大自噬（以下简称自噬）是一种高度保守的膜转运途径，负责细胞质蛋白和细胞器的周转(1,2). 该途径最初被确定为细胞对营养剥夺的反应(三,4). 然而，最近的研究表明，自噬参与了多种生理过程，包括发育过程中的组织重塑、蛋白质聚集体的去除和先天免疫反应(5,6). 在自噬过程中，一层隔离膜从一个成核部位产生，该部位被称为前自噬体结构（PAS）酿酒酵母哺乳动物的吞噬细胞组装位点(7,8). 这种双层膜包裹着附近的细胞质，最终将其靶向液泡/溶酶体进行降解。然后回收分解产物，以合成饥饿期间生存所需的大分子(9). 介导自噬的细胞成分最初描述于酿酒酵母和许多这些Atg蛋白的同源序列已经在其他真核生物中鉴定出来(10,11).
通过自噬途径的流量受到包括Tor途径在内的多个信号通路的严格控制，Tor途径负责协调细胞生长和营养物质可用性。这种控制的关键靶点之一似乎是含有Atg1蛋白激酶的蛋白质复合体(12——15). Atg1被特异性招募到PAS并激活，以应对诱导自噬的条件(7,16). 相反，大多数Atg蛋白组成性地定位于这种成核结构(17). 最近的研究表明，哺乳动物Atg1蛋白ULK1和ULK2也被征募到吞噬细胞组装位点，并在营养缺乏时被激活(18,19). 剩下的一个关键问题是，这些信号通路如何通过Atg1协同工作，以确保适当的自噬反应。
在酿酒酵母cAMP依赖性蛋白激酶（PKA）信号通路也与自噬的控制有关(13,20). 然而，这种控制的确切性质，以及它如何与Tor通路的结合，仍有一些争议(13,21). 在这篇报告中，我们表明PKA通路对适当控制自噬至关重要酿酒酵母PKA信号的抑制足以诱导强大的自噬活性，并且这种控制似乎独立发生，或与Tor途径的作用平行发生。例如，这两条途径都以Atg13为靶点，Atg13是Atg1蛋白激酶活性的关键调节器，但似乎影响该蛋白上不同的磷酸化位点集。总之，这里的数据表明PKA和Tor通路都是重要但独立的自噬调节器，Atg1蛋白激酶复合体是该通路中信号整合的关键位点。
结果
PKA通路的失活足以诱导自噬。
PKA活性的升高可以抑制自噬过程(13). 在这里，我们测试了这种信号通路的失活是否也足以诱导自噬。为了关闭PKA信号，我们使用了一种诱导型的显性负等位基因RAS2系统，称为RAS2系统阿拉22(22). 在酿酒酵母Ras蛋白Ras1和Ras2通过直接刺激腺苷酸环化酶来调节cAMP的生成，从而调节PKA的活性(23,24). 这个RAS2系统阿拉22这里使用的等位基因受来自MET3型基因，当蛋氨酸在生长介质中时被抑制的基因座(25). 我们发现RAS2的表达可以有效地诱导自噬阿拉22蛋白质，诱导动力学与雷帕霉素处理的动力学相似(A类). 此外，这RAS2系统阿拉22-介导的诱导依赖于Atg1的存在(B类). 为了直接比较抑制Tor和PKA通路的效果，我们使用了一种产生生长停滞的雷帕霉素浓度，该浓度与在甲基-3-核糖核酸2阿拉22应变。[请注意，雷帕霉素特异性抑制TORC1复合物，我们在本报告中讨论Tor信号时将提及该复合物(26).] 因此，PKA功能的下降足以阻止酿酒酵母生长导致自噬活性随之增加。这些结果与之前使用半乳糖诱导形式的RAS2系统阿拉22等位基因(13).
Ras/PKA信号通路的失活足以诱导自噬。(A类)雷帕霉素治疗后的自噬诱导和/或显性阴性表达RAS2系统阿拉22等位基因。将野生型细胞（TN125）生长到中对数期，并在30°C下用20 ng/mL雷帕霉素处理4小时。携带MET3-RAS2型阿拉22将等位基因转移到缺乏蛋氨酸的SC最小培养基中，在30°C下培养4小时，以诱导表达MET3型发起人。根据材料和方法中的描述，采用基于碱性磷酸酶（ALP）的检测评估自噬水平。白色条表示未经处理的对照组中碱性磷酸酶活性的相对水平，黑色条表示所示处理后的活性。(B类)Ras/PKA通路失活后诱导的自噬活性取决于Atg1蛋白的存在。在等基因野生型和atg1处雷帕霉素治疗4h后的Δ细胞(R（右）)或接触RAS2阿拉22蛋白质(A类). (C类)等基因生长曲线TPK1型和tpk1-作为显示了30°C下YPAD中的菌株。药物1NM-PP1以指示的浓度存在。(D类)PKA信号在tpk1-作为应变导致自噬的诱导。自噬水平通过基于碱性磷酸酶的分析在tpk1-作为用200ng/mL雷帕霉素或指示浓度的1NM-PP1处理5小时的细胞（PHY4710）。(E类)用200 ng/ml雷帕霉素或25μM 1NM-PP1处理过表达Ape1的细胞4小时，并通过Western blotting评估Ape1处理的相对水平。续，未处理细胞。
第二种灭活PKA活性的方法是使用这种酶的“类似物敏感”版本。这种蛋白激酶失活方法是由凯文·肖卡特（Kevan Shokat）及其同事首创的，涉及改变激酶活性位点内的特定残基(27,28). 在这个“把关人”位置的特殊替换使这些酶对膜溶性抑制剂敏感，如1NM-PP1(29). 在这里，我们使用了一种酵母菌株，该菌株具有TPK1型,tpk1-作为作为PKA活动的唯一来源(27,28).酿酒酵母有三个功能冗余的PKA催化亚单位，由TPK1-3型基因(30). 这个tpk1-作为这里使用的由James Broach博士慷慨提供的菌株缺乏TPK2（TPK2）和TPK3公司，并且包含的等位基因TPK1型,tpk1-M164G型对药物1NM-PP1敏感。有趣的是，我们发现1NM-PP1浓度抑制细胞生长tpk1-作为菌株还导致自噬途径的强烈诱导( C–E类和图S1和S2). 对于这些实验，自噬活性通过三种不同的分析进行评估，如材料和方法因此，通过两种不同的方法抑制PKA信号导致自噬活性的诱导，类似于Tor通路失活时观察到的自噬活动。这些结果意义重大，因为它们与最近的一项研究相矛盾，该研究表明PKA活性的丧失不足以诱导自噬(21). 后一项研究还使用了含有PKA类似物敏感版本的酵母菌株；该菌株与tpk1-作为这里使用的应变。然而，之前的研究使用的1NM-PP1浓度仅为0.1μM，该浓度对tpk1-作为应变，应变(C类). 因此，观察到的低水平自噬可能是由于类似物敏感细胞中残留的PKA活性所致。总之，我们这里的数据表明PKA通路的失活足以诱导自噬活性酿酒酵母细胞。
Atg13是体内外PKA的底物。
Atg13蛋白与Atg1发生物理性相互作用，并且是体外完全Atg1蛋白激酶活性所必需的(14,31——35). 虽然这种激活的机制基础尚不清楚，但Atg1-Atg13相互作用酿酒酵母似乎受到Tor信号活性的调节。最近的一项研究也确定Atg13是该芽殖酵母中PKA的候选底物(20). 该鉴定基于Atg13与PKA共识磷酸化位点存在进化保守的匹配。两个位点与R-R-x-S/T-B的一致性非常相似，其中x指任何氨基酸，B指疏水性残基（位点2和3；A类) (36). 还发现了第三个偏离共识的保守位点（位点1）。我们发现每个位点在体外都被PKA磷酸化，所有三个位点的改变都导致Atg13磷酸化降低95%以上（Atg13-AA； B类和C类和图S3). 利用一种特异识别磷酸化PKA位点的抗体进行的检测在体内也观察到类似的结果(D类) (37,38). 在这些实验中，从细胞提取物中沉淀出Atg13，并用此α-底物抗体通过Western blotting评估PKA磷酸化水平。这种Atg13信号在磷酸酶处理后丢失，随后与PKA和ATP孵育后恢复(D类). 此外，这种体内信号在PKA活性水平升高的细胞中升高(E类). 最后，PKA活性失活后，α-底物抗体对Atg13的识别丢失(F类). 总之，这些数据表明Atg13是PKA的直接底物酿酒酵母.
Atg13蛋白是PKA的底物。(A类)显示了Atg13中PKA磷酸化的三个保守位点。(B类和C类)Atg13的体外磷酸化依赖于上述三个PKA位点的存在。从酵母细胞中沉淀出所示的Atg13变体，并与[γ-32P] ATP和牛PKA（bPKA）（inB类)或酿酒酵母Tpk1型(C类). S、 丝氨酸；A、 丙氨酸。(D类)Atg13的体内磷酸化需要三个PKA位点。用α-HA抗体从酵母细胞提取物中免疫沉淀显示的Atg13蛋白，并用λ磷酸酶处理，然后用bPKA和3 mM ATP孵育，如图所示。用识别磷酸化PKA位点的α-底物抗体进行蛋白质印迹来评估PKA磷酸化水平。(E类)在一株过度表达Tpk1的菌株中，Atg13上PKA磷酸化的体内水平升高。(F类)PKA失活后，α-底物抗体失去识别能力。这个tpk1-作为菌株与10μM 1NM-PP1孵育4h，用α-底物抗体进行Western blotting检测Atg13的PKA磷酸化水平。
Atg13上PKA磷酸化的缺失与自噬的诱导有关。
已证明体外Atg1激酶活性需要Atg13(14). 在这里，我们利用先前关于该蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的流动性的观察结果，测试了该蛋白在体内是否也需要Atg1活性(14,20). 特别是，自磷酸化被发现会延缓Atg1在这些凝胶中的流动性，这种缓慢迁移带的存在可以作为体内Atg1激酶活性的指示物(A类). 我们发现，雷帕霉素处理后，缓慢迁移型Atg1的比例增加(A类). 缺乏Atg13或Atg17的细胞中没有Atg1的激活；这些突变体是唯一的自动变速箱所测试的菌株在这种Atg1自磷酸化中表现出显著缺陷。因此，Atg1蛋白激酶活性在体内需要Atg13。
Atg13上PKA磷酸化的丧失先于Atg1的激活和自噬的诱导。(A类)体内Atg1自身磷酸化需要Atg13和Atg17。从指定的酵母菌株制备细胞提取物，并通过Western blotting评估自身磷酸化Atg1的水平。在30°C下用200 ng/mL雷帕霉素处理细胞0或2小时。这个atg1处KD（分子量）菌株具有激酶缺陷型等位基因自动液位计1,在g1-K54A在底部面板中，从酵母细胞提取物中免疫沉淀Atg1，然后用λ磷酸酶处理，如图所示。(B类)在将25μM 1NM-PP1添加到培养基中后的指定时间，通过Western blotting评估PKA（顶部面板）和“激活”形式的Atg1（底部）的Atg13磷酸化的相对水平tpk1-作为细胞。(C类)将25μM 1NM-PP1添加到tpk1-作为细胞。(D类)在培养基中加入25μM 1NM-PP1后4 h，通过荧光显微镜评估Atg1-YFP蛋白的定位tpk1-作为细胞。
我们使用了tpk1作为上述菌株用于检测Atg13的PKA磷酸化与Atg1激酶活性和自噬诱导之间的时间关系。我们发现，用1NM-PP1药物治疗30分钟后，Atg13的PKA依赖性磷酸化基本消失(B类). 此时，Atg1激酶活性的最初迹象是明显的，但缓慢迁移型Atg1的比例在以后的时间点继续增加(B类). 自噬活性也以类似的方式增加(C类). 最后，我们发现PKA通路的这种失活也导致Atg1从细胞质重新定位到PAS(D类). 因此，这些数据表明，Atg13磷酸化的丢失先于Atg1的激活和自噬途径的诱导。
PKA磷酸化调节Atg13与PAS的结合。
如前所述，我们发现Atg13在生长细胞中主要是细胞质，并且在营养限制时与PAS相关(A类). 在这里，我们测试了PAS的这种定位是否受到PKA磷酸化的调节。一个明确的先例是PKA磷酸化已被证明抑制Atg1的PAS关联(20). 我们发现Atg13-AA变异体在生长细胞和氮保护细胞中都定位于PAS(A类和图S4). 此外，野生型Atg13（Atg13-SSS）与PAS的关联被PAS的存在所抑制RAS2系统值19导致PKA活性构成水平升高的等位基因(39). 这种抑制依赖于PKA位点，因为Atg13-AA蛋白仍然组成性地定位于PASRAS2系统值19单元格(A类和图S4). 最后，我们发现野生型Atg13蛋白在Ras/PKA途径失活后被招募到PAS中(B类). 因此，这些数据与调节Atg13与PAS关联的PKA磷酸化一致。
Atg13的PAS定位受PKA磷酸化的调节。(A类)对含有所示YFP-Atg13融合蛋白的细胞进行荧光显微镜检查。Atg13蛋白具有三个PKA位点的野生型（Atg13-SSS）或非磷酸化版本（Atg13-AA）。CFP-Atg11融合蛋白存在于所有细胞中，并作为PAS的标志物。这个RAS2系统值19指示菌株中存在等位基因。将细胞从SC葡萄糖最低培养基转移到SD-N培养基中，在30°C下培养1h，即可实现氮饥饿。(B类)通过荧光显微镜评估所示细胞中野生型Atg13-YFP蛋白的定位。答22,RAS2系统阿拉22. (C类)为了将Atg13-AAA有效定位到对数期细胞中的PAS，需要Atg17。显示了所示菌株空泡周围点状斑点中存在Atg1-AA或Atg13-AA的细胞比例(20). 每个菌株至少检查50个细胞图像。(D类)中指示菌株的代表性图像C类. (E类)Atg13中PKA磷酸化位点的改变影响了与Atg17的相互作用。从酵母细胞提取物中免疫沉淀所示的Atg13蛋白，并通过蛋白质印迹评估相关的Atg17的相对水平。细胞提取物是从中对数期培养物（log）或用雷帕霉素（Rap）处理的细胞中制备的。S、 附件13-SSS；A、 附件13-AAA。
以前的研究表明，Atg13与许多蛋白质相互作用，最显著的是Atg1和Atg17(40——42). 由于Atg17被建议在组织PAS中发挥作用，我们测试了Atg13-AA的PAS关联是否依赖于Atg17的存在(43——45). 事实上，我们发现Atg13-AA变异体对缺乏Atg17的细胞中的PAS的靶向性较差( C类和D类). 此外，Atg13-AA与Atg17的相互作用比野生型Atg13蛋白更强，并且这种相互作用不再受雷帕霉素处理的影响(E类) (41). 相反，Atg13-AA似乎与Atg17构成关联。相反，PKA位点的改变并没有显著影响Atg1-Atg13相互作用(图S5A类). 最后，发现Atg17与生长细胞和氮储存细胞中的PAS相关，并且这种定位不受RAS2系统值19(图S5B类) (40,45). 因此，PKA显然通过干扰其与Atg17的相互作用来调节Atg13的PAS关联，至少部分是这样。
PKA和Tor通路独立靶向Atg13蛋白。
PKA和Tor通路的同时失活产生的自噬诱导比单独失去任一通路时更快、更大(A类和A类). 这一结果与这些途径相互独立地控制自噬是一致的。为了检验这种可能性，我们测试了关闭其中一条通路会如何影响另一条通路的活动。在这些实验中，我们使用Atg13的PKA和Tor依赖性磷酸化作为各自信号通路活性的报告者。我们发现，雷帕霉素治疗后，PKA导致的体内Atg13磷酸化水平没有降低(B类). 此外，Ras/PKA通路的失活并未导致Atg13上Tor依赖性磷酸化的丢失(C类). 后一种磷酸化导致Atg13在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上广泛涂抹。雷帕霉素治疗后，这种涂片迅速塌陷成一条紧密、快速迁移的带(C类) (14,46). 最后，PKA对Atg13的体外磷酸化并没有改变该蛋白在SDS-聚丙烯酰胺凝胶中的流动性（参见). 因此，尽管Atg13上Tor依赖性磷酸化位点的精确位置尚未确定，但这些位置似乎与此处描述的PKA位点不同。总之，这些数据与独立控制自噬的Tor和PKA途径一致。
PKA和Tor通路独立靶向Atg13以控制自噬活性。(A类)PKA和Tor通路的同时失活导致自噬反应升高，这与任一通路的缺失有关。自噬水平通过基于碱性磷酸酶的分析在tpk1-作为用25μM 1NM-PP1、200 ng/mL雷帕霉素或这两种试剂处理指定时间的细胞。所示数据来自一个代表至少三个独立重复的单一实验。(B类)Tor通路失活后，Atg13的PKA磷酸化没有减少。用20（Lo）或200（Hi）ng/mL雷帕霉素处理2小时后，从细胞中免疫沉淀Atg13。随后用α-PKA底物抗体进行Western blotting检测PKA磷酸化水平。(C类)Ras/PKA通路的失活不影响Atg13的Tor依赖性磷酸化。从指示的细胞制备细胞提取物，并通过Western blotting评估Atg13的Tor依赖性磷酸化水平。在左侧车道中，单元格包含MET3-RAS2型阿拉22将（A22）或对照质粒（-）在无蛋氨酸培养基中培养6小时，以便从MET3型发起人。在中间车道tpk1-作为菌株PHY4710与0或5μM 1NM-PP1孵育4h。中间通道底部的面板显示了Atg13上PKA磷酸化的水平，通过α-PKA底物抗体的Western blotting进行评估。注意，Atg13“涂片”的相对扩散取决于凝胶的运行条件。(D类)描述PKA和Tor通路在控制自噬中的拟议作用的模型。虚线表示Atg1和Atg13相互作用或PAS（可能还有Atg17），实线表示PKA和/或Tor途径对这些相互作用的调节作用。有关其他详细信息，请参阅文本。
讨论
自噬是一种非特异性降解过程，必须严格控制，以防止细胞生长所需物质的不当周转。这里的工作通过证明Ras/PKA通路是细胞自噬的重要调节器，增加了我们目前对这一过程的理解酿酒酵母通过两种不同的方法使该信号通路失活足以强烈诱导自噬活性。这种控制似乎是通过Atg1复合物来实现的，因为Atg1本身和Atg13（该激酶的关键调节因子）都被证明是PKA的直接底物(20) (). 对于这两种蛋白质，这种磷酸化似乎可以调节与PAS的关联。有趣的是，这里的数据表明，PKA的这种控制与Tor通路的作用无关。例如，尽管这两条途径都调节Atg13磷酸化，但每一条似乎都控制着一组不同的磷酸化事件。总之，该报告表明Atg1/Atg13复合物是自噬途径中信号整合的重要点。这种复合物作为调节控制点的相关性可能在进化上是保守的，因为Atg1和Atg13都被发现是其他真核生物Tor途径的靶标(32,33,35,47).
自噬途径酿酒酵母因此似乎处于至少两个独立监管输入的控制之下。下面给出了一个模型，试图总结我们目前对该法规的理解D类在该模型中，PKA活性特异性抑制Atg1和Atg13的PAS关联。相反，Tor途径似乎影响这种定位和激活Atg1激酶活性所必需的Atg1-Atg13相互作用(14). 因此，Tor通路的失活将导致PAS处活性Atg1-Atg13复合物的形成，并随后诱导自噬(1). 然而，PKA活性丧失后，Atg1酶是如何被激活的尚不清楚。一种可能性是，PAS处Atg1和Atg13局部浓度的增加足以抵消Tor活性对Atg1-Atg13相互作用的抑制作用。或者，Atg13可以在PAS处选择性去磷酸化。虽然需要进一步的实验来区分这些可能性，但这里的工作表明PKA信号的丢失会导致Atg1活性的增加和自噬的诱导。另一个问题是，为什么调控自噬可能需要一个以上的信号通路。一个有趣的可能性是，这些途径对不同的营养线索作出反应，不同类型的饥饿可能会在细胞中引发不同的自噬反应(48). 因此，这些多重输入的存在将为电池提供更大的灵活性，以应对不断变化的环境条件。因此，确定这些途径如何影响降解过程，以及这些信号活动如何协调，是未来工作的重要问题。
材料和方法
其他方法，包括生长条件和质粒构建的描述，包括SI文本.
酵母菌株的构建和生长条件。
本研究中使用的酵母菌株为PHY1220(垫子α他的3-Δ200 leu2–3112 lys2–801 trp1–101 ura3–52 suc2-Δ9)，PHY1942（PHY1220prc1:：HIS3 pep4Δ：：LEU2 prb1Δ：：hisG)，TN125(MATa ade2 his3 leu2 lys2 trp1 ura3 pho8:：pho8Δ60)，YYK126（TN125atg1处Δ：：LEU2)，YYK130（TN125第13天Δ：：TRP1)，PHY3687（TN125atg1处Δ：：LEU2 atg13Δ：：kanMX)、Y3175(ade2–1可以1–100 his3–11，15 leu2–3112 trp1–1 ura3–1 tpk2：：KAN tpk3：：trp1 tpk1-M164G)和PHY4710（Y3175第8页：：第8页Δ60). 后一种菌株是通过将之前描述的质粒PTN9整合到Y3175中而产生的(49). 携带MET3-RAS2型值19或MET3-RAS2型阿拉22等位基因在含有500μM蛋氨酸的培养基中生长，以保持MET3型启动子处于被抑制状态。来自的表达式MET3型启动子是通过将细胞转移到缺乏蛋氨酸的培养基中诱导的。来自的表达式CUP1大学通过添加100μM CuSO诱导启动子4培养基中。该药物，1NM-PP1，由Kevan Shokat慷慨提供。
免疫印迹法和免疫沉淀法。
蛋白质抽提物用于蛋白质印迹是通过前面描述的玻璃珠裂解方案制备的(13). 所得蛋白提取物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上分离，并在4°C下转移到硝化纤维素膜（Hybond ECL，Amersham Biosciences）。用适当的一级和二级抗体对膜进行探测，并使用超信号化学发光底物（Pierce）照亮反应带。免疫沉淀实验按所述进行(37,38).
自噬试验。
如所述进行自噬活性的碱性磷酸酶（ALP）测定(13,49). 该分析通过自噬途径测量改变形式的Pho8磷酸酶的递送和随后的激活。另外两项检测评估了氨肽酶I（Ape1）的加工和自噬体的积累，并在SI文本.
PKA磷酸化分析。
一般来说，体外磷酸化检测是使用酵母控制下的HA表位标记蛋白进行的CUP1大学酵母菌株PHY1942中的启动子。菌株在含有2%葡萄糖的选择性SC最小培养基中生长至中对数期，并用100μM硫酸铜诱导90分钟。在α-HA抗体树脂（Roche）上分离HA表位标记的Atg13变体，并与[γ-32P] ATP（PerkinElmer）和5U牛PKA催化亚单位（Sigma），如前所述(20,38). 用α-HA抗体（Sigma）进行免疫印迹控制，以评估每个样本中Atg13的相对含量。
如前所述，用α-PKA底物抗体（细胞信号传导）评估体内PKA磷酸化水平(37,38). 简要地，t吨从酵母细胞提取物中免疫沉淀底物蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离，并用1:2000浓度的α-PKA底物抗体进行Western blotting评估PKA位点的相对占有水平。
荧光显微镜。
CFP-Atg11、YFP-Atg13和YFP-Atg17融合受酵母诱导启动子的控制CUP1大学基因。通过添加100μM CuSO诱导这些融合蛋白的表达4在30°C下保持1小时。按照描述对样品进行成像(20).
