The hypoxia-induced paralogs Scylla and Charybdis inhibit growth by down-regulating S6K activity upstream of TSC in Drosophila

doi:10.1101/gad.322704

.2004年12月1日；18(23):2879-92.

doi:10.1101/gad.322704。 Epub 2004年11月15日。

低氧诱导的副log通过下调果蝇TSC上游S6K活性抑制生长

简·H·瑞林¹, 恩斯特·哈芬

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采购管理信息： 15545626
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内政部： 10.1101/编号322704

低氧诱导的副log通过下调果蝇TSC上游S6K活性抑制生长

简·H·瑞林等。基因开发. 2004.

.2004年12月1日；18(23):2879-92.

doi:10.1101/gad.322704。 Epub 2004年11月15日。

作者

简·H·瑞林¹, 恩斯特·哈芬

附属

¹瑞士苏黎世大学动物研究所，CH-8057苏黎世。

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内政部： 10.1101/编号322704

摘要

不同的外在和内在线索必须整合在发育中的有机体中，以确保在细胞和有机体水平上适当生长。在果蝇中，胰岛素受体/TOR/S6K信号网络在控制新陈代谢和细胞生长中起着基本作用。在这里，我们表明，在EP（增强子/启动子）过度表达筛选中被鉴定为生长抑制物的两个同源基因scylla和charybdis充当了生长的负调控因子。这两种基因的同时缺失会使苍蝇更容易受到氧气浓度降低（缺氧）的影响，并表现出轻微的过度生长表型。相反，青蟹或菜籽过度激活会降低生长。生长抑制与S6K活性降低相关，但与PKB/Akt活性无关。遗传和生物化学分析将锡拉/夏令时放在PKB下游和TSC上游。此外，我们发现“锡拉”和“charybdis”在缺氧条件下被诱导，并且“锡拉”是果蝇HIF-1（缺氧诱导因子-1）的靶点，就像其哺乳动物对应物RTP801/REDD1一样，从而在生长和氧感应之间建立了潜在的串扰。

PubMed免责声明

数字

**图1。**
的过度表达锡拉和它的paralog查里布迪斯抑制Inr通路的过度活跃。(一个-E类)锡拉(C)和/或*查里布迪斯*(D类)过度表达（通过*EPscy公司*和*EPchar公司*分别）抑制PKB/PDK1依赖的大眼表型(B类). 基因型：*y w；GMR-镀锌4*/+ (*A、 A类*′);*y w；GMR-Gal4 UAS-PKB*/+;*EP837型*(≈*UAS-PDK1型*)/+ (*B、 B*′);*y w；GMR-Gal4 UAS-PKB*/+;*EP837/EPscy*(*C、 C类*′);*y w；GMR-Gal4 UAS-PKB*/+;*EP837/EPchar*(*D、 D类*′);*y w；GMR-Gal4，UAS-PKB*/+;*EP837/EPscy EPchar*(*E、 E类*’）。(F类)基因组组织锡拉和*查里布迪斯*以及相应的突变等位基因。(*G公司*)人类（h）、大鼠（r）、小鼠（m）、，爪蟾（x）和斑马鱼（z）。Charybdis有一个卷曲的螺旋结构域（氨基酸168-188），这在锡拉中是无法预测的。然而，基因家族进化上最保守的C末端部分与已知的蛋白质结构域缺乏相似性。

**图2。**
锡拉和夜蛾抑制生长。(一个)同时失去锡拉和Charybdis会导致体重增加。控制苍蝇（黑色条）由两个可能的双突变体中的任何一个表示*TM3公司*平衡染色体（前三个黑色列）或缺陷染色体(*Df（3L）葡萄酒4*)超过*TM3公司*（最后三根黑色柱），并与异等位双突变体苍蝇来自同一小瓶，第页<0.009，使用学生的t吨-测试（双尾）。每个基因型的苍蝇体重在32到65只之间。基因型（仅显示白色条）如下：*y w；scy公司¹¹³烧焦¹⁸⁰/scy公司^EP9.85型烧焦*¹⁸⁰(1);*y w；scy公司³¹烧焦¹⁸⁰/scy公司^EP9.85型烧焦*¹⁸⁰(2);*y w；scy公司³¹烧焦¹⁸⁰/scy公司¹¹³烧焦*¹⁸⁰(三);声母/+;*scy公司^EP9.85型烧焦¹⁸⁰/Df（3L）vin4泵*(4);声母/+;*scy公司¹¹³烧焦¹⁸⁰/Df（3L）vin4泵*(5);声母/+;*scy公司³¹烧焦¹⁸⁰/Df（3L）vin4泵*(6). (B类)无处不在锡拉和*查里布迪斯*过度表达会产生体重减轻的较小苍蝇。在我们所有的过度表达研究中，我们使用*EPscy公司*或*UAS字符#53*，正在驾驶锡拉和*查里布迪斯*分别为。显示了三个独立称重分析的代表性实验(n个每种基因型=35；第页<0.0001适用于*UAS-scy#2、EPscy、UAS-char#53*、和第页<0.02EPchar公司). 数据仅显示男性，但女性体重也显著减轻。基因型如下：*y w；行动5CGal4*/+（控制）(1);*y w；UAS-scy#2*/+;*行动5CGal4*/+ (2);*y w；法案5CGal4/EPscy*(三);*y w；Act5CGal4/UAS-char#53*(4);*y带Act5CGal4/EPchar*(5). (C-F类)成人眼睛的切向切片，显示感光细胞和相关的小眼细胞。细胞克隆或过度表达*青蟹/菜籽*或者缺乏两者的功能，可以通过缺乏红色来识别。锡拉-过度表达细胞(C)或*查里布迪斯*-过度表达细胞(D类)眼睛中的细胞比邻近的野生型细胞小，没有观察到图案缺陷。相反，青蟹双突变细胞的细胞大小略有增加(*E、 F类*). 基因型如下：*y w hsflp；GMR公司*>w个⁺>*Gal4/EPscy公司*(C);*y w hsflp；UAS字符#56*/+;*GMR公司*>w个⁺>*镀锌4*/+ (D类);*y w hsflp；FRT80系列¹¹³烧焦¹⁸⁰/FRT80瓦*⁺(E类);*y w hsflp；FRT80系列^EP9.85型烧焦¹⁸⁰/FRT80瓦*⁺(F类). (*G、 H（H）*)过表达果蝇翅膀细胞大小和细胞数量的量化锡拉测定后交叉静脉和五静脉交界处附近一个确定的方形区域内的毛发密度，并由此计算细胞大小。单元数对应于机翼总面积和单元尺寸的比值。锡拉过度表达只会减少细胞大小，而不会减少细胞数量。黑色条始终代表控件(*y w；行动5CGal4*/+)，白色条表示锡拉过度表达(*y w；法案5CGal4/EPscy*). 数字表示性别：1男性，以及2针对女性。我们分析了每个基因型的10只翅膀。

**图3。**
锡拉和*查里布迪斯*是由缺氧引起的，并且锡拉是的目标*果蝇属*HIF-1。(一个-D类)幼虫在低氧室中在2%O下孵育17小时₂或在2.8%O下保持7小时₂诱导锡拉(B类)和*查里布迪斯*(D类)通过mRNA原位杂交（ISH）评估的表达。自锡拉mRNA在常压下在肠道中检测到，很难评估锡拉在缺氧条件下，转录水平进一步被诱导（数据未显示）。(E类-J型)脂肪体上调中Tgo和Sima的定向共表达锡拉(*G公司*)但不是*查里布迪斯*(J型)转录。(*F、我*)阳性对照锡拉和*查里布迪斯*分别为。(*K（K）*-*P（P）*)青蟹蛋白定位于细胞核并在腺胃上调(N个)脂肪体（未显示）处于缺氧状态。基因型如下：声母(一个-D类);*y w；Lsp2铝4*/+ (*E、 H（H）*);*y w；Lsp2Gal4/EPscy公司*(F类);*y w；UAS-tgo公司*/+;*Lsp2Gal4/UAS-sima公司*^Δ692-863(*G、 J型*);*y w；Lsp2Gal4/EPchar公司*(我). (*K（K）*-*P（P）*)常氧条件下生长的青蟹捕蝇器幼虫(*K（K）*-*M（M）*)或在缺氧（2.8%O₂持续8小时；N个-*P（P）*).

**图4。**
锡拉抑制生长，以应对PKB下游但TSC上游Inr途径活性升高。(一个-C)A类*PKB/PDK1系列*-过度表达的眼部表型在锡拉突变背景。基因型如下：声母(*A、 A类*′);声母;*GMR-Gal4 UAS-PKB UAS-PDK1*/+ (*B、 B*′);*y w；GMR-Gal4 UAS-PKB UAS-PDK1*/+;*锡拉³¹/锡拉*¹¹³(*C、 C类*’）。(D类)损失锡拉部分抑制纯合子的体重减轻*巴基斯坦中央银行^三*突变体。双突变体与*巴基斯坦中央银行^三*本实验中，单个突变体为～6%（雄性）和10%（雌性）。显示了四个独立称重实验中的一个代表；第页< 0.0001,n个=60（雄性）和90（雌性）。(E类)发育不良者体重无差异*S6K系列*突变体组合和*S6K锡拉*观察到双突变体(n个= 30). (*F、 G公司*)*锡拉菜Tsc2*三个突变头相似*Tsc2型*单一突变体且不显示加性生长效应，表明锡拉和Charybdis作用于Tsc2上游。基因型如下：*y w eyflp；FRT80吉¹⁹²/FRT80 cl3L带*⁺(F类);*y w eyflp；FRT80系列^EP9.85型烧焦¹⁸⁰演出¹⁹²/FRT80 cl3L带*⁺(*G公司*). (*H（H）*)Rheb依赖性眼球肿胀表型不能被抑制*青蟹/菜籽*共表达。基因型如下：*y w；GMR-镀锌4*/+;*EPSheb（EPReb）*/+ (左边);*y w；GMR-镀锌4*/+;*EPReb/EPscy EPchar*(*正确的*).

**图5。**
锡拉降低S6K活性，但无论是锡拉还是Charybdis都不下调PKB活性。(一个)苍蝇头部提取物过度表达*巴基斯坦中央银行*和*PDK1系列*与任一锡拉或*查里布迪斯*在眼睛中检测PKB活性。未检测到任何减少（实验已执行两次）。显示基因型*在上面*放射自显影。（CT）Crosstide，一种合成PKB底物。(B类)眼部专用*PKB/PDK1系列*a中的共表达锡拉突变背景不会导致PKB活性升高（已经做了三个实验）。(C)无处不在锡拉过度表达使S6K活性平均降低56%，第页< 0.006. 通过在H2B底物中加入放射性标记的磷酸盐来测定二龄幼虫的S6K活性。控制(*行动5CGal4*/+)活动设置为100%。进行了五项独立实验。

**图6。**
锡拉和Charybdis在饥饿条件下延长寿命。(一个)纯合子*烧焦¹⁸⁰*突变体比对照动物更容易饥饿。显示了三个独立实验的平均偏差和标准偏差(n个=114烧焦¹⁸⁰/字符¹⁸⁰，米。；n个=145用于*烧焦¹⁸⁰*/+，米。；n个=82烧焦¹⁸⁰/字符¹⁸⁰，f。；和n个=127烧焦¹⁸⁰/+，f.）。(B类)2至3日龄成虫共存锡拉和*查里布迪斯*与对照苍蝇相比，这两种蛋白的同时过度表达大大延长了寿命。给出了三个独立实验的代表性示例。(C)无处不在的*锡拉、沙利比迪斯*，和/或同时使用*达加尔4*司机伴有男性血脂水平升高(左边酒吧集群）和女性(*正确的*酒吧集群；第页<0.065daGal4/EP1035，米。；对于所有其他基因型第页< 0.0009;n个= 10). （m.）雄性；（f）女性。

**图7。**
的模型*青蟹/菜籽*监管及其效果。锡拉和*查里布迪斯*是应激诱导的负性生长调节剂，在不利环境条件下抑制生长。它们可能进入PKB下游但TSC上游的Inr/TOR/S6K信号通路，以减轻PKB对TSC复合体的抑制作用，从而抑制生长。我们的结果并不排除S6K活性也对压力作出反应的可能性，这种反应与“锡拉”/“查理迪斯”功能无关。此外，Scylla/Charybdis也可能调节AMPK或受AMPK调节。详见正文。

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