理（IP对照[Ctr]）。使用抗AMBRA1（WB AMBRA1；顶部）和抗DLC1抗体（WB DLC1；底部）分析纯化的配合物和相应的总提取物。（B） AMBRA1在自噬过程中从动力蛋白-运动复合体分离。2F细胞营养缺乏4小时或未经处理。使用抗DIC（IP-DIC）或无关抗体（IP-Ctr）作为阴性对照，对蛋白质提取物进行IP处理。用WB分析纯化的复合物，并用抗DIC（WB DIC；顶部）、抗AMBRA1（WB AMBRA1；中部）和抗DLC1抗体（WB DLC1；底部）分析相应的总提取物。（C） AMBRA1在自噬诱导后从小鼠组织中的动力蛋白运动复合体中分离。来自同一窝的小鼠在没有食物的情况下饲养24和48小时，或在献祭和尸检前随意喂食（−）。将来自这些小鼠的肾脏匀浆，并通过使用抗DIC抗体（IP-DIC）或使用无关抗体（IP-Ctr）进行IP分析。使用抗DIC（WB DIC，顶部）、抗AMBRA1（WB AMBRA1；中间）和抗DLC1（WB DLC1；底部）抗体将蛋白质免疫复合物与相应的总提取物一起探测。（D） AMBRA1在自噬诱导后与微管蛋白分离。感染编码Flag-taggedβgal或AMBRA1蛋白的逆转录病毒载体的2F细胞营养缺乏4小时或未经治疗。蛋白质提取物经IP和抗标记抗体（IP Flag）处理。使用Flag肽洗脱纯化的蛋白质，并使用WB以及使用抗AMBRA1（WB AMBRA1；顶部）和抗α-微管蛋白抗体（WB tubulin；底部）的相应总提取物进行分析。（E） AMBRA1通过DLC1与微管蛋白相互作用。2F细胞与编码标记的AMBRA1 FL、AMBRA1的逆转录病毒载体复合感染^TAT1型，或AMBRA1^TAT2型使用抗标记抗体（IP Flag）对蛋白质提取物进行IP处理。WB使用抗AMBRA1（WB AMBRA1；Top）或抗α-微管蛋白抗体（WB tubulin；bottom）分析纯化的复合物和相应的总提取物。

因为其他因素，如促凋亡BH3-only蛋白BIM，已被证明通过DLC1与动力蛋白运动复合物的动态相互作用来调节(Puthalakath等人，1999年)，我们开始研究（a）AMBRA1是否也是该复合物的一部分，在这种情况下，（b）AMBRA1-与该复合物之间的关联是否在自噬过程中发生改变。为此，在2F细胞中使用针对动力蛋白中间链（DIC；Lo和Pfister，2007年). 我们观察到，在控制条件下，AMBRA1与DIC相关，因此是更广泛的动力蛋白机制的一部分(图2 B，第三条车道）。此外，通过营养饥饿获得自噬诱导后，AMBRA1部分从动力蛋白复合物中分离(图2 B，第四条车道）。然而，只有一小部分DLC1与AMBRA1相互作用，因为大多数DLC1仍存在于复合体中，在复合体中发挥替代功能(图2 B;金，2000). 重要的是，在24–48小时不进食的小鼠肾脏组织中也观察到了相同的相互作用动力学，因此强调了这种调节的生理发生(图2 C).

AMBRA1与动力蛋白-运动复合体的动态相互作用一致，与微管成分微管蛋白相关，在营养缺乏时从微管中释放(图2 D). AMBRA1–微管蛋白相互作用被AMBRA1部分上的DLC1结合位点突变所破坏，证实AMBRA1与细胞骨架的关系严格依赖于该辅助蛋白(图2 E).

AMBRA1从动力蛋白-运动复合物中解离需要ULK1激酶活性

为了研究DIC中AMBRA1–DLC1释放的上游调控，我们检查了丝氨酸/苏氨酸激酶ULK1(Kuroyanagi等人，1998年)其酵母同源物Atg1是前吞噬体结构形成的关键调节器(Cheong等人，2008年;Kawamata等人，2008年)，对自噬诱导后的解离至关重要。当ULK1被siRNA寡核苷酸下调时(图S2 A)，我们观察到在饥饿条件下AMBRA1从DIC中解离的显著减少(图3 A)伴有自噬损伤（图S2 B）。此外，双向凝胶电泳的Western blot（WB）分析显示，AMBRA1在自噬诱导后被修饰，而ULK1的下调抑制了这一过程(图3 B; 图S2、C和D）。根据这一观察结果，我们发现AMBRA1被ULK1-免疫富集复合物磷酸化（但不是通过其激酶突变形式K46I；Chan等人，2009年)，如（a）体外激酶测定、（b）AMBRA1迁移率偏移测定和（c）磷酸酶处理实验所揭示的(图3，C–F; 和图S2 E）。相反，DIC和DLC1的双向凝胶电泳均未检测到修饰（图S2 F）。与这一发现一致的是，在凋亡诱导期间抑制DLC1磷酸化的关键调节因子JNK(Lei和Davis，2003年)，不会干扰解离过程（图S2 G）。此外，正如预期的那样，抑制BECLIN 1–VPS34活性（自噬体形成的下游事件）不会干扰AMBRA1–DLC1从DIC中分离（图S2 H）。总之，这些数据表明，AMBRA1–DLC1在ULK1依赖的AMBRA1磷酸化后从动力蛋白复合物中分离。

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图3。

AMBRA1在自噬过程中以ULK1依赖的方式磷酸化。（A） ULK1表达下调可防止AMBRA1在自噬过程中从动力蛋白-运动复合体分离。使用特定的siRNA寡核苷酸（siULK1）下调2F细胞中的ULK1。通过定量PCR和WB分析分析ULK1的表达水平(图S2 A). siCtr，不相关的寡核苷酸。转染后48h，2F细胞被饥饿4h或未经处理。制备蛋白质提取物，并使用抗DIC（IP-DIC）或无关抗体（IP对照[Ctr]）作为阴性对照进行IP处理。通过WB分析纯化的复合物，以及使用抗DIC（WB-DIC；底部）和抗AMBRA1抗体（WB-AMBRA1；顶部）的相应总提取物。（B） 对照细胞和ULK1下调细胞自噬诱导后AMBRA1修饰的分析。使用二维凝胶电泳（2DE）解析A中所述样品的蛋白质提取物，并使用抗AMBRA1抗体通过WB进行分析。pI4-7，等电pH梯度4-7；MW，分子量。显示了饥饿诱导的AMBRA1蛋白斑点（箭头）。虚线强调了ULK1活性产生的AMBRA1亚型的等电位移。（C） 免疫纯化的ULK1在体外磷酸化AMBRA1。用编码AMBRA1或ULK1 Myc-tagged蛋白的表达载体转染HEK293细胞。转染24小时后，将ULK1表达细胞营养饥饿2小时，以刺激ULK1活性。从转染的细胞制备蛋白质提取物，并使用抗Myc抗体（IP-Myc）进行IP。WB使用抗Myc抗体（WB-Myc）分析免疫沉淀蛋白的等分样品，以检查蛋白纯化情况（右）。如材料和方法中所述，在存在（+）或不存在（-）免疫纯化AMBRA1的情况下，对免疫纯化的ULK1蛋白进行体外激酶分析。作为激酶活性（−）的阴性对照，使用来自βgal-转染细胞（βgal-Myc）的抗Myc免疫纯化复合物进行体外激酶分析。反应通过SDS-PAGE和³²放射自显影显示P标记蛋白（左）。（D） AMBRA1在自噬诱导下的电泳迁移率超移。对HEK293细胞进行1、2和3小时的营养测试。制备蛋白质提取物，将其装入聚丙烯酰胺凝胶（见材料和方法），并使用抗AMBRA1抗体（WB AMBRA1）通过WB进行分析。（E） ULK1磷酸化AMBRA1。将编码AMBRA1–Flag的表达载体与野生型（Wt）ULK1或K46I ULK1 Myc标记蛋白一起转染HEK293细胞。转染48小时后，制备蛋白提取物，并使用抗AMBRA1抗体（WB AMBRA1）进行WB处理。（F） 用编码Myc标记的野生型ULK1的表达载体转染HEK293细胞。转染后48小时，用HEMG裂解细胞，并进行体外λ-磷酸酶测定，如材料和方法中所述。变性后，使用抗AMBRA1（WB AMBRA1；左）和抗Myc（WB Myc；右）抗体对蛋白质提取物进行WB处理。

AMBRA1–BECLIN 1复合物在自噬诱导后重新定位到内质网

有趣的是，在AMBRA1从动力蛋白复合物中分离的同时，自噬诱导导致细胞核周区AMBRA1的增加(图4 A，顶部）。因此，我们开始建立AMBRA1在自噬诱导时易位到的亚细胞隔室。通过内质网、自噬体、线粒体、高尔基池、早期内体和溶酶体的亚细胞标记，在营养饥饿诱导自噬的2F细胞内质网中检测到AMBRA1的部分重定位(图4 A; 和图S3，A–J). 亚细胞分馏分析证实了AMBRA1从动力蛋白复合物到内质网的易位(图4 B).

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图4。

AMBRA1在自噬诱导后易位到内质网。（A） AMBRA1在自噬诱导后重新定位到ER。表达mCherryAMBRA1（红色）和ER-GFP（一种带有ER定位信号肽的GFP蛋白；绿色）蛋白的2F细胞被饥饿4小时或不处理，用4%PFA固定，然后用冰镇甲醇渗透，用抗AMBRA1抗体染色，并用共聚焦显微镜进行分析。（底部）显示了两个荧光信号合并的图像。通过计算皮尔逊相关系数来评估结肠化第页在两个独立的实验中分析了至少10个细胞。（平均值第页：未处理，0.42±0.06；饥饿，0.62±0.07）巴，12微米。（B） AMBRA1在自噬诱导后易位到富含ER的部分。通过不连续蔗糖梯度沉淀法分离2F细胞线粒体后蛋白提取物（见材料和方法）。WB使用所示抗体分析梯度部分（1-13）。饥饿时富含AMBRA1–BECLIN 1的钙调素阳性组分用红色表示。

这些结果促使我们验证AMBRA1与动力蛋白马达的动态相互作用是否涉及III类PI3-激酶复合物的其他成分(谢和克林斯基，2007年). Co-IP实验表明，VPS34和BECLIN 1在自噬刺激前后均与AMBRA1和DLC1相关(图5，A和B). 然而，如AMBRA1所示，BECLIN 1–DLC1关联由AMBRA1介导^TAT2型突变体，阻止这种相互作用(图5 C). 与AMBRA1类似，我们还检测到BECLIN 1与DIC的动态相互作用(图5D). 此外，亚细胞分馏分析和共聚焦分析表明，BECLIN 1在自噬诱导后遵循AMBRA1易位模式(图4 B和图S3 K）。因此，VPS34活性也可在AMBRA1的易位位点检测到，如与PI3P相互作用蛋白GFP-DFCP1部分共染所示（图S3 L；维埃拉等人，2001年). 特别是，AMBRA1定位在与DFCP1阳性点（ω体的标志）非常接近的地方非常强烈，ω体被认为是内质网的自噬体形成位点（图S3 M；维埃拉等人，2001年). 值得注意的是，BECLIN 1的一部分仅限于转高尔基网络(Kihara等人，2001年)，不与AMBRA1共定位（图S3 K），这表明BECLIN 1的两个池在细胞内可能受到不同的调节。值得注意的是，RNAi下调AMBRA1可在不改变其蛋白质水平的情况下，削弱自噬诱导时BECLIN 1向内质网的易位(图5，E–H).

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图5。

自噬诱导后BECLIN 1易位到ER需要AMBRA1。（A） VPS34–AMBRA1在自噬诱导中的相互作用。感染了编码βgal Myc或AMBRA1 Myc蛋白逆转录病毒载体的2F细胞，营养缺乏4小时（+）或未经治疗（-）。蛋白质提取物经IP和抗Myc抗体（IP-Myc）处理。用WB使用抗VPS34抗体（WB VPS34）分析纯化的复合物和相应的总提取物。（B） BECLIN 1与DLC1相互作用。用编码βgal或标记的BECLIN 1的表达质粒瞬时转染2F细胞，并饥饿4 h（+）或不治疗（-）。蛋白质提取物使用抗标记抗体进行IP处理。用WB使用抗-BECLIN 1（WB BECLIN 1；顶部）、抗AMBRA1（WB AMBRA1；中部）和抗DLC1抗体（WB DLC1；底部）分析纯化的复合物和相应的总提取物。（C） BECLIN 1与DLC1的结合由AMBRA1介导。将编码βgal或标记的BECLIN 1的表达质粒与Myc-tagged AMBRA1全长（FL）或TAT2瞬时转染2F细胞。蛋白质提取物使用抗标记抗体进行IP处理。用WB使用抗BECLIN 1（WB BECLN 1；顶部）、抗Myc（WB AMBRA1；中部）和抗DLC1抗体（WB DLC1；底部）分析纯化的复合物和相应的总提取物。（D） 自噬过程中BECLIN 1与动力蛋白-运动复合体的动态相互作用。使用抗DIC抗体（IP-DIC）或无关抗体（IP对照[Ctr]）对表达2F细胞的AMBRA1蛋白提取物进行IP处理。WB使用抗BECLIN 1抗体（WB BECLN 1）分析纯化的复合物和相应的总提取物。（右）在未经处理（−）或饥饿（+）的细胞中也分析了BECLIN 1–DIC相互作用。（E） 用AMBRA1 siRNA（siAMBRA1）或无关的寡核苷酸（siCtr）转染2F细胞。转染后24小时，细胞被饥饿4小时或未经处理，固定，并用抗BECLIN 1（红色）和抗ERp57（绿色）抗体染色。（右）显示了两个荧光信号合并的图像。通过计算皮尔逊相关系数来评估结肠化第页在两个独立实验中分析的至少10个细胞（平均值第页：siCtr，0.35±0.17；饥饿，0.58±0.19；未经处理的siAMBRA1，0.28±0.06；饥饿，0.39±0.03）。在转染AMBRA1 siRNA1的细胞中也获得了类似的结果（未描述）。棒材，8µm。（F） AMBRA1下调后BECLIN 1蛋白水平的分析。使用特定抗体通过WB分析分析E中描述的细胞中AMBRA1和BECLIN 1的表达水平。微管蛋白，蛋白质负荷控制。（G和H）AMBRA1下调可损伤BECLIN 1向ER的易位。2F细胞转染AMBRA1 RNAi寡核苷酸（siAMBRA1）或无关寡核苷酸作为对照（siCtr）。通过不连续蔗糖梯度沉淀法分离2F细胞线粒体后蛋白提取物（见材料和方法）。（G） WB使用抗BECLIN 1抗体分析梯度组分（1-13）。（H） 还分析了梯度级分的calnexin分布，以验证siCtr和siAMBRA1细胞之间类似的分级效率。饥饿时富含AMBRA1–BECLIN 1的calnexin阳性部分显示为红色。

根据这些结果，我们认为，与凋亡期间的BIM调节类似(Puthalakath等人，1999年)，动力蛋白-运动复合体可能通过与AMBRA1和多分子BECLIN 1–VPS34自噬体成核复合体的结合，在调节自噬中发挥栓系/对接作用。

DLC1下调诱导AMBRA1依赖性自噬

为了阐明DLC1–AMBRA1相互作用在自噬中的功能作用，我们决定测试DLC1调节是否导致自噬失调。为此，通过转染DLC1特异性siRNA寡核苷酸，可下调2F细胞中DLC1的表达(图6 A)，并分析自噬发生情况。我们评估了LC3-I向其裂解和脂化形式LC3-II的转化及其向自噬结构的易位，自噬体形成的两个步骤(Kabeya等人，2000年). 我们还通过细胞超微结构分析和测量酸性囊泡细胞器（AVO；Paglin等人，2001年). DLC1下调导致基础状态和饥饿或雷帕霉素诱导的自噬期间自噬体数量显著增加(图6，B–D; 和图S4，A–C). 这种效应也在不同类型的细胞中获得，例如神经前体细胞（胚胎端脑原始[ETNA]细胞；图S4，D–F；Cozzolino等人，2004年).

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图6。

DLC1下调对自噬的调节。（A） 使用特定siRNA寡核苷酸（siDLC1a和siDLC1b）下调GFP-LC3表达2F细胞中的DLC1。数据链路C1用定量PCR（左）和WB（右）分析mRNA和蛋白质水平。siCtr，无关寡核苷酸；RL，相对水平；微管蛋白，蛋白质负荷控制。（B） DLC1下调导致基础和饥饿诱导的自噬增加。用DLC1 siRNA寡核苷酸转染24 h后，表达GFP-LC3的2F细胞饥饿4 h或不治疗，通过测量GFP-LC3-点状阳性细胞分析自噬的发生。报告三个实验数据的图表与对照条件下siRNA寡核苷酸转染细胞的代表性荧光图像一起显示。棒材，20µm。（C） 通过电子显微镜对转染DLC1（siDLC1b）或无关寡核苷酸（siCtr）的RNAi寡核苷酸的2F细胞超薄切片进行超微结构分析，并饥饿4小时或不治疗。棒材，1.5µm。（D–F）DLC1下调导致自噬体速率增加。（D） DLC1下调（siDLC1a-b）后，2F细胞用溶酶体抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A处理4h或不处理，并通过LC3-I到LC3-II的转化分析自噬的发生。报告了LC3-II相对于微管蛋白的带密度比的密度分析，其中siCtr比任意定义为1.00(图S4 B). （E） 用溶酶体标记LAMP1（绿色）对转染为D的表达mCherryLC3的2F细胞进行染色，并将其与溶酶体抑制剂E64d和胃蛋白酶抑制素A作用4h。还显示了包含合并图像的更高放大率视图的插图。棒材，16µm。通过计算皮尔逊相关系数来评估结肠化第页（平均值第页：siCtr，0.24±0.02；siDLC1a，0.66±0.04）。（F） 转染表达GFP-LC3的2F细胞并按D处理后，分析每个细胞的GFP-LC3puncta外观。*，P<0.05；**，P<0.01。（G） DLC1下调诱导的自噬需要AMBRA1。表达GFP-LC3的2F细胞被转染数据链路C1和AMBRA1型siRNA寡核苷酸（siAMBRA1）可以单独使用，也可以组合使用。转染后24h，2F细胞饥饿4h或不治疗，通过检测GFP-LC3点状阳性细胞分析自噬的发生。（H） DLC1下调诱导的自噬需要PI3K活性。DLC1下调后，2F细胞与沃特曼培养4h，并分析GFP-LC3点状染色的外观。误差条表示三个实验的平均值±SD。

Dynein由参与运动复合体结构组成的重链和中间链蛋白质与已知调节复合体功能的不同轻链结合而成(金，2000;Hök和Vallee，2006年). 为了验证自噬是否是由DLC1下调特异性诱导的，对转染了DLC家族其他细胞溶质成员特异性siRNA寡核苷酸的2F细胞的自噬发生情况进行了分析(Wilson等人，2001年)即dynein TCTEX光链1、dynein ROADBLOCK光链1和DLC2。其中，只有DLC2下调诱导自噬，尽管程度低于DLC1（图S4，G–M）；因此，DLC2也能够绑定AMBRA1（图S4 M）。DLC1和DLC2的联合下调对自噬诱导具有加性效应（图S4，N–P），表明这两种蛋白在这方面具有非冗余作用。

因为已经证明，肌动蛋白复合物是自噬体迁移和融合到溶酶体所必需的(Ravikumar等人，2005年;Köchl等人，2006年;Jahreiss等人，2008年;Kimura等人，2008年)，我们开始研究DLC1耗竭引起的自噬体积累是否可能源于自噬固存增强（开启速率）或自噬物质降解减少（关闭速率；Klonsky等人，2008年). 为了区分这些可能性，我们通过监测LC3与mCherry（一种改进的单体红色荧光蛋白，在酸性条件下不会失去荧光，典型的溶酶体；Shaner等人，2004年)在溶酶体蛋白酶抑制剂（E64d和胃蛋白酶抑制素A）存在的情况下，使用溶酶体标记LAMP1和Lysotracker（未发表的数据），防止溶酶体内mCherryLC3降解(Tanida等人，2005年). 我们观察到DLC1下调后，自噬体能够与溶酶体融合并形成自噬溶酶体(图6 E). 此外，E64d和胃蛋白酶抑制素A增强了DLC1 siRNA触发的内源性LC3-II的增加(图6 D和图S4 B）以及GFP-LC3点的堆积(图6 F). 总的来说，这些数据表明DLC1抑制增加了培养细胞中自噬的发生率。

接下来，我们假设，如果DLC1下调导致的自噬诱导是由动力蛋白复合体释放AMBRA1引起的，那么这种现象应该通过AMBRA1失活来消除。将DLC1 siRNA寡核苷酸单独或与AMBRA1 siRNA寡核苷酸联合转染2F细胞，通过检测GFP-LC3点的发生率来分析其对自噬的影响。如所示图6 G，如果AMBRA1同时失活，则通过DLC1下调的自噬诱导被阻止，这表明DLC1在自噬中的作用是依赖于AMBRA1的。此外，DLC1下调诱导的自噬需要BECLIN 1–VPS34活性，正如Wortmannin介导的PI3K抑制所揭示的那样(图6 H). 为了排除AMBRA1除了控制自噬外，还可能在动力蛋白复合物介导的早期内体运输、EGF受体的内化和降解中发挥作用的可能性(Driskell等人，2007年)在被siRNA寡核苷酸下调AMBRA1表达的细胞中进行分析(图S5). AMBRA1 siRNA转染细胞与对照细胞之间未检测到显著差异。因此，AMBRA1似乎在EGF受体的早期内体转运中不起作用。

细胞培养

将人纤维肉瘤2F、HEK293和ETNA细胞培养在添加10%FCS（Sigma-Aldrich）、2 mM我-谷氨酰胺和1%青霉素/链霉素溶液，37°C（2F和HEK293）或33°C（ETNA），5%CO₂为了诱导自噬，用0.2–2µM雷帕霉素（Sigma-Aldrich）处理细胞或在厄尔平衡盐溶液（Invitrogen）中培养4小时。如有指示，在检测前，将细胞在1或10µM诺卡唑（Sigma-Aldrich）、10µg/ml E64d和10µg/ml胃蛋白酶抑制素A（Sigma Aldrich。对于EGFR内化分析，细胞在DME加0.1%FCS中培养过夜，并在分析前用100 ng/ml EGF（PeproTech）处理10、20和40分钟。对于溶酶体染色，在分析前30分钟向细胞中添加50 nM Lysotracker green（Invitrogen）。如供应商所示，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）瞬时转染2F和293细胞的表达载体。通过在0.4 mg/ml G418（Invitrogen）存在下培养转染pCMV/Myc/ER-GFP的细胞2周，获得稳定表达ER-GFP-蛋白的2F细胞。

cDNA克隆

对于逆转录病毒表达，所有构建物均克隆在pCLPCX载体中。先前描述了BECLIN 1、GFP-LC3、GFP-p40Phox和FL、F1、F2和F3 AMBRA1载体(Fimia等人，2007年). GFP-DFCP1质粒由N.T.Ktistakis（英国剑桥Babraham研究所）提供；Axe等人，2008年). ULK1构造由S.A.Tooze（英国伦敦伦敦研究所；Chan等人，2009年). 人类DLC1是在带有HA标签的框架中克隆的。AMBRA1突变体TAT1和TAT2是通过使用定点突变试剂盒（安捷伦科技公司）产生的，并在带有Myc或Flag标签的框架中克隆。mCherryLC3是通过在pCLPCX-GFP-LC3质粒中用通过PCR从pmCherry-N1载体（Takara Bio Inc.）扩增的mCherry替换GFP序列而产生的。mCherryAMBRA1是通过在pCLPCX-AMBRA1中AMBRA1的5′端亚克隆mCherry序列而生成的。pCMV Myc ER-GFP购自Invitrogen。所有PCR-扩增cDNA的序列均通过DNA测序分析进行验证。

逆转录病毒的产生和感染

用磷酸钙法将15µg逆转录病毒载体与5µg水疱性口炎病毒g蛋白表达质粒共转染293 gp/bsr细胞株。48小时后，回收含有逆转录病毒颗粒的上清液，并添加4µg/ml聚brene。用含逆转录病毒的上清液培养6~8小时，感染2F或ETNA细胞。

抗体

本研究中使用了以下主要抗体：兔抗Myc标签（Millipore）、鼠抗HA标签（Sigma-Aldrich）、鼠反Flag标签（WB和EM分析；Sigma-Aldrich），鼠抗DLC1（BD）、鼠防DIC（Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、兔抗ULK1（Sigma-Aldrich）、，兔和山羊抗-BECLIN 1（分别为WB和免疫荧光分析；Santa Cruz Biotechnology，Inc.）、兔抗-BECLIN 1（WB分析；细胞信号技术）、兔抗病毒VPS34（Invitrogen）、兔对抗LC3（细胞信号技术，兔抗AMBRA1（IF和EM分析；Covalab）、兔抗AMBRA1 CT（IP和EM研究；ProSci，Inc.）、小鼠抗ERp57（Stressgen）、小鼠抗LAMP1和EEA1（Abcam）、小鼠抗体GOLGIN（Invitrogen），小鼠抗复合物Vα亚基（Invit罗gen）和小鼠抗α微管蛋白（Sigma-Aldrich）、小鼠对抗EGFR（Millipore）、，和兔抗钙网织蛋白（Stressgen）。

自噬试验

如前所述测量自噬(Fimia等人，2007年). 简而言之，通过在厄尔平衡盐溶液培养基（Sigma-Aldrich）中培养细胞4-5小时来诱导饥饿。为了对LC3斑点进行免疫检测，细胞生长在盖玻片上，并用4%PFA固定在PBS中，清洗三次，然后直接用共聚焦显微镜检查。结果显示GFP-LC3阳性细胞中GFP-LC3-点状点的百分比或每个细胞中GFP-LC3点状点数量。每个实验每个条件下的三份样品中，每个样品至少有50–100个细胞。为了量化AVO的发展，通过胰蛋白酶消化分离细胞，用PBS洗涤，用1µg/ml吖啶橙（Sigma-Aldrich）染色15分钟，并使用流式细胞仪（FACScan；BD）和CellQuest软件（BD）进行分析。使用C57BL/6小鼠进行体内自噬实验。来自同一窝友的5个月龄雄性小鼠不进食，但用水喂养24和48小时，或在宰杀和组织分析之前随意喂食。

对于电子显微镜，用2.5%戊二醛将细胞固定在0.1 M的二羧酸缓冲液（pH 7.4）中，在4°C下保持45分钟，在二羧酸盐缓冲液中冲洗，后固定在1%OsO中₄在二羧酸缓冲液中，脱水，并嵌入epon。将超薄切片与醋酸铀酰进行简单对比，并用电子显微镜（CM900；卡尔蔡司公司）拍摄。

IP和WB分析

在IP实验中，细胞或组织在HEMG缓冲液（25 mM Hepes，pH 8.0，100 mM NaCl，25 mM MgCl）中溶解₂0.5%Triton X-100、0.1 mM EDTA和10%甘油）加蛋白酶和磷酸酶抑制剂（蛋白酶抑制剂鸡尾酒加1 mM氟化钠、1 mM原钒酸钠和1 mM钼酸钠；Sigma-Aldrich）。为了分析BECLIN 1–动力蛋白复合物，使用不同的溶解缓冲液（40 mM Hepes，pH 7.4，2 mM EDTA，10 mM甘油磷酸，以及0.3%CHAPS加蛋白酶和磷酸酶抑制剂）和洗涤缓冲液（40m M Hepes,pH 7.4、150 mM NaCl，2 m M EDTA、10 mM丙三磷酸酯和0.3%CHAPS）进行IP，如前所述(细川等人，2009年). 1–3 mg裂解物在4°C下孵育30 min。在13000℃下4°C离心10 min后克为了去除不溶性碎片，将等量的蛋白质与20µl单克隆抗cMyc或与蛋白A琼脂糖珠结合的抗Flag抗体（分别为Takara Bio Inc.和Sigma-Aldrich）在4°C下旋转培养4小时，或与与蛋白A琼脂糖结合的30µl抗HA单克隆抗体（Sigma-Aldrich）培养4小时或在4°C下过夜2µg抗DIC抗体，或2µC抗AMBRA1抗体（CT；ProSci，Inc.），然后用30µl蛋白A/g–Sepharose珠（Roche）培养60分钟。通过离心收集珠子，并用HEMG缓冲液洗涤四次。用50µl SDS-PAGE样品缓冲液洗脱与珠结合的蛋白质，并在95°C下煮沸10分钟。使用5%体积/体积的全部提取物和30%体积/体积洗脱的蛋白质进行WB分析。在AMBRA-微管蛋白相互作用实验中，免疫复合物通过在RT下与Flag肽（Sigma-Aldrich）孵育30分钟来洗脱，以防止凝胶中存在免疫球蛋白。

蛋白质在NuPAGE双三凝胶（Invitrogen）上分离，并电印在硝化纤维素（Protran；Schleicher&Schuell）或PVDF（Millipore）膜上。在4°C的温度下，在TBS和0.1%吐温-20中的5%脱脂干乳中用一级抗体孵育斑点过夜。使用辣根过氧化物酶结合二级抗体（Bio-Rad Laboratories）进行检测，并使用ECL plus（GE Healthcare）进行可视化。请注意，内源性AMBRA1通常以双峰带的形式迁移，而过表达的AMBRA1显示出额外的低分子量带。

为了更好地显示磷酸化诱导的AMBRA1迁移率变化，蛋白质样品在SDS-PAGE凝胶上进行了解析(Anderson等人，1973年). 对于λ-磷酸酶分析，细胞在HEMG中溶解，并在30°C下与400 Uλ-磷酸酯酶（新英格兰生物实验室公司）孵育45分钟。通过添加4×SDS样品缓冲液停止反应，并煮沸10分钟。

共聚焦和免疫金分析

为了进行共聚焦分析，细胞生长在盖玻片上，用4%PFA固定在PBS中，然后用0.1%Triton X-100渗透到PBS中；如果需要，用冰镇甲醇或4%PFA在PBS固定，然后再用冰镇甲醇渗透。一级抗体在RT培养1小时，并通过Cy3-和Cy2-结合二级抗体进行可视化。（Jackson ImmunoResearch Laboratories，Inc.）。盖玻片安装在防褪色（SlowFade；Invitrogen）中，并在配备63×1.40–0.60 NA HCX Plan Apo oilλ的共焦显微镜（TCS SP2；徕卡）下进行检查_BL公司RT.共聚焦（Leica）和ImageJ（National Institutes of Health）软件用于共聚焦分析。关于共焦软件分析，两种荧光团在单个光学切片上绘制的线扫描上的局部强度分布绘制在图中。关于ImageJ软件分析，如果两个8位图像（每个图像的红色和绿色通道）的像素的强度高于其通道的阈值（设置为50），并且如果其强度的比率高于比率设置值（设置为50%），则将其视为共定位。通过计算皮尔逊相关系数来评估结肠化第页在两个独立的实验中分析了至少10个细胞。皮尔逊相关系数表示为平均值±SD。同时分析并绘制每个荧光色素的荧光强度。

对于电子显微镜，将2F细胞固定在2%新解聚的PFA和0.2%戊二醛中的0.1 M二羧酸缓冲液（pH 7.4）中，在4°C下保持1h。样品在缓冲液中冲洗，部分脱水，并嵌入伦敦树脂白（LR白；Agar Scientific Ltd.）中。如图S3 J所示，为了保持膜结构，在相同的缓冲液中冲洗固定细胞，用0.25%的单宁酸在缓冲液中在4°C下处理1 h，并在缓冲液的50 mM氯化铵中冲洗。样品在缓冲液中的2%乙酸铀酰中后固定30分钟，部分脱水，并在−20°C的紫外光下嵌入伦敦树脂金（LR White；Agar Scientific Ltd.）中。为免疫金技术处理超薄切片。Grids与10%正常山羊血清在含有1%BSA和0.13%NaN的10 mM PBS中预孵育_三（培养基A）在RT下培养15分钟。用抗AMBRA1抗体或在培养基A中稀释的抗Flag抗体在4°C下培养过夜。在含有0.01%吐温-20（Merck）的培养基A中冲洗后，用与15nm胶体金结合的适当二级抗体（英国生物细胞国际）在含有鱼明胶的培养基A中稀释1:30，在室温下培养1h。在培养基A的室温下培养15min后，第二次免疫标记使用兔多克隆抗DLC1或抗钙网蛋白作为第一抗体，山羊抗兔IgG结合5-nm胶体金作为第二抗体。在蒸馏水中彻底冲洗格栅，与2%醋酸铀酰水溶液对比20分钟，并在电子显微镜上拍照（EM 900卡尔蔡司公司）。

RNA干扰

使用来自Invitrogen的以下寡核苷酸进行RNAi：DLC1、DLC2、ROADBLOCK1、TCTEX1和ULK1寡核苷酸。AMBRA1 siRNA寡核苷酸如前所述(Fimia等人，2007年). 按照供应商的指示，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将100 pmol siRNA转染到2×105个细胞/孔的6孔板中。连续两天重复转染以提高转染效率。转染48小时后通过实时PCR和WB分析检测RNA减少。

实时PCR

用Trizol试剂（Invitrogen）制备RNA。根据制造商的建议，使用逆转录试剂盒（Promega）生成cDNA合成。使用LightCycler（Roche）进行实时PCR反应。如前所述，LightCycler FastStart DNA Master SYBR green I（Roche）用于在重复循环扩增反应期间产生荧光标记的PCR产物(Fimia等人，2007年). 使用Primer Express软件系统（版本1.0；Applied Biosystems）设计所有扩增子的引物组：AMBRA1型（正向），5′-AACCCTCACTGGCGAGTTGA-3′和（反向）5′-TCTACTGTCCGTGTCTCC-3′；L34级（正向），5′-GTCCCAACCCCTGGTAATAGA-3′和（反向）5′-GGCCCTGACATGTTT-3′；数据链路C1（正向），5′-CCCC ACCTCAGGTAACCAT-3′和（反向）5′-GCCTGAGCGCACCAC-3′；数据链路控制2（正向），5′-GACTCCGTGAAGTGTC-3′和（反向）5′-GGCGCAGTCAACGGCAT-3′；路障1（正向），5′-GAGCCAGAAGGGAGTGCAGG-3′和（反向）5′-TGAGGCTGGCATACTGTGG-3′；TCTEX1公司（正向）、5′-GGGCAGCTCTACTGACGGGA-3′和（反向）5′-AAGCCATAGGCTGGACTGC-3′；和ULK1系列（正向）、5′-AAGCCATAGGCTGGACTGC-3′和（反向）5′-AAGCCATAGGCTGGACTGC-3′。L34级mRNA水平作为内部对照。β-肌动蛋白和GAPDH公司水平被用作额外的控制，以确认显著下降。

双向凝胶电泳分析

按照制造商的说明，使用清洁试剂盒（Ettan 2-D；GE Healthcare）沉淀蛋白质，然后将其重新悬浮在尿素缓冲液中（7 M尿素、2 M硫脲、2%CHAPS、1%磺基甜菜碱SB3-10、1%氨基磺基甜菜碱ASB14和50 mM DTT）。

对于蛋白质分离的第一维，在电泳装置（IPGphor II；GE Healthcare）上使用7-cm固定化非线性pH梯度条带（3–10）和线性pH梯度条线（4–7）进行等电聚焦。通过被动凝胶内再水化加载30µg蛋白质12 h，然后使用程序运行，其中电压设置为30 V下90 min，100 V下30 min，200 V下30 min.，电压梯度为500 V下15 min，500 V下30分钟，1000 V下15 min.，1000 V上30 min，5000 V下60 min，以及5000 V下180 min。

在第二维度电泳之前，在1%DTT的RT下使IPG凝胶条平衡15分钟以还原蛋白质，然后使用4%碘乙酰胺衍生巯基（两种溶液均在50 mM Tris、pH 8.8、6 M尿素、30%甘油、2%十二烷基硫酸钠和2%溴酚蓝中制备）15分钟。将条带转移到1.0-mm厚的8%、10%和15%（wt/vol）聚丙烯酰胺微凝胶中，分别用于AMBRA1、DIC和DLC1检测，并将二维凝胶在120 V下运行2 h。将二维凝胶转移到硝化纤维过滤器中，如WB所述。

体外混合珠激酶试验

将带有Myc标记的野生型或K46I ULK1或带有Myc标签的AMBRA1 cDNA瞬时转染HEK293细胞，转染ULK1的细胞需要营养2小时。蛋白质提取物经过带有抗Myc抗体的IP处理，并按照前面所述进行混合珠激酶分析(Chan等人，2009年). 简而言之，野生型Myc-ULKI和K46I Myc-ULK1免疫纯化蛋白用HEMG缓冲液洗涤四次，用激酶反应缓冲液洗涤一次（20 mM Hepes，pH 7.5，20 mM MgCl₂、25 mMβ-甘油磷酸、2 mM DTT和100µM原钒酸钠），然后与Myc-AMBRA1免疫纯化蛋白结合，并在含有5µCiγ的20µl最终体积的激酶反应缓冲液中培养-[³²P] ATP（PerkinElmer）在30°C下保持30分钟。通过添加4×SDS样品缓冲液停止反应，并煮沸10分钟[³²P] -标记的反应产物在SDS-PAGE上进行解析，并使用磷光成像扫描仪（Typhoon；GE Healthcare）通过放射自显影术进行分析。

蔗糖梯度速度沉降

用5µM紫杉醇（Sigma-Aldrich）处理2F细胞4 h。将细胞裂解物悬浮在含有0.25 M蔗糖、10 mM Hepes和1 mM EDTA加蛋白酶抑制剂混合物的缓冲液中。细胞悬液在dounce potter均质器中均匀化100次，并在600℃下离心10分钟克获得核后上清液。核后上清液在11000重新离心15分钟克获取线粒体后上清液。将线粒体后上清液分层到一个不连续的四步梯度上，梯度由2ml的2.0M、1.3M、1.0M和0.6M蔗糖在10mM Hepes中组成。在27000下使用转子（SW41 Ti；Beckman Coulter）进行离心克持续18小时，手动收集0.4毫升级分并检查密度。

统计分析

所有实验至少进行了三次。使用Excel（Microsoft）进行统计分析。使用学生的吨测试。P≤0.05被认为是显著的。

我们感谢罗马托尔韦加塔大学动物基金会（STA）的鼠标工作，感谢M.Acuña Villa和M.W.Bennett的编辑和秘书工作，感谢R.Laricchia、C.Antinozzi、T.Vescovo、V.Cianfanelli、F.Florenzano和P.Mattioli在图像处理方面的研究协助和帮助。我们感谢S.A.Tooze、N.T.Ktistakis和S.Hirotsune（日本大阪大阪大学）为我们提供ULK1-、DFCP1-和DIC编码结构。特别感谢F.托蒂的大力支持。

这项工作部分得到了Telethon基金会、高级成像研究中心、意大利大学和研究部（给F.Cecconi和M.Piacentini）、意大利卫生部的Ricerca Corrente和Ricerca Finalizzata（给F.Cecconi、M.Piaccentini和G.M.Fimia）的资助，欧盟Apo-Sys联盟（致M.Piacentini）和圣保罗公司（致F.Cecconi和M.Piaccentini。）。