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分子细胞生物学。2003年1月；23（1）：140–149。
数字对象标识：10.1128/MCB.23.140-149.2003年
预防性维修识别码：项目经理140670
PMID：12482968

激活信号协整器2属于一种新的稳定态复合物，该复合物包含一组三胸群蛋白质

杨华古,1 年轻的张松,2 金大焕,三 Seung-Whan Kim先生,1 闵荣康,1 董菊君,1 尤妮·夸克,1 尼科莱·A·巴列夫,4 雪莱·L·伯杰,4 文森特·周,5 罗伯特·罗德,6 大卫·O·阿索萨,7 保罗·S·梅尔泽,7 Pan-Gil Suh公司,1 恩珠颂,8 孔佐利（Kong-Joo Lee）,8 李英哲,三，*和李在云（Jae Woon Lee）1中，*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

许多转录辅激活子以配体和C末端反式激活功能（AF2）依赖的方式与核受体相互作用。其中包括激活信号协整因子2（ASC-2），这是一种最近分离的转录辅激活因子分子，在人类癌症中被放大，并通过核受体和许多其他转录因子刺激反式激活。在本报告中，我们表明ASC-2属于HeLa核中约2 MDa的稳态络合物（ASC-2络合物[ASCOM]）。ASCOM包含视网膜母细胞瘤结合蛋白RBQ-3、α/β-微管蛋白和三胸类蛋白ALR-1、ALR-2、HALR和ASH2。特别是，ALR-1/2和HALR包含一个高度保守的130到140氨基酸基序，称为SET结构域，最近与组蛋白H3赖氨酸特异性甲基化活性有关。事实上，重组ALR-1、HALR和免疫纯化ASCOM在体外表现出非常微弱但特异的H3-赖氨酸4甲基化活性，维甲酸受体的反式激活似乎涉及ASCOM的配体依赖性募集和体内启动子区随后的短暂H3-赖胺酸4甲基化合作。因此，ASCOM可能代表核受体的一种独特的辅活化复合物。ASCOM的进一步表征将有助于更好地理解核受体和其他转录因子如何介导转录激活。

核受体超家族是一组蛋白质，通过与称为激素反应元件的特定DNA序列结合，以配体依赖的方式调节靶基因的转录起始（参考文献综述23). 核受体的功能分析表明，有两个主要的激活域。N末端结构域（AF1）包含配体依赖性激活功能，而配体结合结构域（LBD）则显示配体依赖的反式激活功能（AF2）。AF2核心区位于受体LBD的C末端，在核受体之间保守，在配体结合时发生重大构象变化(23). 该区域作为配体依赖的相互作用界面，与许多不同的辅活化因子（在参考文献中综述9). 这些共激活子，包括p160家族成员（即SRC-1、SRC-2/GRIP1/TIF2和SRC-3/ACTR/pCIP/AIB1/RAC3/TRAM1）、CBP/p300、p/CAF、TRAP/DRIP、激活信号协整器2（ASC-2）和许多其他分子，桥接核受体和基础转录装置和/或重塑染色质结构(9)。

染色质是所有真核生物遗传信息的生理模板，它经历了一系列不同的翻译后修饰，这些修饰在很大程度上影响组蛋白氨基末端，从而调节对潜在DNA的访问（参考文献综述12). SRC-1和p160家族成员ACTR以及CBP和p300最近被证明含有组蛋白乙酰转移酶（HAT）活性，并与另一种HAT蛋白p/CAF相关(9). 相反，SMRT和N-CoR（核受体辅阻遏物）与Sin3和组蛋白去乙酰化酶蛋白形成复合物(9). 这些结果与组蛋白的乙酰化破坏核小体的稳定性，并通过允许转录因子进入识别元件来减轻转录抑制的概念一致，而组蛋白的去乙酰化则稳定被抑制的状态。最近，组蛋白精氨酸甲基转移酶CARM1和PRMT1被新定义为核受体的转录辅活化子(4,40). NSD1和RIZ1，两个额外的协同调节蛋白，具有甲基化组蛋白已知的SET结构域(6,16,26,28,33,35,42,46)，也有报道(10,50). 同样，人们可以期望识别其他具有其他组蛋白修饰活性的辅活化分子，如赖氨酸甲基化、泛素化和磷酸化。这些不同的组蛋白氨基末端修饰可以以组合方式为染色质相关蛋白产生协同或拮抗相互作用亲和力，这反过来指示转录活性或转录沉默染色质状态之间的动态转换(12)。

AF2依赖性辅活化子的一个独特结构特征是LXXLL特征基序（即核受体[NR]盒）的存在(9). AF2核心区（螺旋12）在配体结合后发生重大重组，形成带电钳的一部分，通过与这些NR盒的直接接触，在受体LBD的疏水缝隙内容纳辅活化子(9). 有趣的是，N-CoR/SMRT核受体相互作用基序展示了I/LXXI/HI的一致序列（即CoRNR框，其中H表示疏水残基）(9)与辅激活剂结合所需的同一受体口袋中的特定残基相互作用。因此，核受体AF2核对辅活化子和辅抑制子相互作用螺旋之间细微差异的区分可能为辅活化子与辅抑制子的交换提供分子基础，电荷钳的形成依赖于配体，稳定NR盒结合并抑制与CoRNR盒螺旋的相互作用。

ASC-2，也称为AIB3、TRBP、TRAP250、NRC和PRIP，是一种在某些人类癌症中扩增和过度表达的新型辅激活基因(三,8,14,17,18,19,22,52). 有趣的是，ASC-2包含两个NR框。C端NR盒与肝脏X受体特异性相互作用，N端盒结合许多不同的核受体，包括维甲酸受体（RAR）(19). 过度表达ASC-2片段DN1（ASC-2残基849至929，包含N末端基序）但不表达DN1/m（其中LXXLL序列突变为LXXAA以禁用受体结合）的转基因小鼠在RAR和其他受体介导的许多信号通路中显著受损，其中DN1竞争性地阻断了这些受体与全长内源性ASC-2（13a）的相互作用。此外，单细胞微量注射抗ASC-2的中和抗体消除了RAR和其他与ASC-2相互作用的核受体的反式激活(17; 我们未发表的结果）。综上所述，ASC-2可能是体内许多不同核受体功能的关键辅活化分子。

转录辅激活子通常存在于体内稳态复合物中(9). 在本研究中，我们发现ASC-2也属于HeLa核中约2 MDa的稳态络合物（ASC-2络合物[ASCOM]）。我们的结果表明，ASCOM可能代表一种新的核受体辅激活物复合物，与之前定义的Swi/Snf、TRAP/DRIP和SRC-1/CBP复合物不同(9,49)。

材料和方法

质粒。

编码谷胱甘肽的载体S公司-转移酶（GST）与组蛋白H2A、H2B、H3、H4和各种H3点突变体的融合蛋白是日本京都京都大学Yoichi Shinkai的馈赠。PCR片段编码HALR残基3712至4025（即HR/SET2）、HALR残留物3507至4025，即HR/SET 1）、HR/SET1m1和HR/SET1Δ（除了四个残基的缺失或SET域中一个保守的甘氨酸到丝氨酸的点突变外，它们与HR/SETI相同），ASC-2片段DN1和DN1/m被克隆到生态RI和Xho公司GST融合载体pGEX4T（Pharmacia）和pcDNA3（Invitrogen）的I限制性位点。哺乳动物RAR表达载体、转染指示物构建物pActin-β-gal和报告物构建物β-RARE-LUC如前所述(17)。

ASCOM的纯化。

将HeLa核提取物（1.5 g蛋白质）加载到HiTrap肝素柱（3×5 ml；Pharmacia）上，用g-150缓冲液（20 mM HEPES-KOH[PH7.9]，0.5 mM EDTA，0.05%NP-40，10%甘油，1 mM二硫苏糖醇[DTT]，蛋白酶抑制剂，150 mM KCl）平衡。用75 ml线性盐梯度（G缓冲液中150至600 mM KCl）洗脱结合蛋白。将具有抗ASC-2抗体的免疫反应组分合并（350 mM KCl），并在Q-80缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH7.8]，0.5 mM EDTA，20%甘油，1 mM DTT，蛋白酶抑制剂，80 mM KCl）中透析2 h。将样品加载到HiTrap Q柱上（2×5 ml；Pharmacia），与Q-100（20 mM-Tris-HCl[pH78]平衡用50 ml盐梯度洗脱Q缓冲液中100至500 mM KCl的结合蛋白。将含有ASC-2的组分合并（300 mM KCl，20 mg蛋白质），应用于Mono Q色谱柱（HR5/5；Pharmacia），并用10 ml的盐梯度从120 mM KCl~800 mM KCl进行显影。将300 mM KCl洗脱的免疫反应性组分与60μl蛋白G-琼脂糖混合，该蛋白与先前定义的抗ASC-2单克隆抗体（A3C1）结合(18)在4°C下持续12小时。回收珠子，并用1 ml IP-300缓冲液（20 mM Tris-HCl[pH 7.8]、0.1 mM EDTA、0.2%NP-40、10%甘油、1 mM DTT、蛋白酶抑制剂、300 mM乙酸钾）洗涤三次，最后用500μl磷酸盐缓冲盐水洗涤。结合蛋白用100μl 100 mM甘氨酸（pH 3.0）洗脱两次，用10%三氯乙酸沉淀，并进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE），以进行基质辅助激光解吸电离飞行时间（MALDI-TOF）分析。

抗体。

来自大鼠的抗-ASC-2单克隆抗体（A3C1）和抗人Med6（抗hMed6）多克隆抗体如前所述(18,20). 抗CBP、SRC-2、BRG1、TRAP220、血凝素（HA）、α微管蛋白和β微管蛋白的抗体购自Santa Cruz和Boehringer Mannheim。抗SRC-1单克隆抗体和抗H3甲基化K4多克隆抗体分别是Dean Edwards和Tony Kouzarides赠送的礼物。通过使用重组ASH2片段（ASH2残基516至624）、RBQ-3或在大鼠体内表达的HALR片段（HALR残基2412至2886）作为抗原，在大鼠中生成抗-ASH2、抗RBQ-3和抗HALR抗血清大肠杆菌在兔子体内产生识别ALR-1和ALR-2的抗血清，对抗一种合成肽MSPPPEESPMSP，该合成肽源于ALR-1残基581至592以及ALR-2残基1至12。每个抗体都用表达于大肠杆菌并严格测试其特异性。如前所述，对蛋白G-琼脂糖进行抗体偶联和免疫沉淀(20)。

转染和免疫荧光显微镜。

HeLa和CV-1细胞在24孔板中生长，培养基中添加10%胎牛血清24小时，并转染100 nglacZ公司表达载体pRSV-β-gal和100 ngβ-RARE-LUC报告基因，以及DN1和DN1/m的哺乳动物表达载体的指示量。通过添加pcDNA3，表达载体的总量保持不变。如前所述进行转染和荧光素酶分析(17)，并将结果标准化为lacZ公司表达式向量。在两个以上的类似实验中也得到了类似的结果。免疫荧光显微镜基本上如前所述(45). MCF7细胞与抗ASC-2单克隆抗体（A3C1）和兔抗α-或β-微管蛋白多克隆抗体孵育。用荧光素-异硫氰酸盐结合的山羊抗鼠抗体和四甲基罗丹明-异硫氰酸盐结合的羊抗兔抗体（Sigma）标记细胞。盖玻片安装在玻璃载玻片上，并用奥林巴斯Fluoview 300激光扫描共聚焦显微镜进行检查。

GST下拉测定。

GST融合或GST单独表达于大肠杆菌在结合缓冲液（25 mM HEPES[pH7.8]、0.2 mM EDTA、20%甘油、100 mM KCl和0.1%NP-40）中与谷胱甘肽-脑葡萄糖4B珠（Pharmacia）结合，并使用TNT偶联转录翻译系统与体外翻译表达的标记蛋白孵育，条件如制造商所述（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。用40 mM还原型谷胱甘肽在50 mM Tris（pH 8.0）中从小球中洗脱特异性结合蛋白，并如前所述通过SDS-PAGE和放射自显影术进行分析(17)。

炸薯条。

293T细胞在10-cm直径的培养皿中培养24小时，培养基中添加10%胎牛血清，并转染指定数量的RAR、DN1和DN1/m哺乳动物表达载体。通过添加pcDNA3保持表达载体总量不变。染色质免疫沉淀（ChIP）分析基本上如前所述进行(51). 所用引物为5′-AAGCTCTGTAGAATCTG-3′和5′-GGATCCTACCCCGACGGTG-3′，它们包含β-RARE区域，并产生288-bp的PCR片段。用于p21的RARE区域的引物WAF1（加权平均1）启动子为5′-AGACTCTGAGCAGCTGAG-3′和5′-AACCCCTCATGCAGATGGT-3′，产生258-bp的PCR片段。

组蛋白甲基转移酶分析。

含ASCOM的HiTrap Q组分与抗ASC-2、抗ASH2或抗ALR抗体或10μg GST融合蛋白与HALR和ALR的免疫沉淀物与5μg适当的H3肽、纯化的H2A、H2B、H3和H4或小牛胸腺组蛋白（Roche，Inc.）以及0.55μCi[三H] 如前所述，AdoMet在甲基转移酶缓冲液（50 mM Tris[pH8.0]，1 mM苯甲基磺酰氟和0.5 mM DTT[最终浓度]）中于30°C下放置1 H，最终体积为25μl，在Whatman P-81上发现，然后用于闪烁计数(33,42). 野生型H3 N-末端肽含有人类组蛋白H3（ARTKQTARKSTGGKAPRKQL-C）的1到20个残基。在突变肽中，K4、K9、K14或K18变为精氨酸。

结果

ASC-2存在于稳态复合体中。

在HeLa细胞核中，250-kDa蛋白ASC-2不是以游离形式存在的，而是以一种显著较大的稳态复合物的形式存在。为了纯化这种复合物（ASC-2复合物称为ASCOM），我们对HeLa核提取物进行了一系列生化分离，并用抗ASC-2抗体进行免疫亲和纯化，如图所示。​图1A。1安培最终的免疫亲和纯化产生了许多不同的蛋白质条带（图。​（图1B）。1B年). 其中，在整个纯化过程中，至少有八条谱带被抗ASC-2抗体重复共免疫沉淀，并且在用抗HA或抗ASC-1抗体进行的对照免疫亲和纯化中不存在（数据未显示）。MALDI-TOF质谱分析确定这些带为Trx/ALL-1/MLL相关蛋白ALR-1（MLL2）（GenBank登录号：。2358285，578 kDa）及其剪接亚型ALR-2（登录号：。2358287，545千Da）(32)，ALR-like protein HALR（MLL3）（登录号：。10568112，442千Da）(43)ASC-2（登录号：。AAF13595型，250 kDa），ASH2（加入编号：。4009336，77kDa）(11)，视网膜母细胞瘤结合蛋白RBQ-3（登录号：。755750，66千Da）(36)，α-微管蛋白（登录号：。4929134，50.1kDa）和β-微管蛋白（登录号：。13623683，48.8 kDa）。ALR-1和ALR-2仅在N端不同(32). ASCOM的组成与其他报道的共激活物复合物完全不同，如CBP/SRC-1/SRC-2、CBP/SRC-2/SRC-3/IKK(49)，CBP/dTRX输入果蝇食肉动物(31)、p/CAF和hMediator(9). 在整个纯化过程中，ASCOM的表现与含有CBP、SRC-1和hMed6的配合物不同（图。​（图2A）。2安培). 一个明显的例外是，在HiTrap Q柱分馏中，SRC-1和CBP的小峰似乎与ASC-2部分混合（图。​（图2A，2安培，分数40至44）。然而，在这些组分中，SRC-1和CBP均未被抗ASC-2抗体共同免疫沉淀（图。​（图2B）。2B型). 鉴于SRC-1和SRC-2可以在SRC-1复合体中共存(49)，我们测试了这些HiTrap Q组分中是否也存在SRC-2。如图所示。​图2B，2B型，SRC-2确实存在于这些组分中，但与ASC-2无关，如SRC-1。总之，我们得出结论，ASC-2在一种新的稳态复合物中与体内一系列不同的蛋白质紧密相关。

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ASCOM的纯化。（A） 显示了从核提取物（HeLa NE）中纯化ASCOM的色谱方案。数字和括号分别表示KCl摩尔浓度和熔池。αASC-2、抗ASC-2。（B） 多肽的质谱鉴定。抗-ASC-2抗体柱洗脱液在SDS-12%PAGE凝胶上运行，银染，并通过MALDI-TOF进行分析，基因产物和分子量（括号内）显示在右侧。标记蛋白（M）的质量如左图所示，星号表示非特异性带。针对AC22148（一种功能未知的蛋白质）的抗体显示，它是一种非特异性污染物。MALDI-TOF质谱分析未能揭示约116 kDa蛋白质的身份（表示未知）。

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确认ASCOM组件的身份。（A） 用ASC-2、CBP、SRC-1和hMed6的指示抗体对HiTra Q柱部分进行Western分析。FT，流通；fr#，分数。（B） 将HiTrap Q组分40至44与抗ASC-2（αASC-2）抗体混合并免疫沉淀（IP），并用所示抗体分析Western（W）。αCBP，抗CBP；αSRC-1，抗SRC-1；αSRC-2，抗SRC-2。（C） 根据纯化蛋白质的MALDI-TOF质谱数据分离的cDNA编码的合成或重组多肽产生抗体。+和−，分别含有来自HeLa核提取物的ASCOM的HiTrap Q组分（40至44组分）和不相关组分（30至34组分）。每种抗体识别一种具有预期分子量（MW）（以千计）的蛋白质。αALR、抗ALR；αHALR，抗HALR；αASH2，抗ASH2；αRBQ-3，抗RBQ-3。用指示抗体（IP）免疫沉淀含有ASCOM的HeLa核提取物的（D、E和F）HiTrap Q组分（40至44组分），用SDS-4至6.5%PAGE分离，并用指示抗体进行探测（W）。αHA，抗HA；αBRG1，抗BRG1。S和S表示上清液，P和P表示沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。

ASCOM组件的验证。

为了确认所鉴定的蛋白作为ASCOM真正成分的真实性，我们针对从各种cDNA文库中分离的同源cDNA衍生的合成或重组蛋白提出了特异性多克隆抗体。重要的是，这些抗体特异性地识别包含ASC-2/ASCOM的HiTrap Q组分40至44的每个同源带，但不识别不相关组分（30至34）的同源带（图。​（图2C）。2摄氏度). 从含有ASCOM的HiTrap Q组分（40至44）中，抗HALR抗体共免疫沉淀ASC-2（图。​（图2D）。二维). 同样，抗ASC-2、ALR、HALR和ASH2的抗体特异性地结合免疫沉淀的ALR、ASC-2、ASH2和RBQ-3（图。​（图2E第二版和F）。相反，抗HA和BRG1抗体并没有协同免疫沉淀任何这些蛋白，尽管这些抗体成功地清除了HeLa细胞外表达的HA标记蛋白或BRG1（图。​（图2D，二维、E和F以及未显示的数据）。这些结果清楚地表明，ALR-1/2、HALR、ASH2和RBQ-3是ASCOM的真正成分。

ASCOM中存在α/β-微管蛋白。

令人惊讶的是，α/β-微管蛋白很容易被抗HALR抗体共免疫沉淀，而ASH2抗体从含有ASCOM的HiTrap Q组分共免疫沉淀效率较低（图。​（图2F）。2楼). 尽管以前曾报道过核微管蛋白的存在(2,45)，这些蛋白没有被证明与任何定义的核蛋白相关。因此，我们用更高纯度的ASCOM馏分进一步探讨了这个问题。为此，将含有ASCOM的HiTrapQ组分（40至44组分）加载到Mono S柱上，并合并抗ASC-2免疫反应组分。然后将这些级分应用于Superose 6柱，并通过免疫印迹进行分析，如图所示。​图1A。1安培在该Superose 6凝胶过滤柱中，α/β-微管蛋白与HALR、ASC-2、ASH2和RBQ-3共纯化，成为大约2-MDa的复合物（图。​（图3A）。3A级). 从含有2-MDa复合物ASCOM的Superose 6组分9中，抗ASH2抗体联合免疫沉淀不仅ASC-2和RBQ-3，而且α/β-微管蛋白（图。​（图3B）。第3页). 尽管这些与ASCOM相关的核α/β-微管蛋白的数量只是全细胞α/β微管蛋白中的一小部分，但抗α-和β-微管蛋白联合免疫的抗血清从未分离的全细胞提取物中可检测到ASC-2（数据未显示）。与这些结果和最近的报告一致(45)，间接免疫荧光显微镜显示MCF7细胞核中存在微管蛋白（图。​（图3D）。三维). α/β-微管蛋白在细胞质和细胞核中均检测到，ASC-2主要在细胞核中检测到。共焦显微镜（Fig。​（图3D）。三维). 相反，核蛋白BRCA1与ASC-2的共定位程度最低。这些结果表明α/β-微管蛋白是ASCOM的真正成分。重要的是，α/β-微管蛋白的存在增加了ASCOM可能与核基质直接相关的有趣可能性(5). 这些发现的生物学意义需要进一步研究。

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ASCOM中的α/β-管蛋白。（A） 对于ASCOM的粒度分级，HiTrapQ分数为40到44（如图所示。​图2A）2安培)加载到Mono S柱上（HR5/5；Pharmacia）。将免疫反应组分合并，应用于Superose 6柱（HR10/30；Pharmacia），并按指示通过免疫印迹分析。fr#，分数；W、 西方分析；αHALR，抗HALR；αASC-2，抗ASC-2；αASH2，抗ASH2；αRBQ-3，抗RBQ-3。（B和C）用指示抗体（IP）免疫沉淀含有ASCOM或约500kDa的较小复合体的超6组分9（B）或28（C），用SDS-4至6.5%PAGE分离，并用指示抗体进行探测（W）。S和P分别表示上清液和沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。αPIPKIβ，抗PIPKI。（D） 用β-微管蛋白、BRCA1和ASC-2抗体处理细胞。分别用荧光素异硫氰酸酯（绿色）和四甲基罗丹明异硫氰酸酯（红色）结合抗体检测ASC-2和β-微管蛋白/BRCA1。注意ASC-2和β-微管蛋白的共定位。α-微管蛋白抗体也获得了类似的结果（数据未显示）。驾驶员信息中心（DIC），差分干扰对比度。

有趣的是，RBQ-3和ASH2在Superse 6分级柱中作为另一种约500 kDa的独特络合物洗脱（图。​（图3A）。3A级). 在该Superose 6组分（第28号）中，抗ASH2抗体共同免疫沉淀ASH2和RBQ-3，但不沉淀无关蛋白型I-β磷脂酰肌醇4-磷酸5-激酶（图。​（图3C）。3C公司). 我们注意到，这种新型复合体的大小与之前报道的相似果蝇属ASH2复合体(30). 然而，它可以简单地表示ASCOM的子模块，相对松散地连接到假定的核心ASCOM模块。

值得注意的是，ALR-1、ALR-2、HALR和ASH2是果蝇属三胸类（Trx-G）蛋白（参考文献综述7). 因此，我们得出结论，ASC-2是一种新的核稳态复合物的组成部分，该复合物包含RBQ-3、Trx-G蛋白的一个子集以及至少一个核α/β-微管蛋白亚群。

ASCOM的H3-K4甲基化酶活性。

Trx-G和Polycomb组（Pc-G）蛋白质(7)基因表达的正效应和负效应，负责维持转录调控，并在整个发育过程中提供细胞记忆机制。一些Trx-G和Pc-G蛋白含有一个130到140氨基酸基序，称为SET结构域，存在于多种染色质相关蛋白中(7). 值得注意的是，ALR-1/2和HALR在其C末端包含SET结构域以及其他已知的蛋白质基序（图。​（图4A）。4A级). 有趣的是，与组蛋白偶联但不与寡核苷酸（A）偶联的琼脂糖珠保留了ASCOM所含HiTrap Q组分42至44中的ASC-2（图。​（图5A）。5A级). 这些结果表明ASC-2或ASCOM与组蛋白相互作用。最近，的SET域果蝇属Trx（dTrx）被证明与H3特异结合(13). 同样，放射性标记的HR/SET1（即HALR残基3507到4025）与GST融合到H3而不是H2A、H2B和H4相互作用（图。​（图5B）。5亿). 这些结果表明，在实验中观察到的ASC-2和组蛋白之间的相互作用的数据如图所示。​图5A5A级可能是由于HALR/ALR的SET域与H3直接绑定所致。

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HALR/ALR SET域。（A） ySET1、hTrx/ALL-1、hHALR和hALR-1的示意图。如图所示，各种已知的蛋白质基序都有颜色编码。（B） hHALR、hALR、dTrx的SET和SET后结构域的氨基酸比对（登录号：。美国食品药品监督管理局55041)，ySET1（加入编号。AAB68867型),S.pombe公司Clr4（加入号。060016)，hG9a（加入编号：。S30385型)和hSUV39 h1（注册号：。NP_003164号). 所有七种蛋白质中保守的氨基酸；单位为hHALR、hALR、dTrx和ySET1；在yClr4中，hG9a和hSUV39 h1分别以红色、绿色和蓝色突出显示。虚线表示路线中的间隙。红色和蓝色线分别标记SET域和后SET域的范围。将HR/SET1Δ中删除的四个残基的保守区装箱，并用星号标记HR/SET1m1中突变为丝氨酸的保守甘氨酸。

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ASCOM检测H3结合和甲基化。（A） 含有ASCOM的HiTrap Q柱分数（图中的分数40至44）。​图2A）2安培)用与组蛋白偶联的琼脂糖珠或寡核苷酸（A）（Sigma）孵育，用SDS-7%PAGE分离，并用抗ASC-2（αASC-2）抗体（W）检测。s和p分别表示上清液和沉淀。将总反应混合物的10%作为输入。（B） GST下拉实验如前所述进行(17,19)单独使用GST或GST融合到H2A、H2B、H3和H4，并加载20%的总反应混合物作为输入。（C） 用所示抗体免疫沉淀含有ASCOM的HiTrap Q柱部分（40至44部分），并用牛血清白蛋白H3或H4测定甲基化活性。αHA，抗HA；αALR、抗ALR；αASH2，抗ASH2。

最近，一些SET蛋白，例如葡萄裂殖酵母Clr4、hSUV39 h1和小鼠Suv39 h1（mSuv39 h 1）被证明甲基化组蛋白H3的K9(33). 这导致了HP1蛋白的结合位点，这是一个涉及基因沉默和染色质高阶结构的异色连接分子家族(16,27). 另一种SET蛋白，G9a，甲基化H3-K9和K27(42). 有趣的是，抗ASH2、-ALR和-ASC-2抗体从含有ASCOM的HiTrap Q组分40至44中沉淀出微弱的H3甲基转移酶活性（图。​（图5C）。5摄氏度). 相反，这些免疫沉淀对牛血清白蛋白或H4没有任何甲基化酶活性。如GST-HR/SET1和GST-ALR/SET（图。​（图6A6A级和数据未显示）。由于高度保守的4-氨基酸基序（即GST-HR/SET1Δ）的缺失消除了甲基化酶活性，因此证实了SET结构域的参与（图。​（图6A）。6A级). 有趣的是，GST融合到HALR残基3708到4025（即图中的GST-HR/SET2）。​图6A）6A级)没有检测到活性，表明HALR残基3507至3712，包括PHD指，可能对甲基化酶活性很重要。该区域是促进SET结构域折叠以容纳组蛋白尾部，还是直接介导酶反应，值得进一步研究。

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HALR测定的H3-K4特异甲基化。（A） HALR和三个HALR C末端缺失片段的示意图，带有四个PHD手指、一个HMG-like结构域和C末端SET结构域。组蛋白甲基转移酶活性通过游离组蛋白在S公司-腺苷-我-[甲基-三H] 蛋氨酸和结合放射性通过过滤器结合测定。（B） 组蛋白甲基转移酶活性通过在存在S公司-腺苷-我-[甲基-三H] 蛋氨酸和结合放射性通过过滤器结合测定。GST下拉实验如前所述(17,19)GST融合到人类H3（野生型[wt]）和点突变体的N末端57个残基，并加载20%的总反应混合物作为输入。

有趣的是，与hSUV39 h1、G9a和Clr4相比，ALR-1/2和HALR的SET结构域序列与dTrx和酵母SET1（ySET1）的序列更为同源（图。​（图4B）。4B类). 此外，ALR-1/2、HALR、dTrx和ySET1不包含hSUV39 h1、G9a和Clr4中存在的富含半胱氨酸的前SET结构域(33,42). 证实这些差异的是，GST-HR/SET1甲基化的H3肽在K9、K14和K18突变为精氨酸，但在K4没有突变，尽管这些突变不会影响H3的结合（图。​（图6B）。6亿). 因此，体内ASCOM介导的H3甲基化位点可能是K4，尽管由于HALR/ALR的H3甲酯化活性非常弱，在体外直接证明（例如通过Edman降解）很困难。尽管目前尚不清楚ASCOM介导的H3-K4甲基化如何最终导致局部基因激活，但我们得出结论，ALR-1/2和HALR是能够甲基化H3-K4.的酶。

ASCOM招募到体内RAR。

先前描述的靶核受体和ASC-2 NR盒之间的配体依赖性蛋白质相互作用(14,19,22)被认为可以调节ASCOM向体内受体的募集。与这一预期一致，含有N末端LXXLL基序（即DN1）但不含DN1/m的ASC-2片段（其中LXXLL模序突变为LXXAA以禁用受体相互作用）强烈抑制了RAR介导的短暂共转染中的配体依赖性反式激活，而转录的基础水平没有受到影响（图。​（图7A）。第7章). 在ChIP分析中，DN1（而非DN1/m）消除了ASC-2对维甲酸反应的β-RARE启动子区的配体依赖性募集（图。​（图7B，7亿，左侧面板）。重要的是，DN1特异性地阻断内源性ASC-2在体内结合RAR，而不影响其他基于LXXLL的辅活化剂如SRC-1和TRAP220的配体依赖性募集（图。​（图7B，7亿，右侧面板）。因此，DN1及其突变型DN1/m是研究ASC-2在体内核受体反式激活中的作用的极好工具，而不会引起其他含LXXLL辅激活剂的并发症，尽管这种特异性的基础尚不完全清楚。尽管如此，我们的结果表明，DN1的抑制作用涉及竞争性、特异性地替换来自结合受体的内源性全长ASC-2。有趣的是，DN1不仅损害了ASC-2的配体依赖性募集，而且也损害了体内其他ASCOM成分（ASH2和ALR）对维甲酸反应的β-RARE启动子区的配体依存性募集（图。​（图7B，7亿，左侧面板）。这些结果与生化研究一致，这些研究表明ASC-2可能只存在于体内复合物中。

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在RAR交易中招募ASCOM。（A） 将视黄醇反应性β-RARE-LUC报告子构建物与HeLa细胞共转染lacZ公司表达载体（100 ng）和用于DN1（100 ng。封闭和阴影方框表示不存在0.1μM 9-顺式-维甲酸（RA）。计算三份样品的归一化荧光素酶表达与lacZ公司表达。CV-1细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。（B和C）ASCOM招募到β-RARE和p21WAF1（加权平均1）和H3-K4甲基化。将RAR（10 ng）、DN1（100 ng）和DN1/m（100 ng-顺式-RA，如图所示。从这些细胞中分离出染色质，并用所示抗体进行免疫沉淀。内源性β-RARE或p21WAF1（加权平均1）免疫沉淀样品中存在的区域通过PCR扩增，输入PCR显示为负载对照。

有趣的是，维甲酸诱导的ASC-2/ASCOM向β-RARE的募集具有时间依赖性，在维甲酸治疗后20分钟达到峰值，这与β-RAR启动子区的维甲酸依赖性H3-K4甲基化密切相关（图。​（图7C，7摄氏度，左侧面板）。ASCOM可能是这种甲基化的原因，因为DN1（而非DN1/m）抑制了维甲酸诱导的ASCOM募集以及β-RARE启动子区的H3-K4甲基化。视黄醇诱导的p21也获得了类似的结果WAF1（加权平均1）启动程序（图。​（图7C，7摄氏度，右侧面板）。有趣的是，H3-K4甲基化，至少在这些维甲酸反应启动子区域，可能比先前假设的更具动态性(29). 因此，体内核受体的反式激活可能需要通过ASC-2和受体的配体依赖性相互作用招募ASCOM以靶向DNA反应元件，这可能导致启动子区域H3-K4残基随后的短暂甲基化。

有趣的是，HR/SET1共转染抑制了各种核受体的反式激活，包括RAR（图。​（图8A8安和数据未显示）。存在两种可能性。首先，HR/SET1可能阻断HALR/ALR-1/2及其下游效应器的相互作用。其次，HR/SET1可能干扰内源性HALR/ALR-1/2在体内正确甲基化其假定靶底物（H3和/或其他未知底物）。与后一种可能性一致，将高度保守的甘氨酸残基突变为丝氨酸（即HR/SET1m1）或删除保守的NHSC基序（即HR/SET1Δ）可消除抑制作用（图。​（图8A）。8安). 点变换基于前面描述的果蝇属信托收据Z11号机组缺乏H3结合并导致苍蝇发生同源异型转化的突变(13). 有趣的是，H3结合也受到HR/SET1Δ的损害，这表明NHSC基序参与了H3结合（图。​（图8B8B类)。

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HALR-SET抑制RAR转录激活。（A） 视黄醇反应性β-RARE-LUC报告子构建物与HeLa细胞共转染lacZ公司表达载体（100ng）和HR/SET1、HR/SET1m1和HR/SET1Δ的表达载体，如图所示。封闭和阴影框表示是否存在0.1μM的9-顺式-维甲酸（RA）。计算了三份样品的归一化荧光素酶表达，与lacZ公司表达。CV-1细胞也获得了类似的结果（数据未显示）。（B） GST下拉实验如前所述(17,19)单独使用GST或将GST融合到人类H3的N末端57个残基，并加载20%的总反应混合物作为输入。

总的来说，这些结果表明ASC-2作为一个整体复合体发挥作用（即ASCOM），ASCOM结合H3并通过ASC-2受体相互作用招募ASCOM以靶向DNA反应元件似乎对体内核受体的反式激活至关重要。

讨论

ASC-2是与ySET1复合体同源的稳态复合体。

在本报告中，我们描述了来自HeLa核的约2 MDa的新型核稳态复合物，该复合物与先前描述的转录辅激活因子分子ASC-2相关(三,8,14,17,18,19,22,52). ASCOM可能代表最近报道的约440至1000 kDa酵母复合物的人类同源物(25,26,35)，其中包含ySET1、yASH2和三种具有WD重复序列的蛋白质（参考文献综述21)也在RBQ-3和一个名为Cps40/Saf41p/Spp1的亚单位中发现，该亚单位是hCGBP的同源物，识别非甲基化的CpG岛，并包含hTrx/MLL和ALR-1的N末端区域中发现的富含半胱氨酸的保守基序(44). 他们进一步证明ySET1是一种H3-K4甲基化酶(26,35). 然而，ASC-2同源物似乎不存在于酿酒酵母,秀丽隐杆线虫、和果蝇属（数据未显示），表明ASC-2在进化相对较晚的时候并入复合物。值得注意的是，ASH2、ALR-1、ALR-2和HALR以及酵母对应物ySET1和yASH2是已知的果蝇属Trx-G蛋白(7). 因此，ASCOM和ySET1复合物代表了一种独特的共激活物复合物，它包含一组特定的Trx-G蛋白，以及ATP酶依赖的染色质重塑Swi/Snf复合物(7,9)以及最近报道的dTrx/dCBP复合物(31). 值得注意的是，三个组件（即ALR-1、ALR-2和HALR）的尺寸相对较大（图。​（图1B），1B年)，这大大削弱了我们在不同组件之间映射交互内接口的努力。然而，从我们最近的酵母双杂交筛选中，分离出ASH2作为一种与RBQ-3强烈相互作用的蛋白质。因此，ASH2-RBQ-3可以形成一个松散连接到ASCOM或大约500kDa的假定独立复合体的核心子模块（图。​（图3A3A级)。

DN1作为体内ASC-2的特异性抑制剂。

ASC-2片段DN1以LXXLL依赖的方式与RAR相互作用，是RAR反式激活的一种强有力的显性负抑制剂（图。​（图7A）。第7章). 重要的是，这种DN1介导的阻遏作用可以通过过度表达的ASC-2恢复，但不能通过SRC-1或TRAP220恢复，SRC-1和TRAP220是两种特性良好的LXXLL型辅活化子（13a）。在培养细胞系的ChIP实验中，DN1也抑制了维甲酸应答p21对ASC-2的依赖性募集，但对TRAP220和SRC-1的依赖性招募没有抑制作用WAF1（加权平均1）启动程序（图。​（图7B）。7亿). 此外，对过度表达DN1的转基因小鼠胚胎成纤维细胞的ChIP分析表明，ASC-2向RARβ2启动子的配体依赖性募集受损，而TRAP220的募集未受影响（13a）。类似地，微量注射抗ASC-2抗体可以抑制RAR反式激活，该激活可由ASC-2的共注入表达载体恢复，而不是SRC-1或CBP(17). 然而，值得注意的是，DN1可以与重组TRAP220和SRC-1竞争，在体外结合受体（数据未显示）。这种差异证明了一个重要事实，即ASC-2、TRAP220和SRC-1存在于体内不同的稳态复合物中，而不是像我们在体外实验中使用的那样作为游离多肽。在复合物的背景下，DN1中的额外ASC-2序列可作为成功招募ASCOM所需的其他效应器的交互界面。ASC-2与受体的LXXLL基序介导的相互作用可能必须伴随这些次级相互作用，才能在启动子区成功组装整个ASCOM受体复合物。此外，应该注意的是，受体与各种辅因子的相互作用是高度动态的，而不是静态的，正如最近与雌激素和雄激素受体所证明的那样(37,38). 虽然需要更多的工作来清楚地了解这种特异性的基础，但我们的结果足以证明，DN1是研究体内带有核受体的内源性ASC-2复合物功能的一个极好的工具，而不会因其他基于LXXLL的辅活化剂（如SRC-1和TRAP220）而产生任何并发症。因此，我们得出结论，配体诱导RARβ2和p21周围H3-K4残基的瞬时甲基化WAF1（加权平均1）启动子区域（图。​（图7C），7摄氏度)，被共表达的DN1而不是DN1/m消除，可能是由于ASCOM的H3-K4甲基化活性引起的，尽管不能排除与其他组蛋白甲基化酶的可能参与或交流。

ASCOM和H3-K4甲基化。

H3-K4甲基化与基因激活有内在联系(29,39). 最近，由一种新蛋白SET9介导的H3-K4甲基化被证明通过p300增强组蛋白乙酰化，并抑制转录抑制性SUV39 h1介导的H-K9甲基化以及NuRD阻遏物复合物与H3尾部的结合(28,46). 有趣的是，与其他组蛋白甲基转移酶相比，HALR介导的体外H3甲基化活性非常弱(28,33,42,46). 此外，H3-S10磷酸化或H3-K14乙酰化对活性没有显著影响，单核小体几乎检测不到活性（数据未显示）。因此，HALR/ALR可能需要纯化过程中丢失的其他辅因子或以启动子特异性的方式发挥作用。例如，ySET1复合物除了酶成分本身（即ySET1）外，还需要其他成分才能成功地进行甲基化活动(35). 因此，目前正在开发一系列表达标记ASC-2、ASH2和RBQ-3的稳定细胞系，我们计划从中纯化功能完整的复合物。此外，最近研究表明，ySET1复合物对H3-K4的甲基化需要RAD6对H2B的泛素化(6,41). 因此，ASCOM体外甲基化酶活性弱也可能是因为在我们采用的反应条件下缺乏泛素化H2B。最后，HALR/ALR还可能以非组蛋白为靶点，例如其他辅活化因子，如最近报道的甲基化CBP/p300的H3特异性精氨酸甲基转移酶CARM1(51). 为了明确解决这些问题，我们目前正在构建HALR甲基化酶活性发生特异性改变的基因靶向小鼠。

ASCOM和其他辅激活物复合物。

如图所示。​图9，9，未连接的核受体招募共加压蛋白N-CoR和SMRT，它们与抑制转录的各种组蛋白脱乙酰酶复合(9). 基因激活的一个主要步骤被认为是破坏染色质形成的蛋白质的募集。调节因子相当于酵母Swi/Snf复合物的因子，如BRG1，以及相关复合物调节染色质重塑。此外，SRC-1/CBP/p/CAF复合物的配体依赖性募集给核受体复合物带来HAT活性（图。​（图9）。9). 此外，通过不同转录因子的共沉淀分离出了生化分离的复合物，这些复合物包含与酵母介体复合物中的因子类似或同源的因子（即TRAP-SMCC-DRIP-ARC），这些转录因子可能参与直接桥接RNA聚合酶II复合物和基础转录因子(9). ASCOM是第四种核受体辅激活物复合物，可能与靶启动子区域的H3-K4残基甲基化有关（图。​（图9）。9). 核受体介导的反式激活需要这些和其他辅激活物复合物，它们可以顺序、组合或并行作用。个体受体选择性招募辅活化因子的研究已经建立(47,48). 这些选择性受体-激活剂相互作用是一个有效的系统，通过该系统，核受体配体的多效性效应可能被介导，并可能进一步由辅激活剂翻译后修饰的组织特异性模式决定(15). 在这方面，有两个问题与ASCOM的进一步研究特别相关。研究ASCOM在交易激活过程中如何与其他辅激活子在功能上相互关联是很重要的。例如，我们的初步结果表明，ASCOM可能在功能上需要体内完整的Swi/Snf复合物。此外，HALR的C末端片段HR/SET1似乎至少在体外调节了CARM1的H3精氨酸甲基化酶活性，CARM1是核受体的另一个关键辅活化蛋白。另一个同样重要的问题是确定ASCOM是否可以在体内不同的环境和条件下被选择性利用，即ASCOM的主要生理靶基因是什么？

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ASCOM功能的工作模型。配体结合后，核受体发生结构变化，这表明一系列不同的辅激活物复合物取代了辅抑制物复合物。图中显示了三种共激活物复合物，它们包含定义明确的基于LXXLL基序的适配器分子（SRC-1、ASC-2和PBP/TRAP220/DRIP205//TRIP2）。在不同的启动子环境和细胞条件下，这些和其他辅激活子可以选择性地招募到单个受体（见正文）。HALR/ALR的SET结构域可能直接或间接参与体内H3-K4和/或其他未知底物的甲基化。DN1竞争性地阻止受体招募ASCOM，而不是其他基于LXXLL的复合物，因此可以特异性地抑制ASCOM介导的启动子区H3-K4甲基化。

ASCOM中的核微管蛋白。

该报告扩展了先前关于细胞核中存在微管蛋白的有趣报道(24,45). α/β-微管蛋白与其他ASCOM成分HALR、ASC-2、ASH2和RBQ-3的共提纯（图。​（图3A）3A级)来自高度纯化的Superose 6级分，其缺乏丰富的细胞游离微管蛋白以及在这些级分中与ASH2的共免疫沉淀（图。​（图3B）第3页)强烈支持α/β-微管蛋白作为ASCOM真正成分的真实性。间接免疫荧光结果（图。​（图3D）三维)也支持这一观点。考虑到ASCOM中存在α/β-微管蛋白，一个需要测试的有趣假设是核基质(5)可以调节ASCOM的功能。我们的初步结果表明，先前定义的ASC-2的自主交易激活功能(19,22)由微管蛋白失稳剂长春花碱强烈诱导，而不是由微管素稳定剂紫杉醇诱导（我们未发表的结果）。有趣的是，之前有人指出，长春花碱影响似乎与微管蛋白无关的生化过程，如DNA和RNA合成(2). 长春花碱可能通过与ASCOM中的核微管蛋白相互作用而对这些过程产生影响。ASCOM中存在α/β-微管蛋白的生物学意义将是一项令人兴奋的未来研究。

ASCOM与人类癌症。

值得注意的是，突变和/或易位进入信托收据/毫升哺乳动物中的基因导致几种血液系统恶性肿瘤的发生(1). ALR和HALR基因分别映射到染色体带12q12-13和7q36，这些区域与人类癌症中的染色体畸变相关(32,43). RBQ-3也被报道在某些胶质瘤中被基因扩增(36)就像结肠癌、乳腺癌和肺癌中的ASC-2基因(17). 有趣的是，最近发现β-微管蛋白在快速分裂的细胞中积累，如癌细胞系和组织(45). 这些结果表明，不同ASCOM亚基的错误调控可能与致癌有关。

总之，ASC-2是一种新型人类Trx-G复合物的组成部分，能够特异性甲基化H3-K4，对核受体和可能的许多其他转录因子的反式激活至关重要。ASCOM的进一步表征将有助于揭示转录控制和癌症发展的分子细节。

致谢

我们感谢Tony Kourzarides、Yoichi Shinkai和Dean Edwards提供的各种试剂。

这项工作得到了韩国科学与工程基金会基础研究项目2000-2-20900-006-1的资助（Y.C.L.），以及Postech生物技术中心（3PD02002）和GenoCheck，Inc.（J.W.L）的资助。

Y.-HG.、Y.C.S.和D.-HK.为这项工作做出了同等贡献。

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文章来自分子和细胞生物学由以下人员提供泰勒和弗朗西斯