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EMBO J。2007年5月16日；26(10): 2527–2539.
2007年4月19日在线发布。 数字对象标识：10.1038/sj.emboj.7601689
预防性维修识别码：项目经理1868901
PMID：17446862

Bcl-X之间的功能和物理相互作用L（左）和Beclin-1中的BH3-类结构域

M Chiara Maiuri先生,1,2,三，4 勒图梅林,5 阿尔弗雷多·克里奥洛,1,2,三 Jean-Christophe雨,6 法比安·戈蒂埃,7 菲利普·朱恩,7 埃兹吉·塔斯德米尔,1,2,三 杰拉德·皮尔龙,8 科斯图拉·特鲁利纳基,9 内克塔里奥斯·塔维纳拉基斯,9 约翰·A·希克曼,5 奥利维尔·杰恩斯特,5,10,b条和吉多·克罗默1,2,三，10,一
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摘要

抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-XL（左）结合并抑制Beclin-1，一种重要的自噬介质。在这里，我们证明了这种相互作用涉及Beclin-1内的BH3结构域（残基114-123）。Beclin-1与Bcl-X的物理相互作用L（左）当Beclin-1的BH3结构域或Bcl-X的BH3受体结构域丢失时L（左）是变异的。Beclin-1的BH3结构域或Bcl-X的BH3受体结构域突变L（左）废除Bcl-XL（左）-Beclin-1介导的自噬抑制。药理学BH3模拟物ABT737竞争性抑制Beclin-1和Bcl-2/Bcl-X之间的相互作用L（左），通过Bcl-2/Bcl-X对抗自噬抑制L（左）从而刺激自噬。敲除或敲除BH3-only蛋白Bad可减少饥饿诱导的自噬，而Bad过度表达可诱导人类细胞自噬。唯一BH3-only蛋白的获得功能突变秀丽隐杆线虫EGL-1诱导自噬，而EGL-1的缺失破坏了饥饿诱导的自噬。这些结果揭示了BH3-only蛋白的一种新的自噬刺激功能，超出了其作为凋亡诱导剂的既定作用。BH3-only蛋白质和药理BH3模拟物通过竞争性破坏Beclin-1和Bcl-2或Bcl-X之间的相互作用诱导自噬L（左）.

关键词：凋亡、自噬、Bax、Bcl-2、线粒体

引言

过去几十年来，细胞凋亡（自我杀伤）和自噬（自噬）这两个自我构造过程引起了细胞生物学家的关注。虽然凋亡涉及分解代谢酶的激活，导致细胞结构和细胞器的破坏，但自噬是一种缓慢的局部现象，其中部分细胞质被隔离在双层自噬液泡中，最后被溶酶体水解酶消化(Gozuacik和Kimchi，2004年;Kroemer和Jaattela，2005年). 凋亡和自噬之间的关系很复杂，自噬可能导致细胞死亡(清水等, 2004;于等, 2004)或构成细胞防御急性应激，特别是营养素或专性生长因子饥饿引起的应激(博雅等, 2005;勒姆等, 2005). 自噬和凋亡之间的串扰至少部分由Beclin-1（一种重要的自噬基因）和Bcl-2（一种典型的凋亡抑制蛋白）之间的功能和物理相互作用介导(梁等, 1999;帕廷格等, 2005;塔卡茨·维莱等, 2005).

Bcl-2是包含至少一个Bcl-2同源区（BH）的蛋白质家族的原型。该家族分为抗凋亡多域蛋白（如Bcl-2和Bcl-XL（左）)，包含四个BH域（BH1234），前凋亡多域蛋白（原型Bax和Bak），其中包含三个BH结构域（BH123），以及前凋亡BH3纯蛋白家族(乐泰等, 2002). 通常，BH1234蛋白（Bcl-2，Bcl-XL（左），Mcl-1）主要存在于线粒体中，保护这些细胞器免受线粒体外膜通透性（MOMP）的影响，MOMP是诱导细胞凋亡的速率限制事件之一。在一系列不同的凋亡诱导模型中，MOMP需要两种BH123蛋白中的任何一种（Bax和Bak）(世界环境学会等, 2001). 仅BH3蛋白被认为通过与BH3受体相互作用来杀死细胞，BH3受体是BH1、BH2和BH3结构域并置形成的疏水沟槽，从而激活BH123蛋白和/或中和BH1234蛋白。所谓的“BH3模拟物”是与BH3受体结合的药理化合物，可以诱导癌细胞凋亡或促进凋亡诱导(乐泰等, 2002;奥尔特斯多夫等, 2005).

Beclin-1（也称为ATG6）是一种系统发育保守的蛋白质，可能通过与III类磷脂酰肌醇-3-激酶Vps34的相互作用，对自噬的启动至关重要(曾等, 2006). 最初，人类Beclin-1被确定为Bcl-2的相互作用者(梁等, 1999).秀丽隐杆线虫Beclin-1（BEC-1）与Bcl-2同源物CED-9相互作用，并使其失活秀丽线虫bec-1基因导致细胞凋亡(Takacs Vellai公司等, 2005). 在哺乳动物细胞中，beclin-1的敲低对饥饿诱导的凋亡敏感(博雅等, 2005;勒姆等, 2005). 然而，Beclin-1下调也可以通过阻断必需的促凋亡MOMP或caspase激活来抑制细胞死亡诱导(清水等, 2004;于等, 2004)在缺乏Beclin-1的肿瘤细胞中恢复正常的Beclin-1水平可以促进维生素D类似物诱导细胞死亡(霍耶·汉森等, 2005). 重要的是，贝克林-1是一个单倍体肿瘤抑制基因(曲等, 2003;岳等, 2003). 转染增强的Beclin-1过度表达刺激自噬，这种自噬刺激效应通过Bcl-2的缺失而增强，通过Bcl-2-过度表达而降低(帕廷格等, 2005).

基于这些前提和未知，我们探索了调控Beclin-1和Bcl-2/Bcl-X相互作用的精细机制L（左）如图所示，Beclin-1具有BH3-样结构域，从而阐明了功能Beclin-1-Bcl-2/Bcl-X的结构基础L（左）互动。仅BH3蛋白或BH3模拟物破坏这种相互作用会增加Beclin-1的自噬活性，从而揭示BH3结构域的新生理作用。

结果

Beclin-1中BH3-类结构域的鉴定

在多个酵母双杂交筛选中，使用复杂的人类DNA文库，许多Beclin-1片段与Bcl-2以及Bcl-X相互作用L（左）使我们能够将Beclin-1的精确相互作用域缩小到氨基酸（aa）112到159(图1A). 该结构域中的10个氨基酸片段（aa 114–123）与Bcl-2家族的BH3结构域具有显著相似性(图1B). 一种二十碳六肽（aa 107–132）以α螺旋构象包含BH3样结构域，取代了Bak衍生的含BH3的肽与纯化重组Bcl-X的疏水沟槽结合L（左）在荧光各向异性分析中测量。Beclin-1（L116A）和另一氨基酸（F123A）BH3-样结构域中最保守残基的突变(帕廷格等, 2005)取消了与Bak-BH3的Bcl-X竞争L（左）绑定(图1C). Beclin-1野生型BH3肽对Bcl-X的亲和力L（左）很高(K（K）d日203±6牛顿米，n个=3) (图1D)与Bax-BH3（145 nM）或Bak-BH3（40 nM）类似，但低于Bad-BH3（10 nM）（未显示数据）。相比之下，Bcl-XL（左）在BH3结合槽中携带单个突变（G138A）(奥蒂利等, 1997)无法与Beclin衍生BH3-样肽相互作用。

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Bcl-X之间的物理相互作用L（左）/Bcl-2和Beclin-1的BH3-样结构域。(A）与Bcl-X相互作用的Beclin-1片段的筛选L（左）/酵母双杂交系统中的Bcl-2。黑线表示与Bcl-X相互作用的Beclin-1片段（灰色）L（左）（图的上部）或Bcl-2（下部）。▪, CEMC7库；•，人胸腺细胞文库；▴, 胎盘文库和★，人脑文库。与Bcl-X交互所需的最小交互域L（左）/Bcl-2位于aa 112和159之间。(B类)Beclin-1类BH3域与已建立的BH3域对齐。L116A Beclin-1和F123A Beclin-1描述了两种Beclin-1突变肽。(C类)荧光偏振分析表明含有Beclin-1 BH3-样结构域的肽与Bcl-X相互作用L（左）.重组Bcl-XL（左）在没有或存在野生型（WT）Beclin-1 BH3或B中描述的两种突变肽中的任何一种的情况下，用羧基荧光素标记的Bak BH3肽孵育ΔTM(D类)重组Bcl-X相互作用的亲和力测定L（左）ΔTM和荧光Beclin-1 BH3，通过荧光偏振。WT Bcl-X的比较L（左）（正方形）和G138A Bcl-XL（左）（三角形）显示（平均值±s.d。，n个=3个单独的实验）。(E类)Bcl-X的共免疫沉淀L（左）和WT或突变型Beclin-1。HeLa细胞转染所示结构，然后免疫沉淀标记的Bcl-XL（左）以及Beclin-1的免疫化学检测。(F类)Beclin-1与WT和突变株（G138A）Bcl-X的共免疫沉淀L（左）。结果代表了至少三个产生类似结果的实验。

证实BH3-类结构域在Beclin-1与Bcl-X相互作用中的作用L（左），用野生型或突变型Beclin-1和/或Bcl-X转染细胞L（左）然后进行联合免疫沉淀分析。BH3破坏突变L116A几乎消除了Beclin-1与Bcl-X的相互作用L（左）(图1E)以及Beclin-1、Bcl-2和Mcl-1（未显示）。此外，F123A突变降低了Beclin-1-Bcl-XL（左）相互作用(图1E). Bcl-X BH3-结合间隙中的G138A突变L（左）废除Beclin-1在细胞环境中的结合(图1F). 这些结果表明，Beclin-1中一个新的BH3-样结构域对Beclin-2与Bcl-2家族抗凋亡成员的相互作用至关重要。Beclin-1的BH3样结构域在系统发育上是保守的，因为河豚的Beclin-1直向同源物(红色Takifugu)，拉丁美洲(乳稻)和斑马鱼(达尼奥雷里奥)展示其BH3-样结构域与人类Beclin-1的序列同源性(补充图1A). 当将这些BH3-样结构域对应的肽微注射到人HCT116细胞中时，它们以Bax依赖的方式诱导凋亡(补充图1B和C)河豚和拉丁鱼的肽（但斑马鱼的肽除外）能够取代重组Bcl-X中的Bak BH3肽L（左）或Bcl-2蛋白在体外(补充图1D和E). 斑马鱼衍生的Beclin-1肽不与人类Bcl-X结合L（左）然而诱导的Bax依赖性细胞凋亡表明，这种特殊的肽通过作用于多域Bcl-2家族蛋白而非Bcl-X来诱导细胞死亡L（左）.

Beclin-1-Bcl-X的抑制作用L（左）/BH3模拟物与Bcl-2的相互作用

BH3-模拟化合物ABT737(奥尔特斯多夫等, 2005)，抑制Beclin-1 BH3肽与Bcl-X的结合L（左）以竞争的方式，与IC50在微摩尔范围内，由合成肽与纯化重组Bcl-X结合的荧光偏振测定L（左） 在体外(图2A). ABT737预处理细胞抑制标记Bcl-X的联合免疫沉淀L（左）和His-tagged(图2B)或内源性Beclin-1(图2C). ABT737还减少了Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用(图2D)但对Mcl-1和Beclin-1之间的相互作用没有影响(图2E). 这可以通过ABT737的选择性来解释，ABT737与Bcl-2和Bcl-X结合L（左）但不是Mcl-1，因此有一个坏的配置文件(奥尔特斯多夫等, 2005,范·德尔夫特等, 2006). 值得注意的是，ABT737还消除了内源性Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用（见下文），这意味着这些影响不能归因于过度表达相关伪影。总之，这些数据表明Beclin-1的BH3样结构域与Bcl-X的BH3受体区域结合L（左）/Bcl-2和ABT737竞争性地破坏这种相互作用。

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ABT737抑制Beclin-1和抗凋亡Bcl-2蛋白之间的相互作用。(A类)Beclin-1 BH3和ABT737对Bcl-X的竞争L（左）结合。含有Beclin-1 BH3-样结构域的荧光25肽(图1D)与重组Bcl-X对接L（左）ΔTM蛋白。IC50在15 nM肽和100 nM Bcl-X存在下测量的ABT737L（左）ΔTM为1.7μM。(B、 C类)取消Bcl-X之间的相互作用L（左）完整细胞中的Beclin-1和ABT737。对48小时前转染的HeLa细胞进行免疫共沉淀分析，所示结构如图1E.免疫沉淀前16小时，细胞暴露于ABT737。对于联合转染的Bcl-X也获得了类似的结果L（左）和Beclin-1（B）以及内源性Beclin-1与标记的Bcl-X相互作用L（左）（C） ●●●●。(D、 E类)ABT737对Bcl-2（D）或Mcl-1（E）与Beclin-1相互作用的差异效应。本实验设计为（B）。所有实验都已进行了至少三次，结果相似。

BH3模拟物ABT737刺激Beclin-1依赖性自噬

如果物理Beclin-1-Bcl-X的生理功能L（左）/Bcl-2相互作用控制Beclin-1启动的自噬(帕廷格等, 2005)，那么抑制这种相互作用就会刺激自噬。因此，ABT737增加了表现自噬空泡标记LC3-GFP的细胞质（非核）聚集的细胞的频率。LC3-GFP的聚集（在非自噬细胞中，它在胞浆和细胞核中扩散）是自噬的既定标志(水岛等, 2004)，并在完全培养基和养分耗尽条件下诱导(图3A). 通过两种不同的小干扰RNA（siRNA）异源双链（插入图3B)抑制ABT737刺激的LC3-GFP聚集(图3A和B). 类似地，其他必需ATG蛋白（ATG5、10、12）的敲除减少了ABT737诱导的LC3-GFP聚集，证实ABT736参与了经典的自噬途径(补充图2S). 由于LC3-GFP可能干扰自噬的正常调节，细胞质空泡（善意的自噬空泡）通过CMFDA染色检测，之前未使用LC3-GFP转染。同样，ABT737诱导的自噬信号可以被Beclin-1的敲除完全抑制(图3C和D). 透射电镜显示ABT737诱导的双膜自噬空泡和Beclin-1特异性siRNAs抑制的双膜自吞噬空泡证实了这些结果(图3E和​和4）。4). ABT737刺激的自噬是细胞器特异性的，LC3-GFP与线粒体标记HSP60共定位(补充图3A和C)但与内质网（ER）标记物钙网蛋白无关(补充图3B和C). 值得注意的是，这些结果是通过观察存活的粘附细胞获得的(图3A-E)并且ABT737的细胞毒性促凋亡作用是轻微的。因此，ABT737未能诱导线粒体跨膜电位的重大损失（这可能与凋亡或坏死有关）(图3F)或磷脂酰丝氨酸暴露（与细胞凋亡相关）(补充图4)，除非Beclin-1同时耗尽。这与ABT737作为单一制剂仅杀死有限组转化细胞系的概念相一致(奥尔特斯多夫等, 2005). ABT737可以刺激自噬而不诱导细胞死亡。

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ABT737刺激的Beclin-1依赖性自噬。(A、 B类)LC3-GFP检测自噬空泡，ABT737和Beclin-1特异性siRNAs对其进行调节。用对照或Beclin-1特异性siRNAs转染HeLa细胞，24小时后用LC3-GFP再次转染，在完全培养基（CM）中培养24小时，最后在CM或无营养（NF）条件下，在有或无1μM ABT737的情况下保存12小时。NF培养基中培养的细胞的代表性显微照片如（A）所示，百分比（平均值±s.d。，n个=3个单独的实验），对细胞质中含有LC3-GFP聚集体（LC3-GFPvac）的LC3-GFP-转染细胞进行定量（B）。（B）中的插入物证明了通过免疫印迹定量的Beclin-1特异性siRNAs的效率。(C、 D类)使用二醋酸氯甲基荧光素（CMFDA）检测细胞质空泡。用对照或Beclin-1特异性siRNAs转染细胞，在CM中培养48小时，洗涤，在CM（D）或NF（C，D）中培养12小时，用CMFDA染色，并拍照（C）或对含有至少一个可辨别细胞质空泡（箭头）的细胞进行量化（平均值±s.D。，n个=3个单独的实验）。

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(E类)ABT737诱导的自噬液泡的超微结构。显示了透射电子显微照片。(F类)检测培养物中的死亡和死亡细胞。按（A）处理的细胞用ΔΨ染色米-敏感染料DiOC6（3） 和活性染料碘化丙啶（PI）。列的黑色部分指的是DiOC6（3） 低PI+人口（死亡）和列的剩余部分对应于DiOC6（3） 低PI−（濒临死亡的）人口。结果是三个独立实验的平均值±标准差。

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ABT737诱导的自噬空泡的定量。用LC3-GFP重新转染转染有指示siRNAs（0 h时对Emerin或Beclin-1特异）的HeLa细胞，最后在无营养（NF）条件下（60-72 h），在有或无1μM ABT737的情况下培养，然后对未成熟（AV1）或成熟（AV2）自噬空泡进行电子显微镜检测。代表性图片如所示(A类). 测定至少50个细胞的AV1和AV2数量（平均值±标准偏差）(B类).

Beclin-1和Bcl-X之间功能相互作用的BH3依赖性L（左）/Bcl-2型

Beclin-1的过度表达刺激自噬(梁等, 1999;霍耶·汉森等, 2005;帕廷格等, 2005)ABT737增加了这种效果(图5A和B). Beclin-1突变体L116A和F123A在刺激自噬方面比野生型Beclin-1更有效，这与这些突变破坏了Beclin-2抑制剂Bcl-2/Bcl-X的相互作用这一事实一致L（左）。当使用两种不同的读出，即LC3-GFP聚集时，可以获得此结果(图5A和B)和CMFDA定量空泡化(图5C和D). 在ABT737存在的情况下，野生型Beclin-1及其突变体L116A和F123A诱导自噬的差异能力相匹配，这表明Beclin-1的BH3-样结构域和BH3受体（ABT737-可抑制）之间的相互作用确实调节了Beclin-1.的促自噬活性。这些数据还表明内源性Mcl-1（不受ABT737抑制）(范·代尔夫特等, 2006)在控制Beclin-1过度表达诱导的自噬中不起关键作用。此外，Bcl-XL（左）（但不是Bcl-XL（左）G138A）、Bcl-2和Mcl-1均抑制Beclin-1诱导的自噬(图5E). Bcl-X的自噬抑制作用L（左）并且Bcl-2被ABT737所消除。然而，ABT737并不影响Mcl-1对自噬的抑制(图5E)，因为其无法阻止Beclin-1–Mcl-1相互作用(图2E). 总之，这些数据表明ABT737通过竞争性抑制Beclin-1的BH3结构域和Bcl-2/Bcl-X的BH3受体区域之间的相互作用来刺激（或抑制）自噬L（左）.

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BH3样结构域对Beclin-1诱导的自噬的影响。(A–D)BH3突变体和ABT737对Beclin-1诱导的自噬的调节。将GFP-LC3与空白对照载体或Beclin-1（WT，L116A，F123A）一起转染细胞并培养48 h，然后在CM（B）或NF（A，B）中在不存在或存在1μM ABT737的情况下过夜培养。代表性显微照片如（A）所示，每个细胞的LC3-GFP阳性空泡数量如（B）所示（平均值±s.d。；n个=3个单独的实验）。或者，不转染细胞并用CMFDA染色以检测空泡，如（C）和（D）所示，产生与LC3-GFP方法类似的结果。(E类)BH3依赖性调节Beclin-1通过抗凋亡Bcl-2蛋白诱导的自噬。细胞同时转染Beclin-1（或对照载体）和编码WT Bcl-X的等量质粒L（左），Bcl-XL（左）G138A、Bcl-2或Mcl-1（或控制向量）以及GFP-LC3。在60 h长的实验的最后12 h内，在CM或NF中进行无或有ABT737的培养。液泡中显示LC3-GFP积聚的细胞百分比真空)量化为平均值±标准差(n个=3个单独的实验）。

ABT737抑制了Bcl-2和Beclin-1之间受空间限制和调节的相互作用

ABT737和营养素缺乏降低了HeLa和MV4.11细胞中内源性Beclin-1的数量，后者与内源性Bcl-2免疫沉淀(图6A)，证实了这些蛋白质的生理水平可以以一种被营养缺乏或ABT737抑制的方式相互作用。Bcl-2与ER和线粒体膜相关(日耳曼和海岸，2003年). 野生型和ER靶向Bcl-2（Bcl-2-Cb5）但非线粒体靶向Bcl-2（Bcl-2-Acta）抑制饥饿诱导的自噬(帕廷格等, 2005)，表明Bcl-2的自噬调节池位于内质网。为了研究这一点，我们测定了ABT737和营养素耗竭对稳定表达野生型Bcl-2、Bcl-2-Cb5或Bcl-2-Acta的细胞系中Bcl-2-Beclin-1相互作用的抑制作用。用ABT737或饥饿处理后，与野生型和Bcl-2-Cb5共免疫沉淀的Beclin-1的量减少，而与Bcl-2-Acta共同免疫沉淀的Beclin-1量保持不变(图6B). 这些结果可以通过亚细胞分离得到进一步证实。ABT737或饥饿降低了微粒体（ER）中可测量的野生型Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用，但在重膜部分（线粒体）中保持不变(图6C和D). 因此，只有靶向ER的Bcl-2池与抑制自噬有关。

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饥饿和添加ABT737后内源性和空间限制性Bcl-2和Beclin-1之间的相互作用。(A类)内源性Bcl-2和Beclin-1的免疫沉淀。未转染的HeLa或MV4.11细胞通过在无营养的EBSS中培养或用ABT737（1μM）处理。(B类)用Beclin-1免疫沉淀野生型和ER靶向Bcl-2。对稳定转染野生型、ER和线粒体靶向Bcl-2的细胞进行饥饿处理或ABT737处理，然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫检测。(C、 D类)Bcl-2和Beclin-1在亚细胞组分中的免疫沉淀。将处理为（B）的细胞进行裂解，并进行亚细胞分离，以富集内质网小泡（微粒体，（C））或线粒体（重膜部分，（D）），然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫检测。使用钙网织蛋白和Hsp60作为内部对照。结果代表了三个独立的测定结果。

饥饿通过BH3-only蛋白Bad诱导自噬

上述结果表明，至少在某些情况下，Beclin-1介导的自噬的诱导应与其从抑制复合物中释放相关。饥饿时，与Bcl-X共同免疫沉淀的内源性Beclin-1的数量L（左）在退出血清和营养素的第一个小时内，BH3蛋白Bad的量下降，而BH3蛋白的量（已知其激活是由退出血清触发的）(Danial和Korsmeyer，2004年)与Bcl-X共免疫沉淀L（左）增加(图7A). 相反，添加雷帕霉素（通过抑制mTOR诱导自噬）(萨尔巴索夫多斯等, 2005)或其他影响磷脂酰肌醇-3-磷酸水平的自噬诱导物(萨尔卡等, 2005)对Beclin-1、Bcl-X之间的相互作用影响较小L（左）和坏(图7B). 饥饿时（但不添加ABT737），内源性Bcl-2免疫沉淀的内源性Bad的数量也增加(图7C)，同时Bcl-2–Beclin-1相互作用减少(图6A). siRNA介导的Bad耗竭(图7D)减少饥饿诱导的自噬激活，但对雷帕霉素诱导的自吞噬没有影响或几乎没有影响，而Vps34的耗竭同时抑制饥饿和雷帕霉素诱发的自吞噬(图7E). 坏−/−小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）(流浪者等, 2003)与WT-MEF相比，饥饿诱导的自噬也减少了，尽管这种差异在ABT737的存在下消失了(图7F). Bad的缺失损害了饥饿诱导的Beclin-1/Bcl-2相互作用的中断，但对ABT737对这种相互作用的破坏没有影响(图7G). 不良耗竭/缺失对饥饿诱导的自噬的影响(图7D和F)以及Beclin-1/Bcl-2相互作用的变化(图7G)是部分的，这表明Bad不是唯一将饥饿与自噬诱导联系起来的BH3蛋白，或者可能涉及BH3非依赖性机制。在正常条件和半胱天冬酶抑制条件下，转染增强的Bad过度表达足以诱导自噬(图7H). 这些结果表明，BH3-only蛋白（包括Bad）可能通过饥饿参与自噬的激活。

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BH3-only蛋白Bad对自噬的影响。(A、 B类)自噬诱导条件下Bcl-XL、Beclin-1和Bad之间的相互作用。用营养素耗尽（A）或添加1μM雷帕霉素、1 mM氯化锂、100μM L-690330或50μM卡马西平（B）处理细胞，然后免疫Bcl-XL（左）（如中所示图2C)并通过Bcl-X特异性抗体揭示免疫印迹L（左）Beclin-1或Bad。(C类)内源性Bad与Bcl-2的相互作用。用ABT737（1μM）或去营养剂处理HeLa细胞，然后免疫沉淀Bcl-2和免疫检测Bad。(D、 E类)坏损耗对自噬的影响。用LC3-GFP和Bad特异性siRNA、emerin特异性siRNAs或Beclin-1相关PI3激酶Vps34转染细胞。48小时后，当siRNAs下调感兴趣的蛋白（D）时，细胞受到营养物质耗竭（NF）或添加雷帕霉素（E）的影响，并在18小时后评估细胞表现出LC3-GFP聚集作为自噬标记的频率（平均值±标准差。，*P（P）<0.05时，n个=3个单独的实验）。(F类)坏基因敲除对自噬的影响。野生型（WT）或不良−/−MEF转染LC3-GFP，然后进行营养耗竭（NF）和/或ABT737处理（18小时；平均值±s.d。，n个=3). 星号表示(P（P）<0.05）不良缺陷的影响。(G公司)Bad基因敲除对Beclin-1/Bcl-2相互作用的影响。WT或不良−/−MEF接受指定的治疗，然后进行Bcl-2免疫沉淀和Beclin-1免疫印迹。(H（H）)Bad触发器自噬的过度表达。细胞仅转染LC3-GFP（对照组），连同载体或编码Bad的载体，并在48小时后进行营养耗竭（NF）。细胞在连续存在或不存在泛酶抑制剂Z-VAD-fmk（50μM）的情况下培养16小时，然后按照（E）中的自噬评估（平均值±标准差。，n个=3个单独的实验，*P（P）<0.01). 免疫印迹是至少三个独立实验的代表。

秀丽线虫BH3-only蛋白EGL-1对自噬的调控

EGL-1是唯一的促凋亡BH3蛋白秀丽线虫并且是这种线虫发育细胞死亡所必需的(Conradt和Horvitz，1998年,1999). 因此，该模型生物特别适合于确定BH3-only蛋白质对自噬的系统发育保守调控。在秀丽线虫,lgg-1型（Atg8/LC3的线虫同源基因）在整个发育过程中广泛表达，并在自噬条件下诱导(梅伦德斯等, 2003). 在携带野生型、功能丧失或缺失等位基因egl-1正常情况下或饥饿后。饥饿强烈诱导自噬，这种诱导在egl-1-线虫胚胎缺陷。相反egl-1型导致结构性自噬增加，但饥饿并未进一步加剧(图8). 这些结果强调了BH3-only蛋白控制自噬的系统发育保守性。

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BH3域蛋白EGL-1调节饥饿诱导的自噬秀丽隐杆线虫。L4幼虫表达LGG-1｜DsRED报告子（其表达水平提供自噬迹象）以及egl-1（n487）或缺失等位基因egl-1（ok1418）保存在富培养基中或饥饿过夜。(A类)wt和egl-1型突变胚胎，携带p液化天然气−1DsREDLGG-1报告基因在正常生长和饥饿条件下表达。比例尺表示约50μm。(B类)（A）中测定的LGG-1｜DsRED荧光定量。每个点代表一个单独胚胎的测量值。水平条表示平均值，灰色区域表示标准误差。

讨论

如图所示，Beclin-1具有BH3结构域，该结构域指示其与Bcl-2家族抗凋亡蛋白BH3受体结构域的相互作用，包括Bcl-2、Bcl-XL（左）和Mcl-1。本论文审查期间发表的一份最新报告揭示了人类Bcl-X的晶体结构L（左）与来自人类Beclin-1的肽（aa 107–135）相互作用，证实了Beclin-1具有BH3样的两亲性α-螺旋，可以与Bcl-X的保守疏水槽结合的假说L（左）(伊达尔-奥伯施泰因等, 2007). 如图所示，这种相互作用在生理学上很重要，因为BH3-only蛋白Bad和Bad-like BH3模拟物对其的抑制可以刺激自噬。

Beclin-1具有BH3结构域，该结构域以合成肽的形式从整个蛋白质中切除，诱导Bax依赖性细胞凋亡。然而，过度表达后，它促进Bcl-XL（左）-Beclin是一种新型BH3蛋白，具有可抑制的自噬性而非凋亡性，在BH3蛋白中，该结构域起调节作用，而非效应功能。

含BH3-的Beclin-1自噬活性的流行及其诱导细胞凋亡的失败体内语境提出了重要的机械性问题。Beclin-1全长蛋白中的调控序列，或Beclin-1BH3结构域本身的结构，通常可能阻止Beclin-1中的BH3基序激活凋亡，这可能是因为在细胞环境中抗凋亡Bcl-2家族成员的BH3-only蛋白之间的亲合性不同。事实上，在最近关于Beclin-1 BH3肽与Bcl-X结合的结构的报告中L（左），相互作用特征表明具有明显的结合特异性(伊达尔-奥伯施泰因等, 2007). 或者，可能存在不同的抗凋亡多域Bcl-2蛋白库，一些隔离促凋亡Bcl-2家族成员，其他Beclin-1，这些可能被其他BH3蛋白选择性取代，这也可能反映了它们的不同亲和力和/或亚细胞分隔。

为了支持后一种可能性，我们发现ABT737和营养素提取只影响Beclin-1和ER-localized Bcl-2之间的相互作用。ABT737可能影响ER定位的Bcl-2-Bclin–1复合物（但不是线粒体上发现的复合物）之间相互作用的机制尚不清楚。一方面，ABT737对Bcl-2的亲和力可能受到转录后改变（如Bcl-2磷酸化；科诺普列娃等, 2006)这可能与其亚细胞定位有关(鲁沃洛等1998年). 另一方面，Bcl-2和Beclin-1之间的物理化学相互作用的性质可能会受到额外细胞器特异性蛋白质的调节，例如IP三ER中的R（1,4,5-肌醇三磷酸受体）(陈等, 2004;克里奥洛等, 2007)线粒体中的VDAC（电压依赖性阴离子通道）(清水等, 1999). 而线粒体Bcl-2和Bcl-XL（左）可能是BH3-only蛋白促凋亡功能的优先靶点，ER-resident Bcl-2-Beclin-1复合物可以被竞争的BH3结构域（例如Bad结构域）或BH3模拟物选择性破坏，以诱导自噬，这与帕廷格等(2005)表明只有ER靶向的Bcl-2抑制自噬。

值得注意的是，BH3-only蛋白对自噬的调节在系统发育上是古老的。这不仅适用于非哺乳动物物种中Beclin-1 BH3-样结构域的保护，还扩展到观察到EGL-1是唯一的BH3-唯一蛋白质秀丽线虫，足以触发自噬，是饥饿诱导自噬的介体。应该注意的是egl-1（英寸秀丽线虫)Bad（在人类和小鼠细胞中）的耗尽/缺失并没有完全消除饥饿诱导的自噬，这与冗余调控途径的存在一致(Shintani和Klonsky，2004年)其中BH3-only蛋白质起着突出但非排他性的作用。

凭借其BH3模拟作用，ABT737发挥两种不同的细胞效应。一方面，它抑制Bcl-2或Bcl-X的抗凋亡作用L（左），如前所述(奥尔特斯多夫等, 2005)从而触发Bcl-2或Bcl-X中和的细胞凋亡L（左）足以解除线粒体细胞死亡途径。另一方面，ABT737刺激自噬，这可以被视为一种细胞保护机制(博雅等, 2005;勒姆等, 2005). 尽管目前还没有临床应用的自噬抑制剂，但这些结果表明，有可能使用自噬抑制物使肿瘤细胞对BH3模拟物或BH3依赖性凋亡途径的间接激活剂敏感。

总之，我们的数据支持Bcl-2同源物BH3结合位点的一种新功能，即调节自噬。除了作为细胞死亡诱导剂的既定功能外，BH3-only蛋白质或BH3模拟物可以通过竞争性破坏Beclin-1与Bcl-2/Bcl-X的相互作用来诱导自噬L（左）我们的研究结果表明，自杀倾向和自食其果之间存在着迄今为止未曾预料到的相互影响。这两种现象都是由BH3-only蛋白质控制的。

材料和方法

细胞系和培养条件

HeLa细胞在含有10%胎牛血清（FCS）、1 mM丙酮酸和10 mM Hepes的DMEM中培养，37°C，5%CO2MV4.11细胞在含有10%FCS、1 mM丙酮酸、10 mM Hepes、100 U/ml青霉素G钠、100μG/ml硫酸链霉素和5 ng/ml粒细胞/巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）的RPMI 1640培养基中培养，培养温度37°C，浓度5%CO2.wild类型和Bad−/−最大有效载荷(流浪者等, 2003)以及表达Bcl-2 Acta或Bcl-2 Cb5的细胞(朱等, 1996)在37°C、5%CO条件下，在DMEM中添加10%FCS、1 mM丙酮酸、10 mM Hepes和1%非必需氨基酸（NEAA、SIGMA）2所有培养基和补充剂均购自Gibco-Invitrogen（美国卡尔斯巴德）。对于血清和氨基酸饥饿，细胞在无血清厄尔平衡盐溶液培养基（Sigma）中培养(Vahsen公司等, 2004)，任选地添加ABT737（1μM；由施维雅合成）。

质粒、转染和RNA干扰

细胞在六孔板中培养，并在含有100 nM人Beclin-1和其他特异性siRNA的情况下，与寡聚体胺（Invitrogen）80%融合转染自动变速箱基因(博雅等, 2005;冈萨雷斯-波洛等, 2005)，坏的（siRNA1来自金等, 2004; siRNA2:CUGGGCAGCCAUGAAU dTdT），Vps（siRNA1来自Nobukuni公司等, 2005和siRNA2来自Byfield公司等, 2005)、一个打乱的小干扰RNA或一个针对无关蛋白质emerin的小干扰rna(港口等, 2001). siRNA效应由免疫印迹法控制，免疫印迹具有针对Beclin-1（SantaCruz）、Bad（SantaCruz）或Vps34（Zymed）的合适抗体。使用Lipofectamine 2000试剂（Invitrogen）对cDNA进行瞬时转染，转染后24小时使用细胞，除非另有规定。用空载体单独或与LC3-GFP一起转染细胞(卡贝亚等2000年)，存在或不存在Beclin-1野生型、Beclin-1L116A、Beclin-1F123A、Bcl-XL（左）野生型，Bcl-XL（左）G138A、Bcl-2野生型或Mcl-1。

酵母双杂交系统

Bcl-X公司L（左）和Bcl-2没有其C末端跨膜结构域（Bcl-XL（左）PCR扩增（Pfu，Stratagene）1–624和Bcl-2 1–630），并将N末端克隆到pB24载体中的lexA DNA结合域。pP6载体构建的cDNA文库(弗罗蒙特-拉辛等, 2002)转化为Y187酵母菌株。收集了1000万个独立的酵母菌落，汇集在一起，并将其作为同一文库的等分部分储存在−80°C下。配对协议已描述(弗罗蒙特-拉辛等, 2002). 执行每个屏幕以确保至少5000万次交互。阳性克隆的猎物片段通过PCR扩增，并在PE3700测序仪上对其5′和3′连接处进行测序。结果序列用于识别GenBank数据库（NCBI）中的相应基因。

肽和重组蛋白

融合到Bcl-X的重组GSTL（左）野生型或Bcl-XL（左）C末端21 aa缺失的G138A（pGEX 5X载体，Amersham）在大肠杆菌（BL21）并在谷胱甘肽-Sepharose树脂（Amersham）上纯化。从Neosystem中获得了HPLC纯化的Beclin野生型（GTMENLSRRLKVTGDLFDIMSGQTDV）、Beclin L116A（GTMELLSRAKVTGDLFdiMSGQTDV）、Beclin F123A（GTMENLSRRLKVTGDLADIMSGQTDV）和Bak BH3（GQVGRQLAIIGDDINR）肽。

荧光偏振测定

荧光偏振（FP）分析（使用Fusion™-Packard设备测量）基本上按照所述进行(乐泰等。, 2002). 简单来说，对于竞争实验，荧光Bak BH3肽（15 nM）和GST-Bcl-XL（左）（100 nM）在结合缓冲液（20 mM Na）中混合2高性能操作4pH 7.4，50 mM NaCl，1 mM EDTA和0.05%pluronic acid），滴定竞争肽（Beclin野生型，Beclin L116A，Beclin-F123A或Bak BH3，从10−9到10−4M） 。对于亲和常数(K（K）d日)计算，荧光Beclin肽（15 nM）与不断增加的GST-Bcl-X混合L（左）野生型或GST-Bcl-XL（左）G138A（10−9–10−5M） ●●●●。

协同免疫沉淀实验

使用Effecten试剂（Qiagen）与pcDNA3topoD载体（Invitrogen）瞬时转染HeLa细胞，该载体表达V5-His-tagged Beclin构建物（野生型、L116A或F123A）或与Flag-taged Bcl-X联合表达L（左）野生型，Bcl-XL（左）G138A、Bcl-2野生型或Mcl-1野生型（p3X标记向量，Sigma）。20小时后，收集细胞并在RIPA缓冲液中溶解。然后用反标记珠（Sigma）对清除的裂解产物进行免疫沉淀。免疫沉淀用抗Beclin抗体（Santa Cruz，H300）、抗Bcl-X免疫印迹分析L（左）（转导实验室）或抗Mcl-1（SantaCruz，S19）。HeLa电池、MV4.11、WT和Bad−/−MEF和表达Bcl-2 Acta或Bcl-2 Cb5（10×106收集、裂解和/分离（美国G Biosciences的FOCUS™SubCell），并进行免疫沉淀(陈等, 2004)使用抗Bcl-2（Santa Cruz）抗体和蛋白G-Sepharose（GE Healthcare），然后免疫印迹检测Beclin-1和Bad（SantaCruz抗体）。

蛋白质印迹分析

细胞在4°C下用冷PBS洗涤并溶解。将40μg蛋白质加载到10%SDS–PAGE上，并转移到硝化纤维素中。将膜在含有5%脱脂奶的PBS-Tween 20（0.05%）中培养1小时。抗Beclin1一级抗体（SantaCruz）、Bad（SantaCruz）和hVps（Zymed）在4°C下孵育15 h，并用适当的辣根过氧化物酶标记的二级抗体（Southern Biotechnologies Associates）和SuperSignal West Pico化学发光底物（Pierce）显示。使用抗-GAPDH（Chemicon）、抗Hsp60（Sigma）或抗钙网蛋白（Stressgen）抗体以确保负载均衡。

流式细胞术

以下荧光色素用于通过细胞荧光测定法测定凋亡相关的变化：3,3′-二己基氧羰基菁碘（DiOC6（3） （40 nM）用于线粒体跨膜电位（ΔΨ米)和碘化丙啶（PI；1μg/ml）用于测定细胞活力（分子探针）(冈萨雷斯-波洛等, 2005). 37°C下用荧光色素标记胰蛋白酶化细胞，然后用荧光激活细胞分选仪（FACS）扫描进行细胞荧光分析（Becton Dickinson）。

光学显微镜、免疫荧光和电子显微镜

盖玻片上培养的细胞用Cell Tracker Green 5-氯甲基荧光素二乙酸酯（CMFDA（1μM））染色；分子探针）和Hoechst 33342（2μM；Sigma）。或者，用多聚甲醛（4%w:v）固定细胞以进行LC3-GFP和免疫荧光分析(奥贝德等, 2007). LC3-GFP在细胞质和细胞核中呈弥散分布的细胞被认为是非自噬性的，而代表无核LC3-GFP的几个密集的间断LC3-GFP-聚集体的细胞被归类为自噬细胞。两名独立的研究人员（MC Maiuri和A Criollo或E Tasdemir）读取每个LC3-GFP染色。按照描述进行透射电子显微镜检查(冈萨雷斯-波洛等, 2005).

线虫实验

生成p液化天然气−1DsREDLGG-1报告子结构，我们将DsRED融合到秀丽线虫LGG-1。一个750 bp的片段包含lgg-1型使用以下寡核苷酸扩增基因：5′-GGAATTCGAGTGGGCTTACAAGGA-3′和5′-GAATTCGTCTTCTTCGTTTATTCATCG-3′，并插入DsRED的C末端。记者融合被置于lgg-1型发起人。为了获得启动子，我们在lgg-1型使用以下寡核苷酸的基因：5′-ACATGCATGCGCACTTCAAGGCGAGTA-3′和5′-GGGTACTCTCCTTGTAAGCCACTT-3′。将报告构建物与携带p肌−2GFP报告融合，在咽肌细胞中表达GFP，作为转化标记物。转基因雄性与egl-1突变雌雄同体获得携带自噬标记的突变体(布伦纳，1974年). 这个秀丽线虫菌株N2：野生型布里斯托尔分离物，MT1082：egl-1（n487），RB1305：egl-1（ok1418）,N2；前任[第页液化天然气−1DsREDбLGG-1]，egl-1（n487）；前任[第页液化天然气−1DsREDбLGG-1]和egl-1（ok1418）；前任[第页液化天然气−1DsREDLGG-1]是从秀丽线虫Knockout Consortium（美国俄克拉荷马医学研究基金会Robert Barstead）或隐杆线虫病遗传学中心（Theresa Stiernagle，明尼苏达大学，美国明尼阿波利斯）。为了监测胚胎中DsREDLGG-1的水平，从转基因妊娠雌雄同体成年人中获取卵子，表达p液化天然气−1DsRED｜LGG-1。在饥饿实验中，L4晚期幼虫阶段的动物在没有食物的情况下生长，并在成年后12-24小时内收集卵。

在Axioskop 2 Plus表观荧光显微镜上拍摄了表达DsRED的转基因胚胎（德国耶拿卡尔蔡司）。使用480±10 nm带通激励滤波器和515±15 nm带通发射滤波器采集图像。实验在20°C下进行，每次实验的摄影曝光时间保持不变。在像素深度为8位（256灰度）的灰度图像上测量发射强度。使用ImageJ软件确定这些图像中每个胚胎的平均和最大像素强度（三次独立试验中至少25个）(http://rsb.info.nih.gov/ij/).

补充材料

补充图1

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补充图2

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补充图3

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补充图4

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致谢

我们感谢Bert Vogelstein（马萨诸塞州贝塞斯达约翰霍普金斯大学）捐赠Bax缺乏的HCT116细胞，Andreas Villunger（奥地利因斯布鲁克大学）捐赠阴性MEF，David Andrews捐赠表达Bcl-2 Acta cb5的细胞，Abdelali Jalil捐赠共焦显微镜，Thierry Le Diguarher捐赠合成ABT737。线虫菌株由秀丽线虫OMRF基因敲除项目(http://www.mutantfactory.ouhsc.edu/)，这是国际秀丽线虫基因敲除联盟，以及隐杆线虫病遗传中心，由NIH国家研究资源中心（NCRR）资助。GK得到了癌症控制法、欧盟委员会（活性p53、化疗药物、TransDeath、Right、死亡列车）和服务研究所的支持。PJ由施维雅研究院提供支持。

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文章来自欧洲分子生物学组织由以下人员提供自然出版集团