C2结构域特异性膜靶向机制：靶向脂质局部池增强钙²⁺密切关系^†

融合蛋白结构

编码小鼠cPLA的质粒₂αC2结构域融合到mRFP1（RFP-cPLA）的C末端₂αC2）通过扩增IMAGE克隆构建{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“BC003816”，“term_id”：“13277881”}}电话：003816使用在聚合酶链反应（PCR）产物上产生XhoI和XmaI位点的引物，并将消化产物连接到pmRFP1-（C3）中的互补位点，pmRFP1是通过将mRFP1替换为pEGFP中的EGFP而构建的质粒（BD Biosciences Clontech）。最终构造RFP-cPLA₂αC2编码小鼠cPLA的残基17至148₂α蛋白，包括整个C2结构域。先前描述了编码与YFP融合的人PKCαC2结构域的质粒（YFP-PKCαC2）(13). 对于在体外脂质结合研究、PKCαC2和cPLA₂αC2结构域通过PCR亚克隆到谷胱甘肽的EagleI/EcoR1位点S公司-如前所述的转移酶（GST）-融合载体(27).

细胞培养

将从美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）获得的RAW264.7细胞以1×10的密度涂布在35 mm的玻璃底培养皿（马萨诸塞州阿什兰市马特克）上⁴细胞/厘米²并在含有10%热灭活FBS、100 U/mL青霉素、100μg/mL链霉素、0.292 mg/mL谷氨酰胺和20 mM HEPES在5%CO中₂37°C时。将1–2.5转染细胞μ按照制造商的方案，在OptiMEM（Invitrogen）中使用Lipo-fectamine 2000（Invit罗gen）对每个相关质粒进行检测。

荧光蛋白显微镜

共同转染的RAW264.7细胞用HBSS冲洗并在HBSS中孵育，HBSS额外缓冲25 mM HEPES，pH 7.4（HHBSS），含有0.01%的无内毒素BSA。使用配备60×1.4 N.a.油浸物镜、CFP/YFP/RFP双色镜、，对应的单波段激发和发射滤波器（Chroma Technology）和CoolSNAP ES相机（Photometrics，Tucson，AZ）。激发灯由水银灯提供。用5μM离子霉素采集之间的第一组和第二组YFP/RFP图像集。每个图像集从300 ms YFP和300 ms RFP采集开始，然后是关闭的快门周期，在后续图像集的起点之间产生3 s的总间隔。最终图像是使用Adobe Photoshop（Adobe）和ImageJ（NIH，网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/).

分离C2结构域的表达和纯化

PKCα和cPLA的C2结构域₂α表达为谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）-融合蛋白，在谷胱甘肽亲和柱上分离，然后用凝血酶裂解并洗脱游离C2结构域。免费cPLA₂-C2结构域被Ca进一步纯化²⁺-与PC-苯基葡聚糖树脂的依赖性结合，然后用所述的乙二胺四乙酸（EDTA）洗脱(45). PKCα-C2和cPLA的质量₂α-C2结构域由基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）证实。蛋白质纯度通过SDS-PAGE测定(55)蛋白质浓度由280nm处的吸光度和酪氨酸差分光谱法测定(56).

脂质混合物和磷脂囊泡的制备

将脂质溶解在氯仿/甲醇/水（1/2/0.8）中，以得到所需的脂质比例，在45°C的真空下干燥，直到去除所有溶剂，然后用缓冲液A（25 mM）水合N个-（2-羟乙基）哌嗪-N个′-2-乙磺酸（HEPES），pH 7.4，含KOH、140mM KCl、15mM NaCl和1mM MgCl₂)通过快速涡流。通过Misonix XL2020探头声波仪对水合脂质进行超声波处理以澄清，从而生成小的单层磷脂囊泡。在平衡钙滴定和动力学实验中使用的囊泡储备溶液的总脂质浓度为3 mM，简单膜的摩尔百分比如下：PE/PC/PS/dPE(65/10/20/5)和PE/PC/PS/dPE(40/50/5/5); 生理质膜变化：PM[6%PIP₂]，CH/PE/PS/PC/PIP₂/dPE/PI/SM（25/23.5/21/10.5/6/5/4.5/4.5）；项目经理[2%PIP₂]，PE/CH/PS/PC/dPE/PI/SM/PIP₂(27.5/25/21/10.5/5/4.5/4.5/2); PM【6%PIP】₂]（−）PS、PE/CH/PC/PIP₂/dPE/PI/SM（44.5/25/10.5/6/5/4.5/4.5）；项目经理[2%PIP₂]（−）PS、PE/CH/PC/dPE/PI/SM/PIP₂(48.5/25/10.5/5/4.5/4.5/2); 项目经理[0%PIP₂，5%CH]，PE/PS/PC/CH/dPE/PI/SM（49.5/21/10.5/5/4.5/4.5）；项目经理[0%PIP₂]，PE/CH/PS/PC/dPE/PI/SM（29.5/25/21/10.5/5/4.5/4.5）；项目经理[0%PIP₂，38.5%PC]，PC/CH/PS/dPE/PI/SM/PE（38.5/25/21/5/4.5/4.5/1.5）；和PM[0%PIP₂]（−）PS，PE/CH/PC/dPE/PI/SM（50.5/25/10.5/5/4.5/4.5）；生理内膜变化：IM、PC/PE/CH/dPE/PS/PI/SM（49.5/27/5/5/4.5/4.5）；IM[12%PS]，PC/PS/PE/CH/dPE/PI/SM（49.5/21/10.5/5/5/4.5/4.5）；IM【25%CH】，PC/CH/PE/dPE/PS/PI/SM（49.5/25/7/5/4.5/4.5）；IM[13.5%PC]，PE/PC/CH/dPE/PS/PI/SM（63/13.5/5/5/4.5/4.5）。表1总结了这些脂质混合物。用于平衡钙滴定的额外囊泡储备溶液，要求最终总脂质浓度大于200μ在总脂质浓度为30 mM时制备M，摩尔百分比如下：PE/CH/PS/PC/dPE/PI/SM/PIP₂（28.5/25/21/10.5/5/4.5/4.5/1）和PC/PE/CH/dPE/PS/PI/SM（49/27/5/5/4.5/4.5）。在超声作用后，17970年通过离心作用从所有脂质混合物中除去不溶性物质克持续5分钟。

稳态荧光透视

在Photon Technology International QM-2000-6SE荧光光谱仪上，在缓冲液a中25°C下进行稳态荧光实验。所有测量的激发和发射狭缝宽度分别为1和8 nm。所有缓冲液均采用Chelex处理过的Ca制成²⁺-自由水。蛋白质和脂质溶液与Chelex树脂孵育以去除残余钙²⁺使用前。石英试管和搅拌棒通过在100 mM EDTA中浸泡并用Ca进行大量冲洗来脱钙²⁺-使用前的游离水(10,23,45).

平衡钙的测定²⁺-依赖性蛋白质膜FRET

钙的定量²⁺-根据先前开发的方法，C2结构域与膜结合的蛋白质-膜FRET依赖性增加(10,23,45). 简单地说，Ca²⁺-自由C2域（0.75μM） 和钙²⁺-游离超声处理脂质（200μM总计=100μ将缓冲液A中的M（除非另有说明）与少量浓缩Ca混合²⁺缓冲液A中的储备溶液，从dPE发射（发射波长和发射波长分别为λ_前任=284 nm和λ_{相对长度单位}分别=522 nm）。在单独的样品中，相同的Ca²⁺添加到Ca²⁺-缓冲液A中的游离脂质溶液缺乏蛋白质，无法控制与钙相关的光散射引起的背景发射的任何变化²⁺-介导的脂质体聚集和dPE的光漂白。在进行稀释校正和背景排放减法后，Ca²⁺荧光增加的依赖性（ΔF类)绘制为游离钙的函数²⁺（[钙²⁺])，并使用以下希尔方程获得最佳拟合(方程式1)以下为：

式中ΔF类_最大值表示计算出的最大荧光变化（标准化为单位，除非另有说明，以简化图形表示），H（H）表示希尔系数，和[Ca²⁺]_1/2表示游离Ca²⁺引起半最大荧光变化的浓度。在大多数情况下，游离钙²⁺浓度估计与钙浓度相同²⁺在滴定过程中加入脱钙反应溶液。这个近似值产生了准确的[Ca²⁺]_1/2[Ca时的值²⁺]_1/2值远远超过脱钙起始反应中C2结构域的浓度（0.75μM） 。对于[Ca²⁺]_1/2值低于4μM、 游离钙²⁺通过校正总钙来计算浓度²⁺Ca浓度²⁺与C2域结合，用于痕量钙的背景量²⁺脱钙后出现。

钙²⁺-PKC的依赖性膜靶向α-C2和cPLA₂-活细胞中的C2结构域

PKCα和cPLA₂αC2结构域分别与黄色荧光蛋白（YFP）和红色荧光蛋白（RFP）融合。将产生的融合蛋白同时导入小鼠巨噬细胞系RAW264.7，并用Ca处理荧光细胞²⁺离子载体离子霉素诱导均匀胞质钙²⁺接近生理钙微摩尔峰值的幅度增加²⁺信号((58)和Evans，未发布的结果），如所示图1在未经处理的细胞中，两种融合蛋白在细胞质和核质中均呈均匀分布(图1A和C). 细胞质钙在几秒钟内²⁺增加，YFP-PKCαC2转位到质膜和RFP-cPLA₂αC2至内膜(图1B和D). 值得注意的是，合并后的图像(图1E，绿色和cPLA中的PKCαC2₂αC2（红色）强调了两个C2结构域的互斥靶向性，这与之前的研究结果一致，即PKCαC2结构域只靶向质膜，而cPLA₂αC2结构域专门针对内膜(12,13,27,46,57).

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图1

共表达和Ca²⁺-激活靶向PKCα和cPLA₂-巨噬细胞衍生细胞系中的C2结构域。图示为PKCα-和cPLA的（A和B）黄色和（C和D）红色荧光蛋白融合₂-C2结构域分别在同一RAW264.7细胞中共存。时间零点（A和C）的图像显示了在添加离子霉素之前两种荧光蛋白在细胞质和细胞核中的分布，离子霉素触发了全局Ca²⁺信号。在添加后的9秒内，（B）PKCαC2结构域从细胞质募集到质膜，（D）cPLA₂C2结构域从细胞质和核室招募到核、高尔基体和内质网膜。后两幅图像（E）的叠加显示了这两个C2域分别对血浆和内膜的唯一、非重叠靶向。为了简单起见，显示的图像是穿过细胞的中间平面切片。这种中平面图像没有显示在质膜顶面和底面PKCα-C2结构域募集时观察到的荧光点状模式(27). 此外，这些瞬时转染没有表现出在类似条件下对稳定转染的RAW细胞观察到的细胞极化（Evans，J.H.和Falke，J.J.，未发表的工作）。

在其他细胞类型的这两个C2域中观察到类似的靶向特异性(12,13,27,46,57). cPLA的可变性最大₂αC2结构域，在RAW细胞中主要靶向核膜，而C2结构域中有一小部分靶向高尔基体和内质网（ER）膜，但可以检测到。先前在原代白细胞和HEK293细胞中观察到了相同类型的靶向模式，主要定位于核膜，这两种细胞的高尔基体膜密度相对较小(12,46). 相反，在CHO和MDCK细胞中，cPLA具有广泛的高尔基体系统₂αC2结构域主要靶向高尔基体而非其他内膜(13,27,59). 因此，cPLA的分布₂细胞核、高尔基体和内质网膜之间的αC2结构域与细胞内部这些膜系统的相对密度密切相关。在高尔基体发育不良的细胞类型中，大多数靶向是核膜，而在具有广泛高尔基体系统的细胞类型里，大部分靶向是高尔基体膜。

PKC公司α-C2和cPLA₂-C2结构域的表达与纯化

重组PKCα-C2和cPLA₂α-C2结构域被克隆、表达和纯化（参见材料和方法），用于研究特定膜靶向生理钙的机制的模型膜结合研究²⁺浓度。通过SDS-PAGE测定所得结构域的纯度，发现纯度超过90%。PKCα-C2和cPLA的质量₂通过MALDI-TOF质谱，α-C2分别为16288和16267 Da。两个实验质量均在预测质量的误差范围内（PKCα-C2为16283，cPLA为16267₂α-C2）。

平衡Ca²⁺PKC的依赖性α-C2和cPLA₂-C2域靶向简单模型膜

PKCα-C2与cPLA的亲和力₂在超生理钙条件下，膜的α-C2分别强烈依赖于膜PS和PC含量²⁺浓度（100–1000μM）(10,12,23,52). 检测含有PS和PC的简单脂质混合物是否能够繁殖在体外微摩尔Ca²⁺对这些C2结构域的灵敏度和正交靶膜特异性进行了观察，并对C2结构域与由简单PS和PC混合物组成的人工合成的单板层小泡（SUV）的结合进行了检测。采用蛋白质-膜FRET测定膜对接钙²⁺滴定到含有给定域、给定类型SUV和生理缓冲液的溶液中((45)，参见材料和方法）。

对于PKCα-C2结构域，Ca²⁺滴定曲线图2A得出了非线性最小二乘最佳拟合[Ca²⁺]_1/228±2μM用于C2结构域对接到PS含量为20 mol%的简单膜，接近其靶膜，即质膜的内小叶的PS含量（PE/PC/PS/dPE，65/10/20/5 mol%）(12,60,61). 相比之下，[Ca²⁺]_1/2超过1000μM用于C2域对接到含有5 mol%PS的膜，对应于内膜的PS含量（PE/PC/PS/dPE，40/50/5 mol%PS）(12,60,61).

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图2

PKCα-和cPLA的平衡结合₂磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰丝氨酸（PS）和磷脂酰乙醇胺（PE）的简单脂质混合物的α-C2结构域。所示为Ca²⁺钙的滴定曲线²⁺-（A）PKCα-C2和（B）cPLA的触发对接₂α-C2到声波作用的单层小泡，由简单的脂质混合物组成，粗略地类似于质膜（PE/PC/PS/dPE，65/10/20/5 mol%）或内膜（PE/PC/PS/dPE，40/50/5/5 mol%）的内叶。观察到PKCα-C2结构域更喜欢含有20 mol%PS的简单质膜模拟物，而不是含有5 mol%PS的内膜模拟物₂与含有10 mol%PC的简单质膜模拟物相比，α-C2结构域对含有50 mol%PC的简单内膜模拟物表现出较弱的偏好性。然而，这两种C2结构域-膜组合都未能在Ca的生理范围内产生实质性的膜对接²⁺在细胞质中观察到的浓度（黑条）。通过测量蛋白质中天然Trp供体和膜中低水平的丹酰化磷脂酰乙醇胺（dPE）受体之间的蛋白-膜FRET来量化膜对接。实心曲线表示与希尔方程的最佳拟合(方程式1). 在每个框中，上曲线被归一化，以便其渐近接近统一，而其他曲线则绘制在相同的相对荧光标度上，强调它们在饱和[Ca²⁺]。

对于cPLA₂α-C2结构域，Ca²⁺滴定图2B产生[Ca²⁺]_1/2第7±1页μM用于C2域对接到含有50 mol%PC的膜，类似于其靶内膜的PC含量（PE/PC/PS/dPE，40/50/5 mol%）(12,60,61). A[钙²⁺]_1/217±2μ观察到M与含有10 mol%PC的膜进行C2结构域对接，如质膜内叶（PE/PC/PS/dPE，65/10/20/5 mol%）(12,60,61).

这些Ca²⁺简单脂质混合物的滴定证实了先前提到的PKCα-C2和cPLA的PS和PC偏好₂α-C2域(10,12,23,52). 这种偏好对这两个结构域的细胞内靶向性作出了重大贡献，因为PS和PC脂质摩尔百分比最高分别出现在血浆和内膜中(12,60,61). 然而，在目前的实验条件下，钙²⁺简单PS/PC混合物的滴定产生非生理[Ca²⁺]_1/2数值分别大了28倍和7倍，以解释PKCα和cPLA的有效对接₂微粒体胞质Ca中α-C2结构域对靶膜的作用²⁺信号事件。最近，我们观察到PIP的添加₂对于简单的PS/PC膜，产生的[Ca显著降低²⁺]_1/2价值；然而，这个值仍然大了至少3倍，无法解释在微摩尔细胞质Ca过程中的有效对接²⁺信号。为了确定蛋白质与膜之间的相互作用²⁺PKCα-和cPLA的亲和力₂α-C2结构域进入生理范围后，使用更接近生理膜复杂性的合成膜进行了进一步的实验。

设计用于模拟靶细胞内膜的复杂生理模型膜

生理模型膜SUV是用脂质成分生成的，这些脂质成分旨在模拟质膜或内细胞膜的细胞溶质小叶。这些模型膜，详见表1含有暴露于细胞质的哺乳动物膜的主要脂质，包括磷脂酰乙醇胺（PE）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂酰基丝氨酸（PS）、磷脂肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）、胆固醇（CH）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP）₂)以及FRET受体丹磺酰-磷酸乙酰胺（dPE，5 mol%）的小密度。质膜模拟物（PM）反映了PS、胆固醇和PIP的相对高含量₂以及在质膜内叶中发现的低含量PC((12,60,61),表1). 使用含有21 mol%PS和2 mol%PIP的两种PM混合物₂，对应于批量PIP₂质膜内叶浓度，或6 mol%PIP₂，代表假定的本地PIP₂脂筏中的浓度(62-65). 内膜模拟物（IM）反映了PC的高含量，接近50 mol%，以及PS、胆固醇和PIP的低含量₂存在于细胞核、高尔基体和内质网膜等内部细胞膜中(12,60,61). 还根据PM和IM混合物的变化创建了额外的脂质混合物，以检查特定脂质成分在C2结构域的膜识别中的作用。这些变化降低了PC、PS、CH或PIP的摩尔百分比₂同时相应地增加PE的摩尔百分比，从而保持所有其他组分的恒定密度(表1). 以前的工作和本研究的结果都表明PKCα-C2和cPLA₂α-C2结构域对膜PE含量相对不敏感(10,12,23,52)使PE成为替换组件的最佳选择。将C2结构域与SUV结合的初步研究与相同脂质组成的大型单板层小泡（LUV）进行比较，结果表明没有可检测到的差异（数据未显示），这表明SUV较大的膜曲率不会显著改变该系统中的蛋白-膜相互作用。

钙²⁺PKCα-C2结构域对接对生理模型膜的依赖性

用蛋白-膜FRET测定膜对接钙²⁺被滴定到含有PKCα-C2结构域和给定类型的生理模型膜SUVs的系统中，从而揭示了不同脂质混合物对Ca²⁺膜对接的依赖性。图3A显示生成的Ca²⁺滴定曲线，以及表2总结了相应的[Ca²⁺]_1/2值，由非线性最小二乘法确定，最适合使用希尔方程。每次Hill分析都使用实际游离Ca²⁺通过校正最小背景钙来计算相关滴定的浓度²⁺污染（0.1μM） 和Ca²⁺绑定到C2域（请参见材料和方法）。

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图3

PKCα和cPLA的平衡结合₂生理脂质混合物的α-C2结构域。所示为Ca²⁺钙的滴定曲线²⁺-（A）PKCα-C2和（B）cPLA的触发对接₂α-C2到声波作用的单层囊泡，由复杂的生理性脂质混合物组成，其中含有磷脂酰乙醇胺（PE）、胆固醇（CH）、磷脂酰丝氨酸（PS）、磷脂酰胆碱（PC）、磷脂肌醇（PI）、鞘磷脂（SM）和磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸（PIP）₂). 标记为PM[2%PIP的膜₂]和PM[6%PIP₂]模拟质膜内叶（PE/CH/PS/PC/dPE/PI/SM/PIP₂，摩尔百分比（27.5或23.5）/25/21/10.5/5/4.5/4.5/（2或6），而标记IM的膜模拟了内膜（PC/PE/CH/dPE/PS/PI/SM，摩尔百分比49.5/27/5/5/4.5/4.5/4.5）。其他膜是通过对这两种基本混合物进行改性而形成的，以测试单个组分的重要性，得出以下总结的组分表1（A）PKCαC2结构域对质膜模拟物PM表现出高度特异性[2%PIP₂]和PM[6%PIP₂]并在生理钙水平被这些膜有效吸收²⁺浓度（黑色条）。相反，内膜模拟IM和缺乏PS、PIP的膜₂或这两种靶脂质都未能在生理钙中募集到C2结构域²⁺浓度。（B） 中国解放军₂与质膜模拟物（PM-[6%PIP）相比，α-C2结构域对内膜模拟物的特异性较弱₂])并且在生理Ca下被膜吸收不良²⁺浓度（黑色条）。去除靶脂PC（IM（−）PC）显著降低了该C2结构域对膜的亲和力。如图例所述，通过蛋白质到膜FRET定量蛋白质与膜的对接图2.实心曲线表示与希尔方程的最佳拟合(方程式1)，产生[Ca²⁺]_1/2值和希尔系数汇总于表2在每个框中，对上曲线进行归一化，使其渐近接近1，而其他曲线则在相同的相对荧光标度上绘制，以突出饱和[Ca时蛋白质与膜FRET的不同平衡水平²⁺]。

的结果图3A和表2表明含有生理水平PS和PIP的PM混合物₂高钙产量²⁺亲合力足以解释在细胞质Ca期间观察到的PKCα-C2结构域向质膜内叶的募集²⁺信号。含有2 mol%PIP的PM混合物₂，指定PM[2%PIP₂]，产生了[Ca²⁺]_1/2值1.6±0.1μM.同样，含有6 mol%PIP的PM混合物₂，指定PM[6%PIP₂]，产生了[Ca²⁺]_1/2值0.7±0.1μM（M）(图3A,表2). 相比之下，IM混合物产生的Ca较弱²⁺-触发膜结合，使测量的[Ca²⁺]_1/2大大超过300μM（M）(图3A,表2). 这些发现证实，类似于质膜胞浆小叶而不是内膜胞浆小叶的生理脂质混合物能够在微摩尔水平的Ca下有效募集PKCα-C2结构域²⁺.

结果进一步表明，PKCα-C2结构域的有效对接可以模拟微摩尔Ca下的生理膜²⁺级别需要PS和PIP₂但对PC和胆固醇的敏感性明显降低。因此，当PS从PM混合物中去除时，产生PM[2%PIP₂]（−）PS或PM[6%PIP₂]（−）PS混合物，[Ca²⁺]_1/2分别增加了7倍或5倍(图3A,表2). 类似地，当PIP₂从PM混合物中除去，生成PM（−）PIP₂混合物，[Ca²⁺]_1/2与含有2或6 mol%PIP的相应PM混合物相比，增加了20倍或50倍₂分别为(图3A,表2). 最后，当PS和PIP₂移除以生成PM（−）PIP₂（−）PS混合物，[Ca²⁺]_1/2增加到大大超过300μM、 与IM膜的观察结果类似(图3A,表2). 相比之下，[Ca²⁺]_1/2只要含有相似水平的PS和PIP的脂质混合物，其值就相对独立于PC或胆固醇含量₂进行了比较(图3A,表2). 总之，这些结果表明，PKCα-C2结构域的精细质膜靶向特异性是由微粒状细胞质钙触发的²⁺信号高度依赖于PS和PIP₂靶膜的含量。

PIP的存在₂在膜中发现对钙的希尔系数有显著影响²⁺-触发了PKCαC2结构域与膜的对接。缺乏PIP的膜₂显示的希尔系数范围为1.2至1.7(表2)，与之前测得的Ca值重叠²⁺PKCα-C2结构域对接到缺乏PIP的简单膜的滴定₂(H（H）= 1.3 ± 0.1, (23)). 当PIP₂添加后，希尔系数略有下降，但在大多数情况下显著降低至1.0至1.2(表2). PKCαC2结构域具有两个Ca²⁺结合位点和钙的希尔系数²⁺-触发式膜对接报告了两个钙结合期间这些位点之间的正合作性²⁺离子。PIP的较低希尔系数₂-含有膜表明PIP₂促进仅含有一个结合Ca的C2结构域的对接²⁺离子，其希尔系数原则上为1.0。这一观察结果对膜特异性和对接机制具有重要意义，如下所述（见讨论）。

钙²⁺cPLA的依赖性₂-C2域对接到生理模型膜

对于cPLA₂α-C2结构域，Ca²⁺还使用FRET进行了滴定，以监测C2结构域与生理模型膜SUV的对接(图3B). 结果[Ca²⁺]_1/2值汇总于表2如前所述，PC是cPLA的主要脂质决定因子₂α-C2膜对接特异性。因此，含有50 mol%PC的IM膜模拟物产生了[Ca²⁺]_1/2值为10±2μM，使膜对接发生在Ca较低的3倍处²⁺浓度低于任何含有6、2或0 mol%PIP的PM混合物的浓度₂（[钙²⁺]_1/2=36±3、31±3或29±4μM、 分别）。使用一系列低PC含量、高PS含量或高CH含量的IM混合物进一步研究了这种特异性的PC依赖性。IM混合物中PC含量减少至13.5 mol%PC，导致[Ca增加²⁺]_1/2大于3倍至36±3μM、 类似于[Ca²⁺]_1/2PM混合物的测量值。相比之下，IM混合物中PS（增加到21 mol%）或CH（增加到25 mol%²⁺灵敏度（[Ca²⁺]_1/2=9±2和[Ca²⁺]_1/2= 11 ± 2μM） 。对于这个C2域，PIP的存在₂对[Ca²⁺]_1/2值或希尔系数，与PKCαC2域相反，其中PIP₂降低了这两个参数(表2). 这种模式与以前的观察结果一致，与PKCαC2结构域不同，cPLA₂α-C2结构域不具有PIP₂结合位点(27).

本研究结果证实，在生理性脂质混合物的背景下，膜PC含量在定义cPLA中起作用₂α-C2域靶向特异性。然而，包括IM混合物在内的所有模拟膜均未产生[Ca²⁺]_1/2Ca微摩尔范围内的值²⁺细胞质信号中的浓度。因此，这些条件在体外实验还没有与解放军的经验相匹配₂细胞内靶向过程中的α-C2结构域。一种可能的解释是IM混合物可能缺少一种重要的脂质成分。内膜的三种额外的脂质成分被测试为潜在的靶脂质：1-磷酸神经酰胺、PI(4)对₁，和含有花生四烯酸的PC表3，每种额外的脂质对[Ca的影响都小于2倍²⁺]_1/2价值，提供有力证据证明这些脂质不是cPLA的特定靶点₂α-C2结构域。因此，迄今为止的证据表明，该C2结构域的唯一重要目标脂质是PC头部组，尽管不能排除其他目标。[Ca的微摩尔值的另一种可能解释²⁺]_1/2中国人民解放军展出₂细胞中的α-C2结构域是相对于目前使用的膜浓度而言，内部膜的局部浓度要高得多在体外研究。

总脂浓度对钙的影响²⁺C2域对接的依赖性

所有上述实验均利用了总可获得的脂质浓度（100μM） 显著低于质膜内叶的估计值（400–800μM） 或内膜（>3000μM） 在活细胞的细胞质中(54). 在蛋白质-膜FRET研究中，可用的最大脂质浓度通常约为400μM是因为在较高浓度下发生过度光散射。为了建立Ca之间的关系²⁺-敏感性和脂质浓度，[Ca²⁺]_1/2测量了PKCα-C2结构域与不同浓度PM混合物的对接值和cPLA对接值₂不同浓度IM混合物的α-C2域，如所示图4.

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图4

膜浓度对[Ca的影响²⁺]_1/2Ca值²⁺-PKCα和cPLA的触发对接₂α-C2结构域。显示的是[Ca²⁺]_1/2C2结构域与由生理性脂质混合物组成的声波单层囊泡对接的值。（A） [加利福尼亚州²⁺]_1/2PKCα-C2与质膜内叶生理模拟物对接的数值(表1，PM[2%PIP₂])在不同可获得的脂质浓度下。观察到的[Ca²⁺]_1/2该值与所检查范围内的脂质浓度无关，接近预期的微摩尔生理钙阈值²⁺信号（---）。（B） [加利福尼亚州²⁺]_1/2cPLA对接值₂α-C2对内膜的生理模拟(表1，IM)在不同可获得的脂质浓度下。观察到的[Ca²⁺]_1/2该值强烈依赖于可达到范围内的脂质浓度。假设所示的线性或渐近外推（•••），[Ca²⁺]_1/2总脂浓度在700到1000之间时，该值将下降到生理微摩尔范围μM易得脂质。可接近的脂质浓度计算为总脂质浓度的一半，假设大约一半的脂质暴露在囊泡的外叶上。[加利福尼亚州]²⁺]_1/2通过测量Ca期间蛋白质与膜的对接来确定值²⁺滴定如图所示​图22和​和3三.

[加利福尼亚州]²⁺]_1/2中显示的值图4APKCα-C2域对接到PM混合物（PM-[2%PIP₂])显示出几乎没有变化，因为可获得的总脂质浓度在100μM高达400μM、 接近细胞水平。这些发现与一个模型一致，其中一个或两个Ca²⁺离子最初与游离C2结构域结合，然后在PM混合物的所有测试浓度下迅速与靶膜对接（见讨论）。FRET分析的局限性阻碍了[Ca的测定²⁺]_1/2PKCα-C2结构域对接，IM脂质浓度接近细胞内相关浓度（>3000μM） 。然而，[Ca²⁺]_1/2测量该C2结构域与总可获得IM脂质浓度100的对接μM为360±80μM（M）(图3A,表2)，比Ca高300倍²⁺微摩尔细胞质钙的浓度²⁺信号。总之，这些发现表明Ca²⁺PKCα-C2结构域的亲和力很高，足以被生理钙激活²⁺当结构域位于细胞质膜浓度附近但不在内膜附近时发出信号。因此，获得了PKCα-C2结构域与复合脂质混合物结合的结果在体外充分解释在微摩尔细胞质钙期间观察到的该结构域对质膜的特异性²⁺信号。

与PKCα-C2结构域的发现相反图4B用于cPLA₂α-C2结构域揭示了[Ca的强烈依赖性²⁺]_½膜的局部浓度。值得注意的是，[Ca²⁺]_½cPLA值₂α-C2与IM混合物的对接随着总可得脂质浓度从100增加到400而线性减少μM.总的来说，[Ca²⁺]_½从7.2±1.1下降到3.4±0.4的两倍多μM超过该范围，表示Ca相应增加²⁺密切关系。同样，FRET分析的局限性阻止了实验的扩展，使其无法达到总可接触内膜脂质的细胞内浓度（>3000μM） ，但将数据外推到这些高血脂浓度(图4B，虚线)表明[Ca²⁺]_½将进入生理微摩尔范围(图4B，虚线)脂肪浓度在700到1000之间μM.假设这种推断是合理的，内膜的细胞内浓度远高于生成cPLA有效对接所需的水平₂微摩尔细胞质钙的α-C2结构域²⁺信号。相比之下，Ca²⁺cPLA的灵敏度₂α-C2域对接到PM混合物（PM[2%PIP₂])在可达到的脂质浓度为400时也进行了测量μM、 产生[Ca²⁺]_½值为20±2μM.总之，这些发现表明Ca²⁺cPLA的亲和力₂α-C2结构域高度足以被生理钙激活²⁺当结构域位于细胞内膜浓度附近而不是质膜附近时发出信号，从而解释了在活细胞中观察到的特定靶向性。

总的来说，目前的平衡结合数据表明²⁺-PKCα-和cPLA的触发细胞内靶向₂血浆和内膜的α-C2结构域分别可以通过C2结构域与靶脂质的相互作用得到充分解释。固有的靶向特异性和对微摩尔钙的敏感性似乎不需要与其他蛋白质相互作用²⁺这两个C2域显示的信号。质膜特异性与微摩尔钙²⁺细胞中PKCα-C2结构域的激活需要靶脂PS和PIP₂主要存在于质膜的内叶上。相比之下，内膜特异性和微摩尔Ca²⁺cPLA的激活₂α-C2结构域需要细胞内部高内膜密度产生的局部高浓度PC。对于后一个C2结构域，不能排除PC以外的第二个靶点，尽管对第二个目标脂质的搜索不成功，支持了PC局部高浓度是唯一相关靶点的结论。

PKCα-C2结构域与不同脂质混合物的对接动力学

为了更好地确定C2结构域靶向特定膜的分子机制，研究了膜对接动力学。以前对PKCα-和cPLA进行了膜结合和解离的动力学研究₂α-C2结构域，但仅限于超生理钙²⁺浓度在100到1000之间μM范围(10,12,23,45). 在这些非常高的钙²⁺浓度，平衡结合数据(图2)表明PKCα-C2结构域的膜特异性较弱，使得该结构域更倾向于靶PM脂质混合物，但也表现出与非靶IM混合物的显著对接。相比之下，低钙²⁺浓度，该结构域对其目标PM脂质混合物具有很强的特异性。为了寻求这些平衡结果的分子基础，我们测量了PKCα-C2结构域在不同钙浓度下与不同脂质混合物结合的膜结合和解离速率²⁺停流荧光光谱仪中的浓度（见材料和方法）。通过将含有C2结构域的溶液与膜悬浮液快速混合，测定了结合动力学，其中两种组分与所需的Ca预平衡²⁺混合前的浓度。通过混合预先形成的Ca来测量解离动力学²⁺-蛋白质-膜复合物与EDTA溶液。快速混合后，通过蛋白质-膜FRET监测结合和解离反应的平衡方法。

PKCα-C2结构域的动力学结果如所示图5和表4引人注目的是，在超生理钙²⁺浓度为1 mM时，PKCα-C2结构域对接靶点的结合动力学几乎相同（PM[2%PIP₂]或PM[6%PIP₂])和非目标（IM、PM[6%PIP₂]（−）PS或PM[0%PIP₂])膜，变化不超过1.7倍。同样，尽管不同膜的PKCα-C2结构域分离动力学存在可测差异，但差异太小，无法实现特定的膜对接。因此，相对于C2结构域从PM靶膜的解离（PM[2%PIP₂]或PM[6%PIP₂])，拆除PS或PIP₂将解离速度加快了3到4倍，而同时去除PS和PIP₂分离速度加快了8倍，IM膜的使用使分离速度加快5倍。总的来说，脂质组成对1 mM Ca下PKCα-C2结构域的结合和解离动力学的中度影响²⁺解释了这一领域与非靶细胞膜在超生理钙的可测量对接²⁺浓度(图3A). 在较低的Ca²⁺浓度为5μM、 接近微摩尔Ca水平²⁺信号表明，C2结构域的平衡结合不良阻碍了非靶膜的动力学测量。然而，在这个较低的Ca²⁺成功地进行了C2结构域与PM靶膜对接的浓度、动力学测量。缔合反应揭示了一种新的动力学成分，其速率常数比之前在高钙条件下观察到的速率常数小13至17倍²⁺浓度。这种缓慢的结合可归因于C2结构域的膜对接，C2结构域仅部分而非全部被钙占据²⁺这些观察结果支持一种机制（见讨论），其中微摩尔Ca²⁺浓度仅将一个Ca加载到C2域²⁺与负载两个钙的结构域对接时观察到的较弱的靶特异性相比，离子随后在反应中对接到膜上，表现出较强的靶特异性²⁺超生理钙离子²⁺浓度。

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图5

不同钙浓度下PKCα-C2结构域与生理性脂质混合物对接的动力学分析²⁺浓度。（A） 1 mM或5 mM膜快速混合引发的缔合反应μM钙²⁺和停流荧光计中的C2域。在1 mM Ca下观察到的缔合动力学²⁺不同的质膜（PM[2%PIP₂])并检测内膜（IM）模拟物。相比之下，观察到的质膜模拟物（PM[2%PIP₂])在5μM钙²⁺除了与其他反应相同的快速组分外，还显示出明显较慢的第二组分。（B） 蛋白质-钙快速混合引发的解离反应²⁺-EDTA膜复合物。与质膜模拟物（PM[2%PIP）的分离₂])比从内膜模拟物（IM）分离慢5倍。减少钙²⁺浓度从1 mM到5μM几乎没有效果。数据点下的固体曲线表示与单指数或双指数过程的最佳拟合，得出表观速率常数，总结如下表4.通过蛋白质-膜FRET测量（图例图2).

两种第二信使诱导的细胞内靶向：MATA和TAMA

对于由全局第二信使和局部靶分子的一致检测引起的特异性细胞内靶向，可以提出两种不同的机制，例如通过全局Ca的一致检测来特异性靶向C2结构域²⁺信号和局部靶脂质。信使激活靶亲和力（MATA）机制的特征在于靶向蛋白具有apo状态，对第二信使具有高亲和力，对靶分子具有低亲和力。具体来说，在其apo状态下K（K）_D类信使结合小于或近似等于信号期间的信使峰值浓度，而K（K）_D类靶结合浓度明显大于细胞内靶浓度。在这种系统中，第二信使的结合通过其耦合结合平衡触发目标分子亲和力的大幅增加，从而激活目标蛋白。在第二信令信号事件期间，由于其天生对信使的高亲和力，靶向蛋白将在任何地方被激活，并随后与所有可接触的靶分子对接。因此，靶向蛋白将被招募到细胞中全球信使信号延伸的任何和所有区域，以及存在可访问的靶分子的地方。这种MATA机制可能在第二信使通路中运行，激活的目的是驱动对接到整个细胞中所有可用的靶分子。然而，当靶分子被限制在细胞内的特定位置时，这种机制只能产生特定的靶向。

靶激活分子亲和力（TAMA）机制截然不同。这种机制的特点是靶向蛋白具有对第二信使低亲和力和对靶点低亲和力的载脂蛋白状态。具体来说，在其apo状态下K（K）_D类信使结合显著高于信号期间的峰值信使浓度，并且K（K）_D类靶结合浓度明显大于细胞内靶浓度。在第二信使信号事件期间，靶蛋白的亲和力太低，无法与第二信令结合，但细胞中靶蛋白局部浓度较高的区域除外。在这些区域，由于耦合结合平衡的热力学效应，高靶浓度驱动第二信使的有效亲和力增加。因此，只有当靶向蛋白质位于既感知第二信使信号又具有高局部靶分子浓度的细胞区域时，它们才会被第二信令成功激活和靶向。这种TAMA机制在第二信使激活途径中很有用，激活的目的是仅在细胞中拥有大量靶区的区域中驱动对接。

对于目前的C2结构域，TAMA是合理的机制，因为基本靶脂质（PS和PC）存在于整个细胞的膜中，但在靶膜（血浆和细胞内膜）中显著富集。在没有靶分子的情况下，PKCα和cPLA₂αC2结构域表现出低Ca²⁺亲和力（[Ca²⁺]_½第35页和第14页μM、 分别）(10,23,45)只允许生理微摩尔Ca轻微激活²⁺信号。对于PKCαC2结构域，靶脂PS在内膜中浓度显著（4 mol%），但在质膜的内叶中富集（21 mol%(12,60,61). 对于cPLA₂αC2结构域，靶脂质PC以显著水平存在于质膜内叶中（10 mol%），但在内膜中显著富集（50 mol%）(12,60,61). 因此，对于这两个C2结构域，TAMA通过限制Ca来优化膜靶向的特异性²⁺激活含有最大共同靶脂池的膜区域。

对于传统PKCα，β、和γC2结构域，两个或多个PS分子与C2结构域结合的正协同性进一步增强了TAMA机制(23)通过第二靶脂PIP的唯一质膜定位₂.在Ca期间²⁺信号，PS和PIP的联合TAMA效应₂使传统PKC C2域能够驱动高特异性Ca²⁺-活化对接到质膜表面，PKC激酶结构域的重要蛋白底物位于此处。

对于cPLA₂αC2结构域，目前还不可能排除存在高度定位于内膜的第二种靶脂质（类似于PIP₂对于PKC C2域）或存在局部的、较高的块状Ca²⁺靶膜附近的浓度。然而，目前的研究结果表明，在细胞内膜中发现的高局部密度的PC，对于解释在钙离子交换过程中观察到的对这些膜的特异性靶向至关重要²⁺信号。由于广泛的内陷和相邻膜结构的紧密堆积，细胞内部内膜的局部密度至少是质膜附近膜密度的10倍(54). 这种高膜密度，加上内膜中目标PC的5倍高摩尔百分比(12,60,61)，确保cPLA₂相对于质膜，αC2结构域在内膜附近的局部PC浓度将至少高出50倍。如此大的靶脂密度被提议用于驱动cPLA的TAMA靶向₂αC2结构域到内膜，从而将相关磷脂酶结构域招募到这些膜中，这些膜具有细胞内任何地方发现的底物含花生四烯酸磷脂的最高摩尔百分比。

在其他类型的钙中²⁺信号通路，MATA和TAMA机制的例子都很明显。一个有趣的例子是钙调蛋白，它具有不同的N端和C端结构域，这两个结构域都受钙调节²⁺绑定(66). 这种蛋白质通过多种不同的对接机制与多种效应蛋白对接(67,68). 这个K（K）_D类对于Ca²⁺与C末端结构域的结合在低微摩尔范围内(69)，并且该结构域可以独立地与某些蛋白质靶点对接(67,68). 因此，C域是MATA靶向的一个例子，因为生理钙²⁺即使在没有目标的情况下，信号也会大量加载并激活C域。相比之下K（K）_D类对于Ca²⁺与N端结构域的结合在几十微摩尔范围内(69)这样有效的Ca²⁺该结构域的激活需要存在降低其有效钙的靶蛋白²⁺K（K）_D类通过耦合结合平衡(67,68). 因此，需要N域激活的钙调蛋白靶向事件最好由TAMA机制描述。这种双结构域系统的一个优点是，它使单个调节蛋白能够利用MATA和TAMA机制，这取决于其两个结构域中的哪一个是靶对接的限制因素。

钙的分子机制²⁺-PKCα-C2结构域与活性膜的对接

目前对PKCα-C2结构域的研究表明，靶脂PS和PIP的局部密度₂在质膜的内叶上足以驱动钙²⁺-生理钙作用下的活性膜对接²⁺信号。在这些微摩尔Ca²⁺水平，数据支持自由C2结构域结合单个Ca的分子机制²⁺离子，然后停靠到PIP₂在与另一个钙离子和PS结合之前。方程式5总结了这种多步骤机制

其中目标脂质PIP₂和PS位于靶膜表面，星号表示膜结合蛋白。通过对单个结合步骤的分子分析，进一步加强了这种特定PKCα-C2结构域对接机制。之前已经证明，空C2结构域不含束缚Ca²⁺由于钙离子中负电荷之间的电荷排斥作用，离子不能停靠在膜上²⁺结合位点与膜的负表面电荷(7). 本模型提出仅结合一个Ca²⁺离子中和足够多的蛋白质负电荷，使其与PIP结合₂在膜表面，但不到PS，据信PS需要两个Ca²⁺离子和钙的结合²⁺结合位点(7,19). C2域与PIP的绑定₂将促进第二个Ca的后续结合²⁺离子和一个或多个PS头组到Ca²⁺结合位点。这种机制解释了Ca的低希尔系数²⁺-触发对接到含有PIP的膜₂因为单个Ca的结合²⁺离子到两个Ca中的一个²⁺如所观察到的，结合位点将表现出最小的正协同性，从而产生接近1.0的Hill系数(表2). 该机制还解释了在激活钙的微摩尔水平下观察到的膜对接反应中的慢动力学成分²⁺(表4). 提出用慢分量表示单个Ca的对接²⁺-占据C2域，在较高Ca时无法检测到²⁺当结构域中含有两个Ca时的浓度²⁺离子更快地与膜对接。该模型充分考虑了钙的协同效应²⁺，点₂和PS对膜的结合，因为高亲和力的膜对接只有在C2结构域之后才能实现，两个Ca²⁺离子，PIP₂，并且至少一个PS分子形成稳定的络合物。该模型的一个关键要素是单个Ca的结合²⁺-占用C2域到PIP₂在膜表面，这大大提高了钙²⁺第二钙亲和力²⁺结合位点，因为其与PS配体的亲近性增强。

相比之下，生理钙²⁺信号无法驱动PKCα-C2结构域与内膜对接。因为内膜缺乏可接近的PIP₂与质膜相比，PS的摩尔分数较低，两个Ca²⁺离子必须首先与C2结构域结合，然后才能与膜表面的PS对接。然而，[Ca²⁺]_1/2两个Ca的结合值²⁺自由PKCα-C2结构域的离子已知为35μM（M）(23); 因此，内在钙²⁺亲和力远低于生理钙所需的亲和力²⁺驱动内部膜附近活化和膜对接的信号。相反，平衡有利于PKCα-C2分子在生理钙作用下位于内膜附近的非结合状态²⁺信号。因此，单个Ca的能力²⁺-占用PKCα-C2结构域以绑定到PIP₂解释了细胞内靶向质膜细胞溶质小叶的精细特异性，几乎所有可到达的PIP₂位置优越，PS浓度也很高。对于全长PKCα，C1结构域与二酰甘油的结合增加了结合态的寿命(31)，与RACK等其他蛋白质也发生相互作用(70). 然而，总的来说在体外研究结果强烈表明C2域与PS和PIP的相互作用₂主导质膜靶向。

钙的分子机制²⁺-cPLA的活性膜对接₂-C2域

目前的结果表明，cPLA的特定靶向性₂内膜的α-C2结构域是由与这些膜相关的靶脂质PC的极高局部密度驱动的。细胞内部的高目标浓度降低了[Ca²⁺]_1/2膜对接到胞浆钙可到达范围的值²⁺信号。现有证据表明自由C2结构域结合两个Ca的两步分子机制²⁺离子，然后与膜结合PC对接，总结如下等式6

靶脂质PC位于膜表面，星号表示膜结合蛋白。微观对接事件的分子分析支持了这一机制。先前的研究表明，空C2结构域最初是通过其带负电荷的Ca阻止膜对接的²⁺结合位点(7). 在Ca期间²⁺信号，该结构域结合两个Ca²⁺具有正合作性的离子(45)中和钙的电荷²⁺结合位点，并允许与内膜表面的PC结合(7). 在没有膜的情况下，游离C2结构域显示出[Ca²⁺]_1/2值14μM表示两个Ca的结合²⁺离子(45)但细胞内部PC的高局部浓度将这种结合平衡推向膜对接状态，并降低有效[Ca²⁺]_1/2值，从而接近生理钙的微摩尔范围²⁺信号。PC的高局部浓度需要促进这种Ca²⁺-触发对接是由核、高尔基体和内质网所显示的密度极高、高度内陷的膜分布提供的，这些膜都含有高摩尔分数的PC(54). 相反，生理钙²⁺信号无法驱动结构域与质膜的结合，在质膜上，PC的局部浓度过低，无法带来[Ca²⁺]_1/2将膜对接到生理范围的值。

我们感谢Christina Leslie博士（科罗拉多州丹佛国家犹太医学和研究中心）批判性地阅读了这份手稿，并提供了表达cPLA的结构₂αC2域。我们还感谢Jae-Won Soh博士（韩国仁川仁川仁哈大学）提供表达PKCα全长蛋白的构建物。