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美国国家科学院院刊。2008年5月13日；105(19): 7070–7075.
2008年4月28日在线发布。 数字对象标识：10.1073/pnas.0711845105
预防性维修识别码：项目经理2383971
PMID：18443288

Pink1通过与裂变/融合机制的相互作用调节线粒体动力学

杨玉凤,*† 英石欧阳,*† 杨利川,‡ M.Flint Beal先生,‡ 安格斯·麦克奎班,§ 汉内斯·沃格尔,*和陆炳伟*†
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

线粒体形成动态管状网络，通过分裂和融合进行频繁的形态变化，其失衡通常会影响细胞存活，尤其会影响神经元的突触传递和可塑性。线粒体裂变/融合机制的一些核心组成部分，包括动力学样GTPases Drp1、Mitofusin、Opa1和Drp1相互作用蛋白Fis1已被鉴定。在正常条件下，裂变和融合过程是如何调节的，线粒体裂变/融合缺陷在多大程度上与各种疾病有关，目前尚不清楚。线粒体功能障碍往往会导致具有脑和骨骼肌表现的疾病，并与帕金森氏病（PD）等神经退行性疾病有关。线粒体异常分裂或融合在帕金森病发病机制中是否起作用尚不清楚。这里，我们显示Pink1，一种与家族性PD相关的线粒体靶向Ser/Thr激酶，与线粒体裂变/融合机制发生遗传性相互作用，并调节线粒体动力学。促进线粒体分裂抑制的基因操作果蝇粉1间接飞行肌和多巴胺神经元的突变表型，而裂变减少则有相反的效果。在果蝇属Pink1的过度表达促进线粒体分裂，而抑制Pink1则导致过度融合。我们的基因相互作用结果表明，Fis1可能在Pink1和Drp1之间起作用，控制线粒体分裂。这些结果揭示了Pink1的细胞生物学作用，并确立了线粒体裂变/融合作为PD研究的范式。调节线粒体分裂/融合的化合物可能在PD干预中具有治疗价值。

关键词：果蝇属，帕金森氏症，肌肉，神经退行性变，线粒体形态发生

帕金森氏病（PD）是最常见的运动障碍，其特征是多巴胺（DA）神经元的相对选择性变性。尸检研究已确定与PD相关的共同特征，如线粒体功能障碍、氧化应激和异常蛋白聚集(1,2). 虽然大多数PD病例是散发的，但最近的研究强调了遗传因素在PD发病机制中的重要性(2,三). 至少有10个不同的基因座与PD家族型相关。了解与这些FPD基因相关的分子病变有助于阐明更常见疾病的发病机制。有趣的是，使用动物模型和细胞培养模型的研究已经将FPD基因的突变与线粒体结构/功能的损伤联系起来。此外，一些疾病相关蛋白已被证明存在于线粒体中或与线粒体蛋白相互作用(4——7)，加强了线粒体功能障碍在PD发病机制中的普遍参与。

Pink1的最新研究为线粒体功能障碍在PD发病机制中的因果作用提供了直接支持。Pink1编码带有预测线粒体靶向信号的预测Ser/Thr激酶(5). 在果蝇属dPink1失活导致间接飞行肌（IFM）变性、DA神经元丢失、感光细胞丢失和雄性不育(8——11). 这些影响通常伴随着受影响组织线粒体的形态和功能缺陷。值得注意的是，至少在IFM中，异常线粒体的出现先于组织退化(8)，支持线粒体功能障碍在dPink1诱导的肌肉细胞死亡中的致病作用。此外，基因研究果蝇属发现Parkin在Pink1下游起作用，以维持线粒体功能和组织完整性(8——10).

尽管进行了这些研究，Pink1调控的确切线粒体过程仍然难以捉摸。受到dPink1失活诱导的线粒体形态表型的启发，我们研究了Pink1是否调节线粒体分裂/融合，这是控制真核生物线粒体形态的动态膜重塑过程(12). 我们的结果表明，dPink1与线粒体分裂/融合机制的组成部分存在遗传相互作用，并调节线粒体动力学。我们的发现将线粒体分裂/融合与PD发病机制联系起来，并建议了解和治疗PD及相关疾病的方法。

结果

Pink1和线粒体分裂和融合途径成分之间的遗传相互作用。

dPink1突变体肌纤维变性前IFM中线粒体肿胀(8)表明线粒体形态发生缺陷是dPink1失活的主要影响。为了测试这种可能性，我们操纵了线粒体分裂和融合途径的活动。通过引入额外的Drp1拷贝增加线粒体分裂(13)是裂变机制的关键部件，有效地挽救了由dPink1突变体的IFM退化引起的翅膀姿势表型[图1 B和F类和支持信息（SI）表S1和S2]. 相反，Drp1杂合性显著增强了dPink1突变表型(表S1). 类Opa1杂合性(14)是融合机制的核心组件，也显著抑制了dPink1突变表型(图1 C和G公司和表S1和S2)尽管这种影响在老年动物中有所减弱。Drp1或Opa1-like的类似操作不会影响DJ-1a抑制引起的视网膜变性表型(15)，一个果蝇属影响线粒体功能的另一个家族性帕金森病基因的同源物(图S1). 这一结果证明了dPink1和线粒体裂变/融合基因之间遗传相互作用的特异性。

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促进线粒体分裂抑制由d粉红色1功能丧失。(A–D)以下基因型5日龄成虫的翅膀姿势表型：d粉红色1B9公司（或B9公司) (A类)，d粉红色1B9公司；Drp1额外副本(B)，d粉红色1B9公司；Opa1类/+ (C)、和野生型控件(D类). 箭头指向中的异常机翼姿态A类和正常姿势B–D类. (E–H（E–H）) (上部)具有以下基因型的5日龄成年苍蝇胸部的纵剖面图：d粉红色1B9公司(E类)，d粉红色1B9公司；Drp1额外副本(F类)，d粉红色1B9公司；Opa1类/+ (G公司)、和控制(H（H）). (下部)相应IFM的放大视图。用甲苯胺蓝对5日龄成虫的树脂包埋胸膛切片进行染色，以观察组织形态，尤其是肌肉结构；前面是左边。箭头指向IFM。(I–L型)上述相应基因型5日龄成虫IFM超微结构的透射电镜分析。箭头指向线粒体(M（M）)添加了的表达式图纸1或丢失一份Opa1类抑制因脑内多巴胺（DA）含量减少而引起的d粉红色1对两周大的苍蝇进行DA测量。*，P（P）<0.01，单因素方差分析。

接下来，我们检查了获救动物IFM中的组织完整性和线粒体形态。在对照动物中，纺锤形IFM纤维以有组织的方式排列，线粒体填充在肌肉纤维之间(图1L（左）). 这些线粒体含有电子致密物质和嵴。在dPink1突变体中，IFM纤维纤细、萎缩且无组织(图1我). 一些线粒体明显增大，内膜紊乱或崩解，总电子密度降低(图1我). Drp1过度表达可恢复线粒体形态和IFM形态和组织(图1J型). Opa1样杂合子也显示出有效的挽救作用(图1K（K）). 在其他野生型背景下，Drp1过表达或Opa1样杂合子对IFM组织或线粒体形态几乎没有影响(图S2). 线粒体分裂和融合基因对dPink1突变体IFM病理学的拯救与线粒体形态的恢复相关。

为了测试dPink1和线粒体裂变/融合基因之间的遗传相互作用是否发生在其他组织中，我们分析了DA神经元。dPink1失活导致DA神经元功能障碍，如大脑DA水平降低所示(8,9). 在dPink1-null突变背景下，Drp1过表达将DA水平恢复到正常水平(图1M（M）). Opa1样杂合子也显示出挽救作用(图1M（M）)，尽管不如Drp1过度表达那么稳健。过表达Drp1或Opa1样杂合的dPink1突变体具有正常数量的多巴胺能神经元（数据未显示）。需要注意的是，大脑DA水平降低的程度（≈50%）远大于dPink1-null突变体中出现的轻微或无DA-神经元丢失(9,10)这表明，除了促进DA神经元存活外，Pink1可能在调节多巴胺能生理学（如DA代谢、储存或传递）方面发挥更显著的作用。

Pink1与线粒体分裂/融合蛋白合作调节DA神经元的线粒体形态发生。

接下来，我们使用靶向GFP的线粒体基质的mito-GFP报告子，研究了操纵分裂/融合基因对dPink1突变体DA神经元线粒体形态的影响。使用酪氨酸羟化酶（TH）-Gal4驱动因子在DA神经元中表达mito-GFP。mito-GFP报告者清楚标记了线粒体网络，其中包含管状和点状单位(图2A类,A′、和J型). 我们重点分析了背外侧前脑后部（PPL1或DL1）簇中的DA神经元。在dPink1突变或dPink1RNAi动物中，形成了显著的线粒体聚集体。此外，还经常观察到管状结构(图2 B,B′,C,C′,E类、和J型). 在dPink1突变体的其他DA神经元簇中也观察到线粒体-GFP聚集体（数据未显示）。然而，在过度表达Drp1的dPink1突变体中，线粒体聚集体不再形成，线粒体-GFP信号均匀分布在整个细胞体中(图2 F类和J型)，如控件中所示(图2 A类,A′,D类、和J型). 去除一个Drp1拷贝可逆转额外拷贝所赋予的Drp1过度表达的拯救作用(图S3A类). 通过在野生型背景中引入额外拷贝，Drp1过度表达对线粒体网络形态没有明显影响(图2 G公司和J型). 同样，Opa1类杂合子在野生型背景中也没有明显影响(图2 我和J型)，但它抑制了dPink1突变体中的线粒体聚集(图2 H（H）和J型). 相反，线粒体锰超氧化物歧化酶的一个拷贝丢失(二氧化锰)该基因对dPink1突变表型没有影响(图S3D类). 这些结果与dPink1特别影响线粒体裂变/融合动力学一致。

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线粒体分裂的上调可防止多巴胺神经元因线粒体分裂丢失而聚集d粉红色1. (A–C)以下基因型5至7日龄成年苍蝇背外侧前脑后部（PPL1或DL1）簇状DA神经元的整体免疫染色：TH-铝4>UAS-丝裂原纤维蛋白(A类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；d粉红色1B9公司(B)、和TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1 RNAi(C). (A–C) (左侧)GFP免疫染色监测线粒体(居中)TH免疫染色标记DA神经元。(赖特)合并的图像。(D–I型)通过可视化5至≈7天龄以下基因型成虫PPL1簇神经元内的丝裂原纤维蛋白（mitoGFP）对线粒体进行实时成像：TH-铝4>UAS-丝裂原纤维蛋白(D类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；d粉红色1B9公司(E类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；d粉红色1B9公司；Drp1额外副本(F类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；Drp1额外副本(G公司)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；d粉红色1B9公司,Opa1类/+ (H（H）)、和TH-铝4>UAS-mitoGFP；类似Opa1/+ (我).A′,B′、和C′显示线粒体网络的高倍视图A–C分别是。箭头，聚集线粒体；箭头、管状线粒体(J型)量化含有直径为1-2μm或>2μm的线粒体聚集物的DA神经元的百分比。注意，直径>2μm的线粒体聚集体几乎只在d粉红色1突变体。*，P（P）<0.01，单因素方差分析。

Pink1过度表达也会导致DA神经元线粒体形态发生异常。

为了测试dPink1是否足以诱导线粒体形态的改变，我们在DA神经元中过度表达。令人惊讶的是，dPink1的过度表达也诱导了线粒体聚集(图3 A类和A′). 然而，与dPink1突变体不同的是，dPink 1过度表达神经元中的非聚集线粒体呈球形，很少观察到管状结构。此外，Drp1过度表达(图3F类)或Opa1样杂合性(图3H（H）)不能修改这种dPink1过度表达效应，这表明dPink 1突变体和dPinkl过度表达神经元中的线粒体聚集体本质上不同。为了进一步验证这一点，我们测试了Parkin在这些背景下过度表达的影响。Parkin过度表达可有效抑制dPink1突变表型(8——10). Parkin过度表达可有效阻止dPink1突变体中mito-GFP聚集体的形成(图3B)，但不在dPink1过度表达背景中(图3C). 有趣的是，仅在野生型背景中Parkin过度表达也导致线粒体表型类似于dPink1过度表达(图3D类). 为了排除这种表型不是由过度表达引起的可能性，我们在DA神经元中过度表达DJ-1a。在这种情况下，对线粒体形态没有明显影响(图S3B). 尽管仅在这两种情况下线粒体形态都异常，但线粒体形态通过dParkin过度表达和dPink1功能丧失的联合作用得以恢复，这一事实强烈表明这两种操作对线粒体动力学产生相反的影响。Pink1或Parkin的过度表达对DA神经元的功能没有不利影响，这进一步支持了两种线粒体状态之间的功能差异(8)，而Pink1的抑制则起作用。在IFM或眼睛中过度表达Pink1也没有影响（数据未显示）。最近的一项研究表明，Pink1过度表达可诱导轻度的粗糙眼表型(16)，其生理相关性仍有待测试，因为dPink1-null突变苍蝇没有表现出任何眼睛表型。

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dPink1过度表达导致DA神经元线粒体形态学改变。(A类)5至≈7日龄基因型成虫PPL1簇DA神经元的整体免疫染色TH-铝4>UAS-丝裂原纤维蛋白,无人机-dPink1. (左侧)丝裂原纤维蛋白免疫染色。(居中)TH免疫染色(赖特)合并的图像。(B–H型)以下基因型5至≈7日龄成年苍蝇PPL1簇神经元内线粒体的实时成像：TH-铝4>UAS-mitoGFP；d粉红色1B9公司；UAS-d停车场B,TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1；UAS-dParkin C公司,TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-D停车场D,TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1型(E类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1；Drp1额外副本(F类)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1；图纸1/+ (G公司)，TH-铝4>UAS-mitoGFP；UAS-dPink1型,Opa1类/+ (H（H）).A′显示线粒体网络的高倍视图A类. (我和J型)1周龄培养的野生型苍蝇DA神经元呈现标点样的代表性图像(我)和线状的(J型)神经元突起中的线粒体。左图显示了一般神经元培养的亮视野显微镜视图(上部)和TH+线粒体标记有线粒体-GFP的神经元(下部); 右图显示TH神经炎线粒体的放大图+神经元。箭头指向轴突中典型的线状管状线粒体。(K（K）)TH百分比的统计分析+所示基因型中具有线状管状线粒体的神经元。平均≈200 TH+对每个基因型的神经元进行计数，P（P）<0.01，单因素方差分析。

在dPink1过度表达背景中看到的线粒体聚集表型可能是由线粒体过度分裂引起的，正如在过度表达表达蛋白Fis1的哺乳动物细胞中观察到的那样(17,18). 我们开始通过移除dPink1过度表达背景中的一个Drp1拷贝来减弱裂变来测试这种可能性，但没有观察到明显的效果(图3G公司). 可能需要通过其他方式加强线粒体裂变的衰减，以减轻dPink1过度表达的影响。

为了进一步测试dPink1在调节线粒体动力学方面的活性，我们分析了培养的DA神经元的线粒体形态，这使线粒体网络和单位，特别是在神经元过程中，能够得到更好的分辨率。在DA神经元中特异表达mito-GFP的对照神经元培养物中，大多数神经元具有点状短线粒体(图3我)只有少数含有管状线粒体(图3J型). 然而，在dPink1突变神经元培养中，有更多的神经元具有管状线粒体(图3K（K）). 相反，dPink1过表达后，具有长管状线粒体的神经元数量显著减少(图3K（K）). 这些结果支持dPink1促进线粒体分裂的观点。

培养S2R细胞中Pink1和Drp1之间关系的表征。

为了获得更多关于dPink1活性及其与裂变机制关系的信息，我们使用了果蝇属S2R细胞，可以通过RNAi有效地敲除基因。S2R细胞的较大尺寸也可以更好地成像体细胞中的线粒体网络。在转染gfp-dsRNA的对照细胞中，线粒体均匀分布为点状单位和管状片段(图4A类). 转染Drp1 dsRNA可降低Drp1 mRNA水平(图S4)导致线粒体网络崩塌成一个大的核周聚集物(图4C). dPink1 dsRNA的转染导致了类似的表型(图4B和图S4)尽管频率较低（dPink1 RNAi为35.6±5.2%，而Drp1 RNAi为97.5±3.6%）。为了进一步测试Drp1和Pink1之间的功能关系，我们进行了Drp1与dPink1双RNAi。在这些细胞中，线粒体的核周聚集持续存在。值得注意的是，在单一RNAi条件下观察到了一种独特的表型，表现为线粒体的长而连续的丝线，表明其极度融合（27.6±5.4%）(图4D类). Drp1和另一个关键线粒体基因的双RNAi二氧化锰没有同样的效果(图S5)这表明线粒体功能的破坏不会导致线粒体的极端融合，Pink1和Drp1在调节线粒体形态方面的相互作用是特定的。

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Pink1和裂变基因在调节线粒体动力学中的遗传相互作用果蝇属以及哺乳动物细胞。(A–D)S2R细胞线粒体受以下基因操作的实时成像：绿色荧光粉RNA干扰(A类)，d粉红色1RNA干扰(B)，图纸1RNA干扰(C)，d粉红色1和图纸1双RNAi(D类). 注意线粒体聚集的类似表型（箭头）由d粉红色1RNAi和图纸1尽管RNAi在以下情况下的百分比较低d粉红色1RNAi。箭头指向延伸到线粒体簇之外的连续细线粒体小管，线粒体簇仅出现在D类.S2R细胞大小不均匀。两种类型的细胞，尺寸较小(左侧)而且尺寸更大(赖特)，显示了每个基因操作。两种大小的细胞的效果相似。(E类和F类)S2R细胞线粒体受以下基因操作的实时成像：d粉红色1RNAi加EGFP转染(E类);d粉红色1RNAi加EGFP-dFis1转染(F类). EGFP-dFis1型(E类)但不是EGFP(F类)抑制线粒体聚集d粉红色1RNAi。箭头标记聚集的线粒体(G公司)MitoTracker红染色显示，哺乳动物COS-7细胞中的线粒体形态分为七类，从极度融合（I型）到极度分裂（VII型）。这些类别是根据以下线粒体特征任意定义的：I，核周聚集物和长而连续的小管；二、 广泛的长管状网络；三、 中长管网；四、 短管状线粒体和点状单位的混合物；V、 中心有孔的小圆管；六、 小点；七、 球形聚集体类似于过度表达Pink1或Parkin的DA神经元。为了突出I类和VII类之间的差异，I类而非VII类中存在的长管状线粒体线用箭头标记。(H（H）和我)统计分析显示hPink1过表达促进线粒体分裂，而Drp1过表达可阻止线粒体分裂K38A公司(H（H）)而hPink1 RNAi促进COS-7细胞中的线粒体融合，这是由hFis1或hDrp1过度表达所拯救的(我). 定量显示融合典型的II型和III型细胞形态与裂变典型的V型和VI型细胞形态的比率。*，P（P）<0.01，单因素方差分析。

Pink1与Fis1相互作用调节线粒体形态发生果蝇属和哺乳动物细胞。

为了进一步研究Pink1在线粒体裂变中的作用，我们探索了Pink1和裂变途径中另一个关键参与者Fis1之间的功能关系。转染EGFP-dFis1融合蛋白而非EGFP可有效抑制dPink1 RNAi引起的线粒体聚集表型果蝇属S2R电池(图4 E类和F类)（EGFP-dFis1为3.6±1.2%，EGFP为41.8±6.6%）。相反，EGFP-dFis1不能抑制由Drp1 RNAi引起的类似表型(图S6).

为了测试Pink1和Drp1/Fis1之间的功能关系在哺乳动物中是否保守，我们使用了具有动态线粒体网络的COS-7细胞(图4G公司和图S7)，并且可以高效转染。hPink1而非hPink1ΔC的过表达导致更多的细胞具有点状线粒体，而hFis1 RNAi或显性阴性Drp1（Drp1K38A）的过表达导致更多的细胞具有长管状线粒体(图4H（H）). 在hPink1过度表达背景下，Drp1K38A的过度表达也导致更多细胞具有长管状线粒体(图4H（H）)表明Drp1可能作用于Pink1的下游。然后我们检测了Pink1基因敲除对COS-7细胞的影响。Pink1 shRNA而非对照shRNA的表达降低了hPink1 mRNA水平(图S8)导致更多的细胞具有长管状线粒体(图4我). hFis1或Drp1的过度表达显著抑制了这种效应(图4我). 这些结果与Pink1、Fis1和Drp1是线粒体分裂的保守正调控因子以及Drp1和Fis1对Pink1上位性一致。

讨论

线粒体分裂和融合是控制细胞凋亡的膜重塑过程体内线粒体网络的分布和结构的动态变化。这些过程响应细胞的能量状态，是线粒体正常功能所必需的。线粒体分裂/融合功能障碍与神经退行性疾病的发病机制有关。例如，Opa-1的突变与常染色体显性视神经萎缩有关(19)而Mfn2突变导致常染色体显性遗传病Charcot–Marie–Tooth 2A型(20).

我们的结果表明，Pink1通过IFM和DA神经元的裂变/融合途径调节线粒体的形态发生和功能。这些结果将线粒体分裂/融合缺陷与帕金森病（一种主要的神经退行性疾病）的发病机制联系起来。最近的一项研究报告了Pink1与核分裂/融合途径中的基因之间的类似遗传相互作用果蝇属尽管在该研究中没有显示它们在DA神经元（与PD相关的细胞类型）中的关系(16). 我们进一步证明Pink1似乎通过Fis1和Drp1调节线粒体裂变。因为Drp1是从细胞溶质中募集到线粒体外表面的裂变位点(21,22)而Pink1定位于面向膜间隙的内膜嵴上(23)，Drp1和Pink1的作用可能由一些中间蛋白（如Fis1）协调。与该模型一致，Fis1和Drp1之间的直接相互作用以前已有报道(18). Pink1和Fis1之间的生化关系有待进一步研究。对酵母的研究已经确定了其他与Drp1或Fis1相互作用并参与线粒体分裂/融合的蛋白质，如Mdv1p和Caf4p(12). 进一步的研究将测试Pink1和果蝇属或哺乳动物中这些蛋白质的对应物，用于调节线粒体动力学和DA神经元的维持和功能。我们的结果表明，哺乳动物Pink1与线粒体裂变机制的组成部分相互作用，并以类似于果蝇属该发现支持Pink1在线粒体形态发生中的保守作用。最近对哺乳动物HeLa-7细胞的一项研究表明，抑制Pink1会导致线粒体形态异常，而Parkin过度表达可以挽救这种效应(24). 有趣的是，Pink1敲除细胞中的线粒体似乎呈碎片状，尽管一些碎片的直径似乎更大。在这种情况下，尚不清楚该表型是由于过度裂变还是融合所致。Pink1基因敲除后HeLa细胞和Cos-7细胞中线粒体网络的差异可能是由于细胞类型特异性效应，或两项研究中RNAi对Pink1的抑制程度不同所致。

线粒体分裂和融合与细胞死亡调节有关，Drp1介导的分裂是促凋亡的(25——27)线粒体介导的融合具有抗凋亡作用(28,29). 在dPink1突变背景下，Drp1介导的线粒体分裂具有保护作用。依赖于Drp1的线粒体分裂也能保护细胞免受Ca的侵害2+-介导的细胞凋亡(30). 因此，线粒体分裂/融合在调节细胞存活中的作用是背景和可能的细胞类型依赖性的。这与在选定组织中显示表型的dPink1突变体一致。神经元可能特别容易受到线粒体分裂/融合失衡的影响，因为其独特的形态和对突触功能的要求，其中Drp1调节的线粒体分裂参与其中(13,31). 例如，在培养的哺乳动物海马神经元中，已有研究表明，线粒体向树突状突起延伸或移动与脊椎的发育和形态可塑性相关。通过显性负性Drp1的表达抑制线粒体分裂，导致突触和树突状棘的丢失(31). 这增加了Pink1功能障碍也可能导致多巴胺能突触丧失的可能性，最终导致DA神经元变性。在这方面，有趣的是，敲除小鼠Pink1会导致纹状体多巴胺释放和突触可塑性受损(32). 对Pink1在突触发生中的调控和功能的进一步研究有望阐明线粒体动力学在PD发病机制中新认识的作用。

材料和方法

果蝇属遗传学和蝇类。

根据标准程序进行苍蝇培养和杂交，并在指定温度下饲养。所有普通蝇类和镀锌4线是从果蝇属库存中心。d粉红色1-空突变系d粉红色1B9公司是中京钟（韩国大田韩国高级科学技术学院）赠送的礼物(9). 这个TH-GAL4公司司机是谢尔盖·伯曼（法国马赛梅迪特雷大学国家科学研究中心）的礼物。UAS-丝裂原纤维蛋白是William Saxton（印第安纳州布鲁明顿印第安纳大学）赠送的礼物。图纸1（或弗拉特博伊)-空突变系drp1（数字参考1）2和额外的副本图纸1线路FLAG-FLASH-HA-drp1（数字参考1）+是帕特里克·弗斯特里肯和雨果·贝伦（德克萨斯州贝勒市贝勒医学院）赠送的礼物。其他苍蝇种群如前所述：UAS-dPink1型和UAS-dPink1 RNAi(8)，UAS-dParkin公司(33)，UAS-DJ-1a型和UAS-DJ-1a RNAi(15)、和Opa1类突变系P{EPgy2}CG8479 (14).

分子生物学。

对于细胞培养转染实验h粉红色1和恒河猴图纸1cDNA被克隆到含有所示表位标签（Invitrogen）的pCDNA3表达载体中。人体全长粉红色1(h粉红色1)和C端子截断形式(h粉红色1ΔC)用C末端FLAG表位标记(8).hFis1型RNAi构建是Michael T.Ryan（澳大利亚墨尔本拉筹伯大学）的礼物(17).h粉红色1shRNA克隆（ID TRCN0000007099和TRCN00000007101）购自Open Biosystems。hFis1型这个建筑是Yisang Yoon（明尼苏达州罗切斯特市梅奥诊所和基金会）赠送的礼物(18). 恒河猴野生型Drp1和显性负性Drp1k38安是E.Smirnova和A.M.van der Bliek（加利福尼亚大学洛杉矶分校）的礼物(34). dFis1 cDNA来自DGRC。N端子EGFP公司在框架内融合到dFis1 cDNA并亚克隆到pAc-5.1载体（Invitrogen）。利用内置的肌动蛋白启动子。pCMV病毒-金星是Yuzuru Imai（加利福尼亚州斯坦福大学）赠送的礼物。在进行转染之前，对每个构建体进行完全测序。的dsRNAs图纸1,d粉红色1,二氧化锰（线粒体锰超氧化物歧化酶），以及绿色荧光粉根据标准协议生成，使用在体外转录系统（Ambion和Epicenter）。可根据要求提供单个基因的引物序列。对于RT-PCR分析，使用RNeasy试剂盒（Qiagen）制备总RNA。定量RT-PCR程序的细节基本上如参考文献所述。35.

COS-7细胞和S2R细胞线粒体形态的实时成像：蝇DA神经元线粒体的可视化。

有关这些过程的详细信息，请参阅SI材料和方法注意，为了便于监测基因操作对COS-7细胞线粒体分裂的影响，在将细胞从37°C、5%CO中取出后2–3 h开始观察2在室温下，在MTRed染料存在下放置。这种处理导致更多带有管状（或融合）线粒体的对照细胞(图S7)从而更容易对基因操纵引起的裂变事件进行评分。线粒体形态的这种变化是适应性和暂时性的，因为当对照细胞转移回37°C时，5%的CO2腔中，它们的线粒体形态也出现了相应的变化。

肌肉组织学和透射电镜分析。

肌肉组织学和透射电镜分析如参考文献所述。33，除了Epon树脂用于包埋。

多巴胺测量。

儿茶酚胺水平的HPLC分析基本上如参考文献所述。15为了制备样品，使用电动手持式组织研磨机将成年雄性苍蝇头解剖出来，并在0.1 M高氯酸（通常每四个或五个苍蝇头50μl）中均质。在进行HPLC分析之前，立即将匀浆冷冻在干冰上，并在−80°C下保存。

补充材料

支持信息：

致谢。

我们感谢H.Bellen博士、S.Birman博士、D.Chan博士（加利福尼亚州帕萨迪纳加州理工学院）、J.Chung、M.Cookson博士（国立卫生研究院，医学博士Bethesda）、M.Fuller博士（斯坦福大学）、M.T.Ryan、W.Saxton、M.Scott博士（斯坦福学院）、E.Smirnova、A.M.van der Bliek、P.Verstreken、Y.Yoon、J.Zhang博士（斯坦福州立大学）、，以及布卢明顿果蝇库存中心，提供苍蝇种群、细胞系和分子生物学试剂。我们感谢郭博士阅读了手稿，感谢B.L.实验室成员的讨论和帮助。这项工作得到了国立卫生研究院拨款R01AR054926（给B.L.）和斯坦福大学生物X研究生奖学金（给Y.Y.）的支持。

脚注

作者声明没有利益冲突。

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文章来自美国国家科学院院刊由提供美国国家科学院