调节细胞生长和增殖以应对细胞应激对正常细胞的生存至关重要，而适当应激反应的失调可促进肿瘤的发生(29). 结节性硬化症复合物（TSC）由两种蛋白质组成，TSC1（也称为hamartin）和TSC2（称为tuberin），其功能是整合生长因子和细胞应激反应(35,39). 其中之一的丢失或突变TSC1类或TSC2型在人类中，可引起结节性硬化综合征，其特征是多组织良性肿瘤（错构瘤），包括肾、脑、心、肺和皮肤，肾脏恶性透明细胞瘤的风险虽小但显著增加(7). 最近的工作黑腹果蝇在哺乳动物细胞中，TSC1/2复合物的主要功能是抑制雷帕霉素（TOR）的检查点蛋白激酶靶点，TOR是细胞生长和增殖的主要调节因子(15,27,39).
在哺乳动物细胞中，TSC1/2复合物通过磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/AKT途径整合来自生长因子受体的上游信号(18,40,54)并通过AMP-活化激酶（AMPK）从细胞能量感受器(32). 作为对生长因子刺激的反应，丝氨酸/苏氨酸激酶AKT被PI3K激活并磷酸化TSC2，通过一种目前有争议的机制抑制其功能(10,31,37,41). AMPK是关键的能量敏感激酶，因为它对细胞AMP/ATP比率的增加非常敏感(6,24). 该比率的增加促进了上游激酶LKB1的AMPK磷酸化和活化，LKB1是一种在Peutz-Jeghers综合征中突变的人类肿瘤抑制因子(46). 活化的AMPK反过来磷酸化TSC2（不同于AKT磷酸化的残基），明显促进其活化(8,45). TSC2作为GTPase激活蛋白（GAP）作用于小GTPase Rheb，一种TOR的正向上游调节因子(30,36,55). 因此，TSC2的激活将Rheb转化为其非活性GDP结合构型，导致mTOR活性降低(19,43,50). AMPK磷酸化激活TSC2的确切机制尚不清楚，尚未确定TSC活性对能量应激的额外调节。然而，TSC2系统−/−细胞在调节mTOR依赖性磷酸化和能量耗竭后抑制细胞生长方面高度缺陷，表明TSC1/2复合物在应对能量应激中的关键作用(32).
能量应激后mTOR活性的下调导致其两种最受研究的底物脱磷酸化，即核糖体S6激酶1（S6K1）和eIF4E结合蛋白1（4E-BP1）(15,27). 尽管S6K1表现出与多种细胞外信号激活一致的复杂磷酸化模式，但雷帕霉素敏感（即mTOR依赖）的主要位点是Thr389(4). 磷酸化的S6K1反过来磷酸化核糖体蛋白S6，核糖体蛋白质S6被认为可以促进翻译机制关键成分的优先翻译(49)，尽管这种模式最近受到质疑(51,53). S6K对S6的磷酸化作用主要发生在S235和S236，这是雷帕霉素的主要敏感位点(11). 4E-BP1是eIF4E的负调节因子，eIF4E是一种速率限制因子，与RNA消息5′端的Cap结构结合以启动Cap依赖性翻译(22). 4E-BP1的磷酸化诱导其与eIF4E分离。4E-BP1蛋白表现出一种逐步磷酸化模式，产生至少三种不同的迁移蛋白物种（α、β和γ）(20,21). 通过其对翻译调节和其他机制的影响，mTOR对S6K和4E-BP1磷酸化的调节有助于哺乳动物细胞大小的控制(17).
我们最初鉴定出哺乳动物红色D1（也称为RTP801/Dig2/DDIT4）是一种由p53依赖和独立机制诱导的DNA损伤基因(14). 其他研究报告了对红色D1应对其他细胞应激，包括缺氧和糖皮质激素治疗(48,56). 我们最近证实，REDD1作为mTOR底物磷酸化的负调节因子在缺氧反应中发挥作用(三). 明确地，红色D1−/−细胞在缺氧条件下未表现出S6K和S6的正常去磷酸化反应。此外，针对TSC2系统消除了REDD1表达下调S6K磷酸化的能力，这意味着REDD1通过TSC/mTOR途径发挥作用(三).
这项研究得到了果蝇确定了红色d1-类似基因锡拉和查里布迪斯PI3K蛋白PKB和PDK-1过度表达后诱导的表型抑制因子(42). 在本研究中红色D1同源基因逆转了PKB/PDK-1过度表达导致的细胞生长增加。这种效应与S6K活性降低有关，与mTOR功能的负调控一致。当过表达锡拉和查里布迪斯产生更小的苍蝇和更小的细胞，这两个基因的丢失与细胞大小的增加和更大的苍蝇有关。这两个基因都是由缺氧诱导的，遗传数据显示它们的作用位于PKB下游，而位于TSC上游。有趣的是，两者都是红色D1-饥饿也诱导了类似基因。此外，苍蝇的突变查里布迪斯对饥饿异常敏感，而这两个基因的过度表达强烈延长了饥饿条件下的寿命(42). 这些数据意味着果蝇REDD1同源基因对缺氧和能量消耗的反应。
在这里，我们证明了REDD1对于控制细胞生长的TSC依赖性细胞能量应激反应至关重要。REDD1是响应能量应力而诱导的，并且红色D1−/−能量耗尽后，细胞S6K、S6和4E-BP1磷酸化下调明显缺陷。REDD1的表达诱导这三种蛋白的快速去磷酸化并减小细胞大小。REDD1的这些作用取决于TSC1/2复合物的存在，即使在缺乏REDD1时，TSC2的AMPK激活和AMPK依赖性磷酸化不受影响。最重要的是，siRNA介导的对REDD1的抑制以雷帕霉素敏感的方式增加细胞大小，并且红色D1−/−细胞在能量胁迫下的细胞大小调节缺陷。因此，REDD1是mTOR和细胞生长响应能量应激的重要调节因子。
材料和方法
材料。
抗-4E-BP1（R-113）、抗-β-微管蛋白（D-10）、抗TSC2（C-20）和抗凝集素（C-11）购自Santa Cruz Biotechnology，抗血凝素（抗HA）（16B12）购自Covance。如前所述，使用亲和纯化的REDD1多克隆抗血清(14). 所有其他抗体均购自Cell Signaling Technologies。如前所述，亚克隆REDD1 cDNA，并通过PCR突变产生REDD1-dC(三). HA-S6K1和Rheb cDNA分别由Diane Fingar和David Kwiatkowski慷慨提供。AICAR（5-氨基咪唑-4-羧酰胺核糖侧）从Covance获得；化合物C来自默克；2-脱氧葡萄糖（2DG）、雷帕霉素、胰岛素和四环素均来自西格玛。
生成红色D1-无效等位基因。
前面已经描述了REDD1靶向结构的合成，该结构用内源性REDD1启动子驱动的β-半乳糖苷酶/neo融合cDNA替换整个REDD1编码序列和3′非翻译区（UTR）(14). 将12-kb线性化结构电穿孔到J1胚胎干（ES）细胞中，然后在之前描述的含有G418的培养基中进行选择(34). 通过Southern blot分析确定目标等位基因的成功替换。将ES细胞注射到C57BL/6囊胚中，然后按照标准程序转移到假孕宿主以生成嵌合体(28). 生殖线传播红色D1-Southern分析证实嵌合动物后代中存在无效等位基因。
细胞培养、刺激和转染。
所有细胞系均在含有10%胎牛血清（Sigma）的Dulbecco改良Eagle培养基（Cambrex）中生长。使用标准程序从14.5天胚胎中分离出原代小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）(26)在第2～5代使用。四环素诱导型细胞系衍生自T-REx-U2OS系（Invitrogen）。对于葡萄糖饥饿，细胞与d日-无葡萄糖Dulbecco改良Eagle培养基、25 mM HEPES和10%透析胎牛血清。根据制造商的说明，使用FuGene（Roche）进行所有转染。如有指示，通过表达猴病毒40大T抗原使原发性MEF永生化。
逆转录病毒和腺病毒感染。
对于原发性MEF的逆转录病毒感染，将REDD1 cDNA亚克隆到pLPC-Puro中。如前所述，逆转录病毒上清液是通过与包装质粒和假分型质粒共转染产生的(12). 细胞经过两轮感染，在血清饥饿或2DG治疗前分裂一次。Kenneth Walsh慷慨提供了表达显性阴性大鼠α2-AMPK（K45R）或对照载体的复制缺陷型腺病毒载体。在HEK293细胞中扩增病毒并测定斑块滴度。细胞在10到20个PFU的多重感染下被感染。
北方和南方分析。
如前所述执行Northern分析(13)每车道使用15μg总RNA。Northern blots用32P-标记的REDD1或甘油醛-3-磷酸脱氢酶cDNA。使用10μg来自原代MEF的限制性消化DNA进行Southern分析。用32与REDD1基因组位点相邻的P标记探针。
免疫沉淀和蛋白质印迹分析。
细胞在PS6缓冲液（50 mM Tris[pH7.5]、150 mM NaCl和0.5%NP-40）中用蛋白酶抑制剂鸡尾酒（Roche）和磷酸酶抑制剂鸡尾液I和II（Sigma）溶解。对于磷酸AMPK和磷酸乙酰辅酶A羧化酶（磷酸ACC）免疫印迹，将细胞在磷酸盐缓冲盐水、1%NP-40和1mM二硫苏糖醇中与蛋白酶和磷酸酶抑制剂一起裂解。在十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶（Cambrex）上，每条车道上有15到25微克的蛋白质。用Restore Western blot剥离缓冲液（Pierce）剥离磷蛋白印迹，验证是否没有信号，然后用适当的抗体重制印迹，以定量总蛋白载量。如有指示，用抗HA抗体和蛋白G Sepharose珠（Amersham BioSeciences）免疫沉淀PS6缓冲液中的裂解物，用PS6缓冲溶液洗涤3倍，用2倍十二烷基硫酸钠负载缓冲液洗脱。5%的裂解物用于定量REDD1表达水平。
RNA干扰（RNAi）。
针对以下序列设计REDD1靶向小发夹RNA，并如前所述克隆到pBS/U6中(52)：siR1-1（5′-GGGCAAAGAACTGCCTG-3′）和siR1-2（5′-GGGTCGTTGCCCGACTTCGA-3′）。
细胞大小和细胞周期的FACS分析；统计分析。
将细胞固定在70%乙醇中，用RNase（Sigma）处理，并用碘化丙啶（PI）染色，如前所述(12). 平均前向散射高度（FSC-H）根据G确定1-通过PI荧光（FL2-A）鉴定门控细胞。通过共同转染CD20细胞表面标记物，然后在固定和PI染色之前用异硫氰酸荧光素结合抗CD20抗体（Becton Dickinson）或同型对照物染色来测定转染细胞的细胞大小。在这种情况下，细胞大小由G的FSC-H决定1-门控，荧光素异硫氰酸盐阳性细胞。所有荧光激活细胞分选（FACS）分析均使用FACSCalibur流式细胞仪和cell Quest Pro软件（Becton Dickinson）进行。所有统计分析均使用双尾学生t吨测试。
结果
REDD1用于mTOR底物的去磷酸化，以响应能量应激。
遗传数据来自果蝇我们自己的工作将低氧依赖性诱导REDD1与通过TSC1/2复合物调节mTOR底物磷酸化联系起来(三,42). 鉴于已知TSC1/2复合物也能调节能量剥夺后的翻译和细胞大小控制，我们希望确定REDD1是否有助于能量应激反应。首先，我们问红色D1是对能量应激的反应。图表明红色D1在葡萄糖类似物2DG提取葡萄糖或耗尽细胞ATP后，成纤维细胞中的mRNA显著上调，从而阻碍了细胞对葡萄糖的利用。我们以前的工作证明，REDD1是在电离辐射后以p53依赖的方式诱导的(14). 然而，能量应激诱导的REDD1与p53无关，因为它发生在原代细胞和通过p53失活而永生的细胞中（图。和数据未显示）。
REDD1在能量应激后诱导产生，是mTOR底物脱磷酸所必需的。（A） REDD1消息的归纳。清洗所示基因型的永生MEF，然后添加含有10%胎牛血清（C）的对照培养基、含有2DG（25 mM）的相同培养基/胎牛血清或含有10%透析胎牛血清的无葡萄糖培养基。在4小时后采集细胞进行Northern分析，并用REDD1或REDD2 cDNA片段进行探测。在MEFs中未检测到REDD2的表达，在MEFs中未观察到REDD1的表达红色D1−/−MEF公司。GAPDH，甘油醛-3-磷酸脱氢酶。（B） REDD1野生型和靶向基因组等位基因。白盒，REDD1 3′UTR；黑盒、REDD1编码区和5′UTR；灰盒，β-半乳糖苷酶/neo融合cDNA。显示了面板C中检测到的KpnI（K）碎片的大小。（C） 对指示基因型的KpnI-消化MEF DNA进行Southern blot分析，用REDD1靶向结构的基因组片段3′进行探测（未显示）。（D） 中缺乏REDD1蛋白红色D1−/−MEF公司。用亲和纯化的多克隆REDD1抗血清，通过免疫沉淀-Western分析从用2DG处理的细胞中提取的诱导REDD1蛋白的提取物。免疫球蛋白重链（HC）是免疫沉淀的对照物。（E） S6K（T389）、S6（S235/236）和4EBP1（T70）的脱磷缺陷红色D1−/−ATP耗竭后的MEFs。经2DG处理4小时的原发性MEF裂解物的Western blot分析，用磷酸特异性抗体进行检测。剥离并重制相同的印迹，以确定各自的总蛋白水平。（F） S6K去磷酸化（T389）反应葡萄糖饥饿需要REDD1。如图A所示，在采收前的指定时间内，MEF中的葡萄糖提取用于上述蛋白质印迹分析。
为了确定REDD1在细胞能量反应中的生理作用，我们生成了红色D1−/−细胞。这个红色D1基因由三个外显子和两个内含子组成，整个转录单元包含在基因组DNA的2kb内。我们生成了一个目标构造，它替换了整个红色D1β-半乳糖苷酶/新霉素耐药融合蛋白编码区和3′非翻译区（图。) (14). 从含有突变等位基因的杂合小鼠杂交获得的MEF在Southern基因组DNA分析中显示出预测的限制性内切酶模式（图。). 我们确认了红色D1−/−通过Northern分析评估，MEFs不表达REDD1编码序列或蛋白质（图。)和Western blot分析（图。)分别是。值得注意的是红色d1-类基因红色D2在野生型或红色D1−/−MEF（图。).
在营养充足的条件下，红色D1−/−MEF表现出加倍的时间和饱和密度，基本上等同于野生型MEF（数据未显示）。为了研究REDD1在能量应激反应中的潜在作用，我们首先检测了野生型或野生型中ATP耗竭后mTOR底物4E-BP1和S6K的磷酸化红色D1−/−MEF（图。). 用2DG处理细胞，我们检测了主要雷帕霉素敏感位点S6K-Thr389和几个雷帕霉素敏感性位点之一的4E-BP1-Thr70的磷酸化(4,22). 我们还检测了S6K底物核糖体蛋白S6在S235/S236的磷酸化，这些主要位点通过活化的S6K以雷帕霉素敏感的方式磷酸化(11). 作为负载对照，在每种情况下，将印迹剥离并重新处理总S6K、S6或4E-BP1蛋白。野生型细胞在2DG处理后显示出S6K和S6蛋白磷酸化的预期下调，如使用相应的磷酸特异性抗体观察到的信号减少所示。值得注意的是，在这些初级MEF中，4E-BP1几乎完全处于超磷酸化状态（γ形式），因此脱磷酸化最明显地表现为一个或多个快速迁移带的出现(20). 值得注意的是，红色D1−/−细胞对ATP耗竭后S6K、S6和4E-BP1的去磷酸化具有抵抗力（图。). 即使在较高剂量的2DG（50 mM）下，这种差异也很明显。接下来，我们检测了停糖后S6K磷酸化。与2DG处理后的结果类似，S6K的去磷酸化在红色d1−/−MEF与野生型细胞的比较（图。). 重要的是，这些结果和后续结果涉及红色D1−/−使用三批独立衍生的同窝卵数匹配的MEF复制细胞（数据未显示）。因此，REDD1被诱导，并对能量应激后mTOR底物的适当去磷酸化至关重要。
REDD1调节AMPK激活后mTOR依赖性磷酸化。
为了开始了解REDD1在能量应激反应途径中的作用，我们检测了原始野生型和野生型中mTOR底物的磷酸化红色D1−/−调节mTOR活性的各种生理条件下的MEF。对原发性MEF进行血清饥饿处理，然后用血清、胰岛素、雷帕霉素或AMP模拟物AICAR（AMPK的直接激活物）进行治疗。野生型和红色d1−/−细胞在基础（血清缺乏）S6K或4E-BP1磷酸化方面没有表现出一致的差异（图。，车道1和6）。此外，胰岛素治疗或血清添加后，这两种基因型中这些蛋白的磷酸化增加类似，这两个基因型都被预测会激活AKT信号（通道2和7以及通道3和8）。正如预期的那样，雷帕霉素能有效抑制两种mTOR底物的磷酸化，而与基因型无关。这可以通过磷酸化S6K（第4和第9通道）的完全消失以及在探测总蛋白后出现第三个迁移速度更快的4E-BP1带来证明，该带对应于α4E-BPl磷酸化形式（底部面板，第4和9通道）(20). AMPK激活后，野生型细胞表现出类似于雷帕霉素治疗后观察到的去磷酸化模式。相反，红色D1−/−与野生型细胞相比，AICAR激活AMPK后，细胞S6K和4E-BP1的去磷酸化明显缺陷。因此，野生型与野生型相比，磷酸化S6K占总S6K的比率有显著差异红色D1−/−小区（车道5对10）。这种缺陷在4E-BP1磷酸化方面也很明显，因为雷帕霉素诱导的α4E-BPl形式在探测4E-BPI总蛋白时可见，在野生型细胞中很容易检测到，但在红色D1−/−单元格（底部面板，车道5对10）。这些差异具有高度可重复性，并且红色D1杂合MEF在mTOR底物调控方面似乎具有中间表型（数据未显示）。
mTOR基板的信号在红色D1−/−激活AMPK而非AKT后的细胞。（A） S6K（T389）和4E-BP1（T70）磷酸化下调在红色D1−/−AMPK激活后的细胞。在Western blot分析之前，将原发性MEF的血清饥饿（SS）24小时，然后按指示（S，血清）处理90分钟。4E-BP1的磷酸化形式按惯例表示为α、β和γ（底部面板）(19). 特别注意α4E-BP1形式在红色D1−/−小区（车道5对10）。（B） 重组REDD1表达可在AMPK激活后恢复S6K（T389）和4E-BP1（T70）去磷酸化（通道4和8）。主要红色d1−/−MEF在治疗前感染对照组或表达REDD1的逆转录病毒，如A组90分钟。（C）在ATP耗竭后，REDD1重建恢复4E-BP1（T70）去磷酸化。主要红色D1−/−MEF按B组进行逆转录病毒感染，然后按指示用2DG治疗4小时。
接下来，我们希望确定在红色D1−/−细胞是REDD1丢失的直接后果。因此，我们试图通过异位表达REDD1来“拯救”缺陷。主要红色D1−/−MEF被对照逆转录病毒载体或HA-标记的REDD1表达病毒感染，细胞在没有选择的情况下繁殖。通过检测HA的Western blot（图。). 这些细胞随后被血清饥饿，然后进行治疗，如图所示。在血清饥饿、随后的血清刺激或雷帕霉素治疗（图。). 然而，在AMPK激活后，REDD1恢复调节：与对照组相比，S6K磷酸化下调红色D1−/−细胞（比较通道4与通道8中磷酸化S6K与总S6K的比率），4E-BP1的去磷酸化被恢复，如雷帕霉素敏感性α4E-BPl形式的出现所证明（总4E-BPI面板，通道4与8）。为了证实这些结果可以扩展到包括细胞对ATP耗竭的反应，我们用2DG处理表达载体或REDD1的MEF。如图所示。，在2DG处理后，REDD1表达恢复4E-BP1去磷酸化。这些数据表明，REDD1在调节mTOR依赖性磷酸化的能量应激反应中发挥直接作用。
AMPK激活或AMPK依赖的TSC2磷酸化不需要REDD1。
两种普遍的可能性可以解释以下观察结果红色D1−/−在能量耗尽或AICAR激活AMPK后，细胞在mTOR底物调节方面存在缺陷。AMPK激活可能需要REDD1，或者它可能在下游或平行路径中发挥作用。为了解决这个问题，我们首先检查了野生型和红色D1−/−血清饥饿的细胞，然后用胰岛素、血清或AICAR处理，如图所示。AMPK是一种由催化α亚基、调节β亚基和γ亚基组成的异源三聚体复合物(6). AMPK激活的主要机制涉及上游激酶LKB1对Thr172α亚基的磷酸化(46). 细胞AMP的增加通过多种机制激活AMPK，最重要的是通过LKB1促进其磷酸化(24). 因此，我们通过Thr172磷酸化检测AMPK的激活。我们还通过评估S473的磷酸化来检测AKT的激活，S473是PI3K依赖性AKT磷酸化的两个主要位点之一(5).
正如预期的那样，我们没有观察到胰岛素或血清治疗对AMPK的激活（图。). 相反，AICAR治疗增加了信号，并诱导了α-AMPK迁移的显著改变，表明激活。然而，野生型和红色d1−/−MEF公司。此外，可以预测，AKT被胰岛素和血清激活；然而，野生型和红色D1−/−电池（图。).
AKT或AMPK激活不需要REDD1。（A） 在AICAR处理后，野生型和红色D1−/−MEF（最后两条车道）。在Western blot分析之前，将指示基因型的主要MEF的血清饥饿24小时（SS），然后按指示（S，血清）处理90分钟。（B） AMPK在野生型和红色D1−/−中小微企业。在磷酸-AMPK（T172）或其底物磷酸-ACC（S79）的Western blot分析之前，用2DG（50 mM）处理初级MEF指定时间。（C） TSC2依赖AMPK的磷酸化不需要REDD1。与A组一样，MEF无血清，用AMPK抑制剂（AMPKI）化合物C（10μM）预处理30分钟，然后在内源性TSC2蛋白印迹前用AICAR（2.0 mM）处理30分钟。与非特异性条带（非特异性）的均匀迁移相比，TSC2的磷酸化诱导位移（上箭头与下箭头）是明显的。TSC2磷酸化与AMPK激活相关，ACC（S79）磷酸化证明了这一点。
接下来，我们检测了2DG处理后ATP耗竭后原发性MEF中AMPK的激活（图。). 与AICAR激活AMPK后的观察结果类似，我们发现AMPK在野生型和红色D1−/−细胞，通过Thr172磷酸化测定。为了证实这些细胞中AMPK的功能激活，我们检测了AMPK依赖位点S79处AMPK底物ACC的磷酸化(23). 我们发现ACC的磷酸化与AMPK的磷酸化在野生型和红色D1−/−2DG处理后的细胞。总之，这些实验证明AMPK的激活和功能在红色d1−/−mTOR底物磷酸化失调的细胞。因此，在能量应激后AMPK活化不需要REDD1。
激活的AMPK使TSC2磷酸化是TSC依赖性调节mTOR底物磷酸化所必需的(32). 在红色D1−/−细胞中，TSC2可能被AMPK磷酸化，但不能调节mTOR，或者TSC2的AMPK依赖性磷酸化可能需要REDD1。为了区分这些可能性，我们检测了野生型和红色D1−/−成纤维细胞。以前的研究已经证明，通过AMPK磷酸化TSC2可以通过TSC2蛋白的迁移率变化来证明，并且这种迁移可以通过抑制AMPK来阻止(8,32,45). 我们发现野生型和红色D1−/−细胞表达同等水平的内源性TSC2，AICAR对AMPK的激活持续诱导两种基因型细胞的迁移率发生相同的变化（图。). 为了证明这种转变与AMPK依赖性磷酸化有关，我们在AICAR治疗前用特定的AMPK抑制剂化合物C预处理细胞。正如预期的那样，AMPK抑制完全消除了野生型和红色D1−/−电池（图。). 最后，为了证实这些发现与内源性AMPK活性相关，我们检测了相同裂解物中AMPK底物ACC的磷酸化。正如预测的那样，AICAR诱导的ACC磷酸化在AMPK抑制后被阻断（图。). 总之，这些发现表明，REDD1不影响AMPK激活或AMPK依赖的TSC2磷酸化。因此，REDD1可能在与AMPK平行的通路中调节mTOR功能。这一结论得到了图中数据的支持。，证明显性负性AMPK的表达不会阻止REDD1介导的mTOR底物磷酸化或细胞生长效应。
REDD1功能不需要激活AMPK。（A） DN-AMPK通过2DG而非REDD1阻断磷酸化S6K（T389）的调节。用DN-AMPK或载体控制腺病毒感染U2-REDD1细胞，24小时后用四环素（Tet）处理细胞以诱导REDD1或用2DG（25 mM）处理指定时间（分别为T4和T8、4和8小时）。注意，DN-AMPK与内源性AMPK结合。（B） DN-AMPK不抑制REDD1对细胞大小的调节。显示G细胞大小（FSC-H）分布的直方图1-门控U2-REDD1细胞感染如A组，然后诱导表达REDD1（黑线）或未经处理（灰色阴影）48小时。（C）诱导REDD1后细胞大小减少的定量，这在DN-AMPK存在或不存在时不变。如面板B所示，显示了三个独立实验的平均FSC-H值。*，P（P）<0.005与所有比较的（−）Tet。误差条显示1个标准偏差。
REDD1在Rheb上游的TSC依赖性途径中发挥作用。
然后，我们转向研究介导REDD1功能的下游途径。遗传数据来自果蝇放置REDD1直系同源物的功能锡拉和查里布迪斯在一个TSC公司-TSC2 GAP活性靶点Rheb上游的依赖性途径(42). 因此，我们希望确定这个模型是否可以在哺乳动物细胞中得到验证。我们以前的工作表明，siRNA直接针对TSC2系统消除REDD1对S6K磷酸化的影响(三). 为了在遗传模型中确认这些数据，我们将REDD1转染到野生型或TSC2系统−/−成纤维细胞。（这些单元格派生于第53页−/−背景为了克服因失去TSC2系统[58].) 作为对照，我们转染了一个REDD1缺失突变体（REDD1-dC），该突变体在已知REDD1同源物共同的中央系统发育保守区域中缺乏96到156个氨基酸(14). 我们以前的研究表明，这种突变在调节S6K磷酸化方面是不活跃的(三). 为了评估转染细胞中的S6K磷酸化，我们将HA标记的S6K1与REDD1或REDD1-dC共转染，并在Western blot分析之前对标记蛋白进行免疫沉淀。作为免疫沉淀的对照，在对磷酸S6K进行分析后，剥离膜并重新制备S6K总蛋白。
REDD1显著下调表达S6K的细胞的磷酸化TSC2系统; 然而，它在匹配中基本上没有效果TSC2系统−/−电池（图。). 正如预测的那样，REDD1-dC对两种细胞群中的S6K1磷酸化均无影响。因此，REDD1函数需要TSC2系统表达式。
REDD1功能需要TSC2，并被Rheb表达抑制。（A） REDD1调节S6K（T389）磷酸化需要TSC2。用HA-S6K转染指定基因型的成纤维细胞，转染或不转染REDD1（R1）或REDD1-dC（dC）（1:1摩尔比），按指示用雷帕霉素处理（Rapa，2nM，90分钟），然后用抗HA免疫沉淀，然后进行Western blot分析（IP）。在磷酸化S6K分析后，剥离并重新制备相同的膜以获得总S6K。在4%的裂解液中检测REDD1或β-微管蛋白作为负荷控制（IB）。（B） Rheb通过REDD1抑制S6K（T389）磷酸化的调节。成纤维细胞转染S6K；S6K加上REDD1、REDD1-dC或Rheb（摩尔比2:1）；或S6K加上REDD1和Rheb（比例2:1:1），然后用雷帕霉素和免疫沉淀处理，如图A所示。4%的裂解液被检测为REDD1或负荷控制，如图B所示。
在果蝇，REDD1同源基因的异位表达无法挽救Rheb依赖性细胞生长增加(42). 为了确定Rheb的表达是否消除了哺乳动物细胞中REDD1的作用，我们将Rheb与S6K以及REDD1或REDD1-dC共同转染到小鼠成纤维细胞中。我们发现Rheb的共表达实质上阻断了REDD1表达对S6K1磷酸化的影响（图。). 总之，这些数据与REDD1通过促进TSC1/2复合物的激活来调节mTOR依赖性磷酸化的模型一致（见图。).
提出了REDD1函数对能量应力的响应模型。能量应激诱导REDD1的表达，REDD1在Rheb上游以TSC依赖的方式发挥作用，抑制mTOR活性。因此，REDD1诱导促进S6K和4E-BP1的去磷酸化，从而抑制蛋白质合成并降低细胞生长/细胞大小。GF，生长因子。
可诱导的REDD1表达调节mTOR底物磷酸化和细胞大小。
为了直接研究REDD1介导的功能，我们建立了四环素诱导表达REDD1的细胞系（图。). 作为对照，我们生成了具有可诱导表达REDD1缺失突变体（REDD1-dC）的细胞。在没有四环素的情况下，这些品系表现出无法检测到的REDD1或REDD1-dC水平，在添加四环素后快速诱导蛋白质表达，以及两种蛋白质的等效诱导水平（图。). 我们首先检测了添加四环素后不同时间点4E-BP1、S6K和S6的磷酸化。诱导后1小时内可检测到REDD1蛋白表达，此时我们观察到S6K1和4E-BP1磷酸化的最大下调（图。; 注意亚磷酸化α4E-BP1形式的外观）。我们还观察到S6K和S6的去磷酸化之间存在轻微滞后，这与S6去磷酸化之前下调S6K活性的要求一致。相反，在诱导REDD1-dC后，我们观察到这些蛋白的磷酸化没有明显变化。值得注意的是，这些发现在表达诱导型REDD1或REDD1-dC的两个独立衍生细胞系中是可重复的（数据未显示）。虽然这些实验无法准确定义REDD1的功能作用所需的时间，但我们观察到的快速作用与我们提出REDD1直接参与该途径的模型一致。值得注意的是，我们没有观察到诱导表达REDD1后AKT或AMPK磷酸化的变化（数据未显示）。这一发现与我们在红色D1−/−电池（图。)和果蝇数据放置函数红色D1直系亲属锡拉和查里布迪斯PI3K信号传导下游(42). 总之，这些发现支持了我们的模型，即REDD1是mTOR活性的有效抑制剂。
REDD1调节mTOR底物磷酸化降低细胞大小。（A） REDD1（但不是REDD1-dC）下调S6K（T389）、S6（S235/236）和4E-BP1（T70）的磷酸化。在指定的时间内，通过添加四环素（1μg/ml）诱导REDD1-dC或REDD1的表达，并通过蛋白质印迹分析分析裂解物。指出了4E-BP1的α、β和γ磷酸化形式。（B） 用四环素或雷帕霉素（Rapa，20 nM）处理U2-REDD1细胞48 h后，用PI固定和染色，并用流式细胞仪分析细胞周期。（C） REDD1诱导减少细胞大小。显示G细胞大小分布（FSC-H）的代表性直方图1-门控U2-REDD1细胞如图B中那样处理48小时（黑线）或未处理（灰色阴影），然后用PI染色并通过流式细胞术分析。（D） REDD1诱导后细胞大小减少的定量。五个独立实验得出的U2-REDD1或U2-RED1-dC细胞FSC-H平均值的平均值如图C所示。*，P（P）=0.001与（−）Tet。误差条显示1个标准偏差。
TOR通路在细胞大小调节中的关键作用和红色D1中的直系词果蝇细胞大小控制促使我们评估诱导表达REDD1或REDD1-dC后对细胞大小的影响。对于细胞大小评估，我们使用了涉及平均FSC-H的FACS分析的标准技术。为了排除细胞周期效应的潜在混杂，我们分析了FSC-H对G1-PI染色后的门控细胞(17,32). REDD1的诱导表达导致G1细胞分数（图。)以及通过连续细胞计数测量的细胞增殖减少（数据未显示）。这些数据与mTOR调节细胞生长和细胞周期进展的能力一致(16). 最显著的是，REDD1诱导导致细胞大小的高度可重复平均6%的减少，而REDD1 dC的诱导表达对细胞大小没有影响（图。). 这种影响的程度与雷帕霉素浓度（20 nM）处理的效果相当，雷帕霉素对mTOR功能的抑制最大(17). 在这一剂量下，雷帕霉素使两种诱导细胞系中的细胞尺寸减小约10%（图。). Fingar等人采用了类似的方法(17)在U2OS细胞中观察到同样的效果（细胞大小减少10%），以该剂量雷帕霉素处理后，U2OS可诱导系由此衍生。因此，REDD1介导的mTOR底物磷酸化抑制反应在其对细胞生长的影响中。
REDD1介导的mTOR底物和细胞生长调节不需要AMPK激活。
上述数据表明，REDD1可能独立于AMPK发挥作用，以控制细胞生长以应对能量应激。如果是这样，则REDD1功能可能不需要激活内源性AMPK。为了直接测试这个模型，我们检测了在显性负AMPK（DN-AMPK）结构表达后，REDD1调节mTOR底物磷酸化和细胞大小的能力。我们使用腺病毒转导表达突变的α-AMPK亚单位（K45R），该亚单位已被证实阻断内源性AMPK激活(38,47). 我们在具有可诱导REDD1表达的细胞中表达该突变体或对照载体，然后用四环素或2DG处理细胞，作为DN-AMPK疗效的对照。正如预测的那样，DN-AMPK完全消除了2DG治疗后S6K磷酸化的下调（图。). 然而，在平行培养中，阻断AMPK活性对REDD1抑制S6K磷酸化的能力没有影响。为了确定这一观察结果的生理意义，我们检测了在存在或不存在DN-AMPK表达的情况下REDD1诱导对细胞大小的影响。与载体细胞或未感染细胞相比，DN-AMPK的表达对REDD1减小细胞大小的能力没有影响，这与它对S6K磷酸化缺乏影响一致（图。). 结合我们的观察，AMPK被适当激活以磷酸化TSC2红色D1−/−单元格（图。)这些数据有力地证明，在能量应激反应中，REDD1与AMPK平行发挥作用。
内源性REDD1调节细胞生长以应对能量应激。
最后，我们测试了内源性REDD1是否参与细胞生长的调节。首先，我们首先研究了红色D1U2OS细胞中的RNAi。我们设计了多个siRNA物种，靶向红色D1mRNA，将其表达为基于质粒的小发夹RNA，并证明与对照非特异性siRNA相比，它们能有效抑制REDD1（图。) (52). 检查的单元格大小影响红色D1在转染细胞中，我们将这些siRNA质粒与细胞表面标记CD20共同转染，然后在G1-门控，CD20+单元格（请参见材料和方法）(17). 在转染后48小时内，表达这两种蛋白的细胞的细胞大小平均增加了5.3%和6.2%红色D1siRNA构建，而与载体主干相比，非特异性siRNA物种的表达对细胞大小的影响不显著（图。). 为了探讨细胞大小的这些变化是否可归因于mTOR功能的调节，我们询问雷帕霉素治疗是否会抑制红色D1RNAi。正如预测的那样，雷帕霉素治疗会降低所有人群的细胞大小。然而，雷帕霉素在接受REDD1 RNAi处理的细胞中有更大的作用，因为它将细胞大小减小到载体转染的雷帕霉素处理细胞中观察到的大小（图。). 这一发现支持以下mTOR活性增加的存在红色D1RNAi。值得注意的是，这些数据与Coradetti等人最近报告的数据一致(9)，他证明了这一点红色D1RNAi增加HEK293细胞内源性S6K和S6磷酸化(9).
内源性REDD1调节细胞大小以应对能量应激。（A） RNAi对REDD1的有效抑制。Western blot显示转染了REDD1-HA和所示siRNA表达质粒、主干载体（V）或非特异性siRNA（siScr）的U2OS细胞中REDD1-HA的表达。（B） REDD1 RNAi增加细胞大小。显示G细胞大小分布（FSC-H）的直方图1-转染48小时后，表达所示siRNA（黑线）或控制载体质粒（灰色阴影）的门控U2OS细胞（见材料和方法）。（C） 雷帕霉素治疗逆转了REDD1 RNAi后细胞大小的增加。用所示siRNA构建物转染U2OS细胞48小时后细胞大小的定量（平均FSC-H值），如图B所示进行分析。如图所示，转染12小时后添加雷帕霉素（20 nM）。显示了四个独立实验的平均值。*，P（P）<0.002与矢量；**，P（P）=NS与矢量。（D） ATP耗尽后，需要REDD1进行细胞大小调节。显示G细胞大小分布（FSC-H）的直方图1-门控MEF，用2DG（2 mM）处理48小时（E）红色D1−/−ATP耗尽后的MEF。显示了四个独立实验的平均FSC-H值的平均值。*，P（P）=0.02，野生型与红色D1−/−细胞。误差条显示1个标准偏差。
接下来我们讨论了内源性红色D1在能量应激后的细胞生长控制中起作用。不像急性下调红色D1在转化细胞中，生殖系失活红色D1不会导致主或不朽大小的一致差异红色D1−/−MEF与野生型细胞的比较（数据未显示）。这一观察结果与我们的发现一致，即野生型和红色D1−/−MEF显示在营养充足的条件下，mTOR底物磷酸化的基础水平相似（图。和). 为了研究ATP耗竭后的细胞大小控制，我们在进行上述细胞大小的FACS分析之前，用2DG处理MEF 48小时。虽然我们观察到野生型和非野生型之间的增殖和S期分数也有类似的剂量依赖性下降红色D1−/−2DG处理后的细胞（数据未显示），红色D1−/−与野生型细胞相比，细胞在能量应激后的细胞尺寸持续下降的幅度较小（图。). 这些差异与我们在用2DG处理这些细胞后观察到的mTOR底物磷酸化的缺陷调节一致（图。). 总之，这些数据表明，REDD1是细胞生长调节对能量应激反应的重要介质（图。).
讨论
这里的数据表明，REDD1在细胞通过TSC/mTOR途径对能量应激的反应中起着关键作用。此前，我们确定REDD1在TSC依赖性mTOR调节中对缺氧的反应中发挥作用(三). Corradetti等人进一步支持了这些发现(9)他还证明了REDD1介导的mTOR底物磷酸化调节。这些观察结果一起开始阐明细胞对缺氧和能量消耗的反应如何收敛到控制新陈代谢。ATP耗竭最终是由于长期缺氧、氧化代谢丧失和葡萄糖可用性降低所致。然而，有趣的是，Arsham等人(1)证明缺氧对mTOR底物的调节不需要降低ATP/ADP比率。这一发现与我们最近的工作一致(三)这意味着REDD1自身可能受到缺氧和能量应激后不同机制的调节。然而，似乎很明显，生物体已经进化出一种共同的依赖REDD1的反应来应对这两种形式的压力，以保护自己免受即将到来的能量危机的影响(1).
我们的发现得到了来自果蝇，作为两者红色D1-类似基因锡拉和查里布迪斯被诱导对饥饿作出反应，而Charybdis突变体对饥饿条件表现出更高的敏感性。果蝇研究也支持我们将REDD1功能定位在TSC2上游，而不是下游或平行路径。我们发现，在没有TSC2系统，REDD1无法调节mTOR底物磷酸化。此外，TSC1/2复合物下游生化目标Rheb的表达可有效阻断REDD1表达的影响。在飞行中锡拉和查里布迪斯无法救援TSC1/2号机组或TSC2系统突变体表型，而Rheb的过度表达对锡拉和查里布迪斯表达式，以及锡拉/夏令时/TSC2三个突变体表现出与TSC2系统单个突变体。尽管REDD1功能的确切机制有待进一步研究，但我们在REDD1诱导表达后观察到的mTOR底物磷酸化的快速下调与REDD1蛋白在促进TSC1/2复合物活化中的直接作用一致。
据报道，AMPK直接磷酸化TSC2，这种磷酸化对能量应激后TSC激活和mTOR抑制很重要(32). AMPK磷酸化如何调节TSC功能尚不清楚。有趣的是，我们发现在缺乏REDD1的情况下，TSC2的AMPK依赖性磷酸化不受影响，这表明该事件不足以完全激活TSC1/2复合物以响应能量应激。虽然这些观察结果表明REDD1和AMPK对mTOR的调节是平行的，但它们并不排除AMPK可能对REDD1本身的调节起作用。然而，在一系列先导实验中，我们发现2DG激活AMPK不会促进REDD1蛋白的稳定或其他明显修饰，DN-AMPK的表达不会阻止能量应激后REDD1信息的诱导（数据未显示）。因此，REDD1诱导和AMPK激活可能由不同的途径调节，并且它们汇聚以促进TSC1/2复合物的激活（图。).
与失去TSC1类或TSC2系统,红色D1−/−在营养充足的情况下，MEF的mTOR活性没有显著升高(33,58). 这一发现与我们的模型一致，即REDD1作为mTOR的应激诱导调节器发挥作用，因此在非应激条件下对mTOR活性的基本控制不是必需的。同样，我们观察到这些细胞中正常血清和胰岛素诱导的AKT激活，与TSC1类−/−或TSC2系统−/−细胞，由于mTOR介导的负反馈机制而对AKT激活具有抗性(25,44). 我们在野生型和红色D1−/−MEF也与该模型一致。正常基础mTOR活性红色D1−/−细胞也可能解释我们和其他人的观察结果红色D1−/−老鼠生来是活的(2). 然而，随着年龄的增长，正常发育和环境适应表现出多重应激，可能触发这些小鼠的REDD1依赖性表型。
我们之前的研究表明，当单独表达时，REDD1及其副产物REDD2都能够下调mTOR底物磷酸化，并且这两个基因的过度表达可能具有加性效应(三). 然而，我们的数据表明，REDD1和REDD2是独立的。我们几乎没有检测到红色D2在成纤维细胞中表达红色D1显然在这些细胞的能量应激反应中起作用。此外，我们观察到红色D1和红色D2在成人组织中（K.Lei和L.W.Ellisen，未发表数据）。这些基因潜在的不同功能是由于组织特异性表达的差异还是不同的生物化学特性造成的，尚待确定。值得注意的是果蝇REDD1-相似基因也表现出非重叠的表达模式，遗传数据提供了额外的证据，证明它们独立发挥作用(42).
最近的证据表明，mTOR依赖性细胞生长途径的失调与肿瘤发生之间存在明确的联系。多种人类肿瘤抑制剂，包括LKB1号机组Peutz-Jeghers综合征基因，结节性硬化基因TSC1类和TSC2系统，以及PTEN公司负责多种肿瘤综合征的基因，通过mTOR激酶在调节细胞代谢的聚合途径中发挥作用(29). 反过来，mTOR控制下游效应器，如4E-BP1，后者最近通过其下游靶点eIF4E与肿瘤形成相关(57). 与REDD1一样，这些蛋白质对营养素、生长因子和氧状态的变化作出反应，部分起决定细胞翻译机制活性水平的作用。这些途径中的其他调控基因尚未确定，其中一个子集可能与人类癌症有关。我们之前的发现是，REDD1在低氧反应中作为mTOR的一个重要TSC依赖性调节因子发挥作用，本报告证明了REDD1对细胞生长调节在能量应激反应中的作用，这表明REDD1功能失调可能有助于人类肿瘤的发生。
