帕金森氏病（PD）是最常见的运动障碍，其病理特征是大脑多巴胺含量不足和黑质多巴胺能神经元选择性变性。最常见的PD是散发性的，没有已知原因。然而，尸检研究已确定与散发性PD相关的共同特征，如线粒体复合物I功能障碍、氧化应激和异常蛋白聚集(1,2).
虽然对帕金森病病因的初步研究侧重于环境因素，但最近的遗传学研究已牢固确立遗传因素在帕金森病发病机制中的作用(2,三)。至少有十个不同的基因座与罕见的家族性PD（FPD）相关。预计了解与这些FPD基因相关的分子病变将有助于阐明更常见的疾病的发病机制。显性突变α突触核蛋白(α-合成)和LRRK2型/达尔文和隐性突变停车场,DJ-1型、和粉红色1已与FPD关联(4——10)。在这五个基因中，α-合成,停车场、和DJ-1型已经进行了最深入的研究。研究使用体内动物模型和在体外细胞培养将这些基因的突变与线粒体结构和功能的损伤以及氧化应激反应联系起来，从而加强了线粒体功能障碍和氧化应激在PD发病机制中的普遍参与(11——21)。与这一概念一致，这些蛋白质已被证明存在于线粒体中或与线粒体蛋白质相互作用(8,22——24)表明它们可能直接调节线粒体功能。
Pink1编码Ca的预测Ser/Thr激酶，这一事实支持了线粒体和PD之间的进一步联系2+/定位于线粒体的钙调蛋白家族(8)。通过转染细胞显示Pink1蛋白的线粒体定位(8,25,26).体外生化研究表明Pink1具有自磷酸化活性，Pink1的致病性突变对这种活性有不同的影响(25,26)。这个体内Pink1的底物和分子功能未知。细胞培养研究表明，野生型Pink1的过度表达可导致细胞色素减少c（c）线粒体释放并阻止caspase在基础和凋亡应激条件下的后续激活(27)。这一结果表明，Pink1可能在调节线粒体生理和/或细胞死亡的线粒体途径中发挥关键作用，尽管体内这些发现的相关性尚待确定。
为了了解Pink1的生理功能及其功能障碍如何导致PD，我们使用了果蝇属作为一个模型系统。在这里，我们描述了由果蝇属粉红色1（dPink1）。我们的结果表明，dPink1是维持适当线粒体形态和肌细胞和多巴胺能神经元亚群完整性所必需的。值得注意的是，我们发现Pink1和Parkin表现出明显的遗传和生物化学相互作用。我们的结果表明，Parkin和Pink1在共同的分子途径中发挥作用，调节线粒体功能和选择性细胞类型的存活。
结果
转基因RNAi抑制dPink1表达。
在已测序的苍蝇基因组中，人类Pink1（hPink1）的一个同源物是dPink1。虽然dPink1和hPink1在氨基酸水平上的同源性约为26%，但它们在DNA水平上的相似性很低，因为一些序列同源性预测算法未能检测到两者之间的显著同源性。基于hPink1功能丧失与家族性PD相关的事实，我们使用转基因RNAi方法敲低dPink1的表达，以建立Pink1相关PD的模型d粉红色1dsRNA导致内源性d粉红色1转录本，我们使用RT-PCR来测量d粉红色1普遍诱导RNAi后的mRNA水平。An≈减少80%d引脚1观察到mRNA(A类)。接下来，我们使用针对dPink1的多克隆抗体来分析RNAi对内源性dPink 1蛋白表达的影响。如所示B类普遍存在的dPink1 RNAi导致内源性dPink 1蛋白水平类似程度的降低。综上所述，这些结果表明我们的RNAi方法能够有效降低dPink1 mRNA和蛋白的表达。
RNAi对dPink1的抑制会导致翅膀姿势异常、寿命缩短和ATP缺乏等缺陷。(A类和B类)RNAi后dPink1 mRNA和蛋白质水平的RT-PCR和Western blot分析。基因型：1，Da-Gal4公司/+; 2,Da-Gal4型>dPink1 RNA干扰RP49和微管蛋白作为对照。(C类——E类)对照组和对照组的翅膀姿势表型d粉红色1RNAi飞行。左，女性；对，男性。苍蝇出生7天，饲养温度为29°C。(C类)控制苍蝇的直翅姿势。(D类)d粉红色1RNAi苍蝇展翅。(E类)d粉红色1RNAi苍蝇翅膀下垂。(F类)年取消的飞行活动d引脚1RNAi飞行。使用了两条独立的线路。(G公司)d粉红色1RNAi苍蝇的ATP含量表现出更明显的年龄依赖性下降。(H（H）)女性d粉红色1苍蝇寿命缩短。(A类——H（H）)RNAi是通过使用UAS-dPink1 RNAi由驱动的构造Da-Gal4公司. ∗,P（P）<0.01学生t吨测试。
dPink1的普遍抑制会导致机翼姿态异常、能量消耗和寿命缩短。
接下来我们分析了抑制dPink1功能的生理后果。首先，我们使用没有女儿的(Da公司)-镀锌4驱动表达d粉红色1dsRNA普遍存在。dPink1普遍受到抑制后，成虫出现，这表明dPink 1的缺失不会导致死亡果蝇属或者通过这种转基因RNAi方法减少dPink1表达的水平不足以导致致死。
这些基因的第一个可识别表型dPink1 RNA干扰苍蝇的翅膀姿势异常：雌蝇和雄蝇都表现出一种搁置状态(D类)或下垂(E类)翅膀姿势，而控制苍蝇总是保持翅膀平行于身体轴线(C类)。该表型的外显率随着年龄的增长而增加：当在29°C下饲养时，≈20%的新羽化的苍蝇表现出异常的翅膀姿势，而到7天龄时，近100%的苍蝇显示出该表型。这些苍蝇走路没有问题，但它们的攀爬能力大大降低，到了10天大的时候，它们的飞行能力就完全丧失了(F类)。这种表型在两个独立的dPink1 RNA干扰行分析。
考虑到飞行是一个依赖线粒体ATP合成的相当耗能的生理过程，并且hPink1已被报道与线粒体有关，我们随后测量了线粒体的能量供应dPink1 RNA干扰苍蝇，以ATP水平为指标。我们的HPLC数据显示，与对照果蝇相比，dPink1 RNAi果蝇的总ATP水平降低了约70%（图6，作为PNAS网站上的支持信息发布）。为了测试这种ATP缺乏是否是年龄依赖性的，我们利用了转基因表达水平是温度依赖性的这一事实UAS-镀锌4系统。我们将苍蝇在18°C下饲养至羽化，以最小化RNAi效应，然后在羽化后立即将其转移至29°C，以诱导更强的RNAi作用。我们的高效液相色谱分析清楚地表明，尽管新公布的dPink1 RNA干扰果蝇与对照果蝇相当，在一周内急剧下降至控制水平的≈40%，在该实验条件下，2周后该水平保持在较低水平(G公司)。接下来我们问能量缺乏是否影响dPink1 RNA干扰苍蝇。我们发现dPink1的整体抑制显著降低了寿命(H（H）图7，作为支持信息发布在PNAS网站上）。综上所述，这些数据表明Pink1在调节能量代谢方面发挥着重要作用，并且该功能对寿命有影响。
敲除dPink1诱导的选择性肌肉退化。
机翼姿态异常的一个可能的解剖学基础可能是飞行肌肉缺陷。间接飞行肌肉（IFM）的组织学分析Da-Gal4公司>dPink1 RNA干扰苍蝇的肌肉完整性严重受损，这与这些苍蝇的飞行能力被取消的发现一致(B类)。在翼升肌[背腹肌（DVM）]和降肌[背纵肌（DLM）]中观察到肌肉完整性受损。为了确定dPink1是否在飞行肌肉中发挥直接作用，我们用肌球蛋白重链(Mhc公司)-镀锌4驱动程序。尽管外显率较低（约40%的7日龄苍蝇在29°C下饲养），但我们在肌肉特异性dPink1基因敲除的苍蝇中观察到类似的异常翅膀姿势和肌肉断裂( D类和J型)。外显率较低可能是因为RNAi的效率较低Mhc-Gal4公司非肌肉细胞对普遍存在的RNAi动物中观察到的表型的驱动或贡献。一些证据表明，这种肌肉表型是由RNAi对dPink1的特异性抑制所致。首先，表达白色,DJ-1A型，或DJ-1B型由同一驱动的dsRNAs镀锌4驾驶员对飞行肌肉没有影响（数据未显示）。其次，我们可以通过增加dPink1的表达来挽救这种组织特异性RNAi表型。我们通过提高d粉红色1转录本，RNAi效应可能会被抑制。事实上无人机-dPink1转基因可抑制dPink1 RNAi诱导的异常翅膀和肌肉表型( E类和K（K）)。由于通过添加无人机转基因，因为UAS-GFP公司转基因对表型没有影响( F类和L（左）)。最后，我们可以通过肌肉中全长hPink1的共表达来拯救dPink1 RNAi表型( G公司和M（M）)。然而，C末端截短形式的hPink1（hPink 1ΔC）无法救援( H（H）和N个)与hPink1的C端截断与家族性PD相关的研究结果一致(8,28)。事实上，我们使用表达可比水平全长hPink1和hPink 1ΔC的转基因果蝇，排除了hPinkl差异表达导致差异救援效果的可能性（图8，作为PNAS网站上的支持信息发布）。相反，该结果表明hPink1可以在功能上替代dPink1。DNA序列水平上的分歧d粉红色1和hPink1基因使其不太可能h粉红色1RNA会干扰d粉红色1此外，对应于d粉红色1dsRNA靶序列在两个全长中都完整存在h粉红色1和hPink1ΔC构建，使hPink1ΔC与全长一样有能力h粉红色1如果发生这种情况，RNAi机器的竞争饱和。综上所述，我们得出结论，异常的翅膀/肌肉表型是由dPink1失活引起的。
抑制dPink1会导致IFM受损。(A-H公司)使用光学显微镜检查IFM结构（恒星、背纵肌；箭头、背腹肌）。用甲苯胺蓝对1周龄成虫的树脂包埋胸膜切片进行染色，以观察组织形态；前面是左边。(我——N个)控制和dPink1 RNAi飞行的翼姿表型Mhc-Gal4公司.苍蝇基因型为Da-Gal4公司/+(A类),Da-Gal4公司>无人机-dPink1核糖核酸干扰(B类),Mhc-Gal4公司/+(C类和我),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi(D类和J型),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi;UAS-dPink1型(E类和K（K）),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi;UAS-GFP公司(F类和L（左）),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi;UAS-hPink1型(G公司和M（M）),Mhc-铝4>UAS-dPink1 RNAi;UAS-hPink1ΔC(H（H）和N个).
肌特异性dPink1 RNAi苍蝇表现出线粒体功能障碍、DNA片段化和线虫样肌病。
然后我们使用透射电子显微镜进一步研究肌肉缺陷的性质。野生型成人IFM具有高度规则和紧密的肌原纤维排列，许多紧密排列的电子致密线粒体散布在成行的肌节之间(A类)。无论是普遍存在的还是肌肉特有的dPink1 RNA干扰苍蝇，一些IFM表现出不规则和分散的肌原纤维排列(B类)。肌原纤维中的线粒体数量减少，而剩余的许多线粒体严重肿胀，缺乏电子致密物质，并显示嵴解体(B类)。有趣的是，在IFM的区域内有电子密集的沉积物，这些沉积物因严重的破坏而失效(B类)，让人想起人类的尼马林（杆状体）肌病(29)。值得注意的是，形态正常的肌原纤维中存在异常肿胀的线粒体(B类)。与组织学观察一致，肌原纤维和线粒体完整性可以通过全长hPink1的过度表达恢复(C类)但不是hPink1ΔC(D类).
肌肉特异性d粉红色1RNAi导致IFM中的肌肉病理学和年龄依赖性细胞凋亡。(A类——D类)以下基因型苍蝇IFM超微结构的EM分析：Mhc-Gal4公司/+(A类),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi(B类),Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi;无人机-hPink1(C类)、和Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi;UAS-hPink1ΔC(D类)。箭头，线粒体肿胀；箭头、杆体状沉积物。(E类和F类)小鼠TTM超微结构的电镜分析Mhc-Gal4公司/+(E类)和Mhc-Gal4公司>UAS-dPink1 RNAi(F类)苍蝇。每个图像的左下角显示比例尺（5μm）。(G公司和H（H）)TUNEL染色法检测新闭胸的胸肌(G公司)和1周龄(H（H）)Mhc-gal4型>d粉红色1RNAi飞行。左侧DAPI染色；居中TUNEL染色；赖特，合并了图像。箭头指向TUNEL阳性核。
与干扰素相比，拇趾粗隆间肌（TTM）或“跳跃”肌在肌肉特异性中保持相当正常dPink1 RNA干扰苍蝇(F类，与相比E类)。由于Mhc-GAL4公司，因为携带普遍存在的dPink1 RNAi的苍蝇也有正常的TTM。TTM的线粒体明显少于IFM。我们推测IFM和TTM之间的表型差异可能与其不同的能量需求有关。
调查肌肉退化是否dPink1 RNA干扰通过细胞死亡机制发育的果蝇，对IFM进行末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析。当在4天龄时分析时，普遍且持续诱导dPink1 RNAi的苍蝇在IFM中显示出广泛的TUNEL阳性信号，而年龄匹配的对照苍蝇则缺乏这种染色（图9，作为PNAS网站上的支持信息发布）。为了排除任何发育影响，并测试TUNEL阳性信号是否可以逐步诱导，肌肉特异性dPink1 RNA干扰苍蝇受到前面提到的温度变化协议的影响。在18°C下新出现的苍蝇的IFM中未检测到阳性TUNEL信号(G公司)。然而，在切换到29°C并在该温度下持续保持7天之后，dPink1核糖核酸干扰苍蝇很容易在IFM中显示出许多TUNEL阳性细胞核(H（H）)尽管相同的处理对对照苍蝇没有效果。这些数据表明，肌肉特异性dPink1 RNAi可能导致以广泛DNA断裂为特征的年龄依赖性肌肉退化，这可能预示着细胞死亡。
多巴胺能神经元中dPink1的失活导致酪氨酸羟化酶（TH）+神经元的丢失和大脑多巴胺含量的降低。
接下来，我们分析了通过用多巴胺能神经元特异性诱导dPink1 RNAi来抑制多巴胺能神经细胞中dPink 1功能的作用TH-铝4驱动程序。通过对成年苍蝇全脑制剂进行TH免疫染色来检测中枢神经系统中是否存在多巴胺能神经元。对照组和对照组不同多巴胺能簇中TH+神经元的数量dPink1 RNA干扰对苍蝇进行计数并进行统计分析。如所示B类，25日龄dPink1 RNA干扰在29°C下饲养的苍蝇显示，外侧原脑后部（PPL1）簇中的TH+神经元显著减少。背内侧原大脑后部（PPM）簇[也称为背内侧簇（DMC）]也显示神经元数量适度减少，而其他簇相对不受影响(F类)。重要的是，正如在肌肉中观察到的那样，全长hPink1而非hPink 1ΔC的共表达能够抑制多巴胺能表型( C类,D类、和F类)。仅hPink1或hPink 1ΔC的过度表达对TH+神经元数量没有影响（数据未显示）。
多巴胺能缺陷d粉红色1RNAi飞行。(A类——E类)以下基因型25日龄苍蝇背外侧前脑后部（PPL1）簇状神经元的全脑TH免疫染色：TH-铝4/+(A类),TH-铝4/UAS-dPink1 RNAi;UAS-GFP公司(B类),TH-铝4/UAS-dPink1 RNAi;UAS-hPink1ΔC(C类),TH-铝4/UAS-dPink1 RNAi;UAS-hPink1型(D类)、和TH-铝4/UAS-dPink1 RNAi;UAS-hParkin公司(E类)。(F类)具有指定基因型的苍蝇成年大脑中单个多巴胺能簇中TH+神经元的量化。*，P（P）<0.01（学生）t吨测试。(G公司)头部多巴胺水平的量化TH-铝4/+,TH-铝4/UAS-白色RNAi，或TH-铝4/UAS-dPink1RNAi公司苍蝇，与白色RNAi苍蝇作为对照。*，P（P）<0.01（学生）t吨测试。
为了进一步证实dPink1缺失会导致多巴胺能功能障碍，我们使用从对照组和dPink1 RNA干扰苍蝇。在新关闭的苍蝇中，对照组和对照组的多巴胺含量相当dPink1核糖核酸干扰苍蝇(G公司)。随着苍蝇的衰老dPink1 RNA干扰苍蝇的多巴胺水平呈年龄依赖性下降。然而，dPink1 RNA干扰苍蝇持续表现出比对照组更显著的减少(G公司)。全长hPink1而非hPink 1ΔC的过度表达，完全恢复了dPink1 RNAi动物的多巴胺水平（图10，作为PNAS网站上的支持信息发布）。综上所述，这些数据表明dPink1在促进多巴胺能神经元功能和存活方面起着关键作用。
Parkin的过度表达挽救了dPink1失活引起的肌肉和多巴胺能表型。
我们注意到我们dPink1 RNA干扰苍蝇和停车场肌肉中的突变苍蝇与多巴胺能病理学(12,30,31)。这一观察促使我们研究Parkin和Pink1是否参与了常见的生理过程。令人惊讶的是，由dPink1 RNAi引起的异常翅膀姿势可以通过人类Parkin（hParkin）的过度表达来挽救(A类)，而hDJ-1(B类)或dDJ-1A过度表达无拯救作用。组织学和EM分析表明，翅膀表型的抑制伴随着肌原纤维完整性和线粒体形态的恢复( C类和E类，与相比 D类和F类)。此外，hParkin的过度表达能够恢复dPink1 RNA干扰苍蝇(G公司)。重要的是，hParkin在dPink1 RNA干扰后台恢复TH的编号+PPL1和背内侧前脑后部（PPM1）簇中的神经元( E类和F类)。然而，尽管hParkin的过度表达显示出一种趋势，即在dPink1 RNA干扰动物，该效果在统计学上不显著（图10）。因此，hParkin的过度表达能够挽救由dPink1失活引起的大多数但不是全部缺陷。
Pink1和Parkin.翅膀姿势之间的遗传和生化相互作用(A类和B类)，胸部肌肉组织学(C类和D类)和IFM EM图像(E类和F类)第页，共页Mhc-Gal4公司/UAS-dPink1 RNAi;UAS-hParkin公司(A类,C类、和E类)、和Mhc-铝4/UAS-dPink1 RNAi;UAS-hDJ-1型(B类,D类、和F类)展示了苍蝇。比例尺（2μm）英寸E类和F类显示在左下角。(G公司)指示基因型的全身ATP测量。*，P（P）<0.01（学生）t吨测试。(H（H）)Western blot分析显示dParkin水平降低dPink1 RNA干扰动物。蛋白质提取物制备自Da-Gal4公司/+和Da-Gal4公司/UAS-dPink1 RNAi用抗dParkin抗体检测动物。肌动蛋白起蛋白质负荷控制作用。
为了进一步了解Parkin过度表达拯救dPink1 RNAi表型的分子机制，我们检测了dPink1RNAi动物的Parkin蛋白水平。如所示H（H）dPink1RNAi动物的Parkin蛋白水平与对照组相比显著降低。因此，通过Parkin过度表达拯救dPink1 RNAi表型可能是因为Parkin蛋白表达和活性的恢复。
讨论
在本研究中，我们发现dPink1在果蝇属导致线粒体异常和肌纤维亚群和多巴胺能神经元变性。dPink1和果蝇属Parkin（dParkin）失活促使我们对其遗传和生化关系进行研究。我们发现hParkin的过度表达，而不是DJ-1，可以挽救由dPink1失活引起的肌肉和多巴胺能病理。与遗传相互作用结果一致，我们发现dPink1 RNAi动物体内的dParkin水平显著降低。总之，这些结果强烈表明Parkin和Pink1在一个共同的细胞途径中发挥作用，该途径通常促进包括多巴胺能神经元在内的选定细胞类型的功能和存活，Parkin可能在该途径中作用于Pink1的下游。
Pink1功能障碍诱导的退化表型的分子机制可能是什么？至少可以设想三种可能性。首先，Pink1可能调节能量代谢。当Pink1功能受损时，对能量需求最大的组织，可能是IFM和多巴胺能神经元，可能变得特别脆弱。我们观察到抑制Pink1会导致ATP耗竭，这与这种可能性是一致的。第二种可能性是，如前所述，Pink1可能在正常情况下被需要来阻止凋亡细胞死亡的线粒体途径(27)。在这方面，有趣的是，Parkin也被证明可以防止线粒体肿胀和细胞色素c（c）线粒体依赖性细胞死亡的释放(23)。因此，Parkin和Pink1可能参与一种共同的途径，保护细胞免受由毒性损伤引起的线粒体依赖性细胞死亡。与Parkin和Pink1失活相关的异常线粒体形态也表明第三种可能性，即它们可能在调节线粒体生物发生或线粒体动力学（如线粒体融合或裂变事件）中发挥基本作用。线粒体异常分裂/融合与神经退行性变之间的联系以前已经被认识到(32)。需要进一步的研究来区分这些可能性。
我们的体内救援研究清楚地表明，hPink1的C末端是hPink 1拯救dPink1 RNAi表型所必需的。因此，尽管C端删除形式的Pink1可能具有更高的在体外激酶活性与自磷酸化(26)它无法提供Pink1的全谱生物活性。C末端缺失可能影响Pink1与其底物或其他辅因子的结合。或者，Pink1 C末端的缺失可能通过导致Pink1激酶活性的失调而导致疾病发病。
我们的体内生化研究表明，dPink1 RNAi动物的dParkin水平显著降低。这一结果解释了为什么Pink1和Parkin突变体具有非常相似的突变表型，以及为什么Parkin过度表达可以拯救dPink1 RNAi表型。它进一步支持了Parkin在Pink1下游共同途径中发挥作用的观点。Pink1调节Parkin蛋白水平的生化机制需要进一步研究。总之，在dPink1 RNAi动物中观察到的线粒体病理学、IFM和多巴胺能神经元变性表型以及Pink1和Parkin之间明确的遗传相互作用表明，对涉及Pink1与Parkin的细胞途径的进一步遗传分析将揭示控制线粒体和细胞的基本机制维护。这种机制可能适用于哺乳动物系统。
材料和方法
果蝇属遗传学。
根据标准程序进行苍蝇培养和杂交，并在指定温度下饲养。所有普通蝇类和镀锌4线路是从布卢明顿获得的果蝇属库存中心。这个TH-GAL4公司司机是Serge Birman（法国马赛马赛研究所发育生物学）赠送的礼物(33)。其他苍蝇种群如前所述：无人机-hParkin公司(34),UAS-hDJ-1型(21)、和UAS-白色RNAi(35)。要生成UAS-dPink1 RNAi如前所述，产生转基因、基因组DNA/cDNA杂交构建物(35)，cDNA序列被以下PCR引物（5′-TTCTCGCCACCGCCCCCACACTTC和3′-CCGCGCACATTGGCAGCGGTGG）覆盖。
分子生物学。
制造UAS-hPink1型,UAS-hPink1ΔC和UAS-d粉红色1将相应的cDNA克隆到普华斯特矢量。含有hPink1 cDNA的质粒是由M.Unoki赠送的(36)。这个hPink1ΔC该结构包含第一个509氨基酸，模拟了报告的与疾病相关的C末端截断形式的hPink1(28)。如有要求，可提供克隆步骤的详细信息。对于RT-PCR分析，来自UAS-dPink1 RNAi和Da-GAL4公司使用RNeasy试剂盒（Qiagen）在29°C下培养，以制备总RNA。定量RT-PCR程序的细节基本上如所述(34)。用从表达dPINK1的细菌培养物中纯化的重组蛋白在兔体内诱导出dPINK1抗体pGEX-6P-1-油墨1C，包含dPink1的C末端97 aa（氨基酸624至721）。使用该抗体进行Western blot分析，如下所述(34)使用1:1000稀释度的一级抗体。将来自N.Hattori（日本东京都大学）的礼物hParkin cDNA插入C末端带有Myc标签的pcDNA3载体中。兔抗-果蝇属针对重组GST提高TH抗体-果蝇属细菌产生TH（较长亚型，1–328 aa）。粗血清用NHS活化的Sepharose（通用电气生物科学）与可溶性细菌蛋白进行免疫吸附。使用上清液（1:500）进行免疫染色。
组织学和免疫组织化学、肌肉组织学和透射电镜分析。
如前所述，进行TH染色的整体免疫组化(31)。每个基因型在每个时间点平均检查八只苍蝇，每个实验至少重复一次。按照说明进行肌肉组织学和透射电镜分析(31)，除了Epon树脂用于包埋。为了进行TUNEL分析，将成虫固定在冰镇4%甲醛/PBS中3 h。为了进行渗透，使用1%Triton和预冷丙酮。然后解剖头部和腹部，并根据制造商的说明（Roche和Promega）对胸部进行TUNEL分析。
飞行和寿命分析。
为了进行飞行分析，将≈15只对照苍蝇和实验苍蝇放在单独的小瓶中。早上晚些时候，飞行事件被连续计算了两分钟，然后进行平均。对于寿命分析，将苍蝇维持在29°C的标准培养基上，每小瓶15只苍蝇，并每天转移到新的食物培养基中。每天对死亡率进行评分。
ATP和多巴胺测量。
为了进行全氟ATP测量，将活的成年苍蝇放入液氮中进行快速冷冻。将60微升干冰包埋乙腈添加到三只苍蝇中，将其均质，同时添加冰镇去离子H2O.匀浆在13200×克在4°C下保持15分钟，将50μl上清液与50μl去离子H混合2O、 再次离心，准备进行HPLC分析。ATP含量的HPLC分析基本上按照所述进行(37,38)。儿茶酚胺水平的HPLC分析如下所述(39,40)。为了制备样品，使用电动手持式组织研磨机将成年雄性苍蝇头解剖出来，并在0.1 M高氯酸（通常每四个或五个头50μl）中均质。在进行HPLC分析之前，立即将匀浆冷冻在干冰上，并在−80°C下保存。
