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.2004年12月1日；18(23):2893-904.
doi:10.1101/gad.1256804。 Epub 2004年11月15日。

REDD1和TSC1/TSC2抑癌复合物对缺氧反应中mTOR功能的调节

詹姆斯·布鲁加洛拉斯 1, 奎磊, 丽贝卡·L·赫尔利, 布伦丹·D·曼宁, 简·H·瑞林, 恩斯特·哈芬, 李·A·威特斯, 莱夫·埃利森, 小威廉·G·凯林
附属公司

REDD1和TSC1/TSC2抑癌复合物对缺氧反应中mTOR功能的调节

詹姆斯·布鲁加洛拉斯等。 基因开发. .

摘要

雷帕霉素的哺乳动物靶点（mTOR）是蛋白质合成的中心调节器，其活性受多种信号调节。能量消耗和缺氧导致mTOR抑制。虽然能量消耗通过LKB1激活AMP-activated protein kinase（AMPK）并随后磷酸化TSC2的过程抑制mTOR，但缺氧抑制mTOR的机制尚不清楚。在这里，我们表明缺氧抑制mTOR需要TSC1/TSC2肿瘤抑制复合物和低氧诱导基因REDD1/RTP801。TSC1或TSC2缺失导致TSC1/TSC2复合物破坏，可阻断缺氧对mTOR的影响，如mTOR靶点S6K和4E-BP1的变化所测，并导致缺氧诱导因子（HIF）异常积聚。与能量消耗相反，缺氧抑制mTOR并不需要AMPK或LKB1。缺氧下调mTOR活性需要从头mRNA合成，并与缺氧诱导的REDD1基因表达增加相关。REDD1的破坏消除了低氧诱导的mTOR抑制，REDD1过度表达足以以TSC1/TSC2依赖的方式下调S6K磷酸化。缺氧抑制mTOR功能可能对肿瘤抑制很重要，因为TSC2-defficient细胞在缺氧条件下保持异常高的细胞增殖水平。

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数字

图1。
图1。
Tsc2调节mTOR以应对缺氧。(A类)蛋白质印迹分析Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF公司。（Hif）Hif-1α和/或Hif-2α；（S6K-P）S6K磷酸化T389；（S6-P）S6在S235/236上磷酸化。左侧面板显示，0.05%血清或添加血清后（10%血清45分钟），经雷帕霉素预处理或未经雷帕霉素预处理（添加血清前1.5小时）的MEF。赖特面板显示MEF暴露于缺氧的指定时间段。(B类)蛋白质印迹分析Tsc1型+/+和Tsc1型-/-小鼠3T3细胞缺氧处理指定时间。(C类)输入蛋白质印迹分析(左边)和7mGTP绑定(正确的)从Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF暴露于缺氧的指定时间段。(D、 E类)提取物的Western blot分析Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF暴露于缺氧的指定时间段。在E类所有细胞在裂解前用雷帕霉素处理26小时，而不考虑缺氧的持续时间。
图2。
图2。
Tsc2对于低氧调节S6磷酸化既必要又充分。(A类)蛋白质印迹分析Tsc2型-/-用Tsc2表达载体或空载体逆转录MEF，并在指定的时间段内进行缺氧处理。Tsc2型+/+MEF包括在控制范围内。(B类)对转染两种不同合成的Tsc2 siRNA（a和b）或干扰的siRNA（Sc）并暴露于指定时间段的HEK293细胞进行Western blot分析。
图3。
图3。
Tsc2的丢失在缺氧条件下具有增殖优势。(A类)的扩散率Tsc2型-/-和Tsc2型+/+常压条件下的MEF。(B类)缺氧条件下的增殖率Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF（是否用雷帕霉素治疗）。的错误栏A类和B类等于一个标准偏差(n个= 3). 注意不同Y（Y）-轴按比例缩放A类和B类. (C类)蛋白质印迹分析Tsc2型+/+和Tsc2型-/-在缺氧条件下平行培养指定天数的MEFs。
图4。
图4。
缺氧对mTOR的调节是AMPK和Lkb1独立的。(A类)提取物的Western blot分析Tsc2型+/+和Tsc2型-/-使用AICAR治疗指定时间段的MEF。（ACC-P）在S79磷酸化的乙酰辅酶A羧化酶；（AMPK-P）AMPK在T172磷酸化。(B类)蛋白质印迹分析Tsc2型+/+缺氧或AICAR治疗4小时后的MEF。(C类)用相同提取物体外AMPK激酶测定B类抗体过量时用多克隆抗AMPK（αAMPK）抗体或正常兔IgG（IgG）免疫沉淀。免疫沉淀前，对样品进行蛋白质浓度标准化。误差线等于一个标准偏差(n个= 3). 还显示了在无底物（SAMS肽）的情况下培养的免疫沉淀物的背景活性。(D类)蛋白质印迹分析Tsc2型+/+细胞经AMPK抑制剂化合物C预处理或不处理，并暴露于AICAR或缺氧指定时间段。用化合物C处理的所有细胞暴露于药物9.5小时(E、 F类)蛋白质印迹磅1+/+或磅1-/-使用AICAR处理的MEF(E类)或缺氧(如果)在指定的时间段内。
图5。
图5。
缺氧下调mTOR功能需要Redd1。(A类)蛋白质印迹分析Tsc2型+/+MEF是否经过放线菌素D预处理（缺氧时间进程开始前30分钟），并暴露于缺氧指定时间段。平行显示，分析Tsc2型+/+用放线菌素D处理指定时间段的细胞。Northern印迹(B类)和Western印迹(C类)分析红色1+/+和红色1-/-MEF缺氧治疗指定时间。
图6。
图6。
生长因子信号传导需要Tsc2而不是Redd1。蛋白质印迹分析Tsc2型+/+和Tsc2型-/-MEF公司(A类)或红色1+/+和红色1-/-MEF公司(B类)在指定时间段的血清剥夺后。
图7。
图7。
Redd1和Redd2下调S6K1磷酸化。(A类)抗HA免疫沉淀物的Western blot分析(顶部)或全细胞提取物(底部)来自HEK293细胞，该细胞转染了编码Redd1（R1）、缺乏中心结构域的Redd1突变体（R1dC）、Redd2（R2）、Redd 1和Redd2的HA标记表达载体（R1+R2）或空载体（pcDNA3）。HA-S6K1（S6K）在指示的地方被联合转染。在细胞收获前几个小时添加雷帕霉素。(B类)抗HA免疫沉淀物的Western blot分析(底部)或全细胞提取物(顶部)在富含血清的条件下，通过转染siRNAs（Sc，加扰；Tsc2，b和a）和表达载体（如A类在细胞收获前几个小时添加雷帕霉素。Ig（H）表示免疫球蛋白重链。(C类)Western blot分析转染指定siRNAs并用四环素刺激产生Redd1的HA-Red1诱导U2OS细胞的指定时间段。
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