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.2022年3月；13（3）：7457-7470。
doi:10.1080/21655979.2022.2048992。

转位蛋白18kDa的抑制通过ELAV-like RNA-binding protein 1/MAPK-activated protein kinase 3轴抑制胶质瘤的进展

王静亚 1 2 3, 彭仁 1, 曾志瑞 3, 李玛 1, 李云君 4, 张红梅 2, 郭文志 1
附属公司

转位蛋白18kDa的抑制通过ELAV-like RNA-binding protein 1/MAPK-activated protein kinase 3轴抑制胶质瘤的进展

王静亚等。 生物工程. 2022年3月.

摘要

胶质瘤是成人最常见的原发性恶性脑肿瘤。尽管在治疗方面取得了相当大的进展，但临床结果仍然令人沮丧。转运蛋白18kDa（TSPO）是一种进化上保守的跨膜蛋白，在胶质瘤中常被发现升高，预示着预后不良。然而，对胶质瘤中TSPO调控网络的研究还很有限。癌症基因组图谱（TCGA）和我们的研究组队列表明，TSPO在胶质瘤组织和胶质瘤细胞系中也高表达。抑制TSPO表达显著降低胶质瘤细胞的增殖和迁移率在体外TSPO的抑制降低了MAPK-activated protein kinase 3（MAPKAPK3）的表达，增加了其mRNA的降解速率。TSPO直接与ELAV1-like RNA-binding protein 1（HUR）相互作用，促进HUR的核质穿梭。抑制HUR可降低MAPKAPK3的表达、细胞增殖和迁移，而过度表达MAPKAPK可逆转这种作用。TSPO-敲除细胞中HUR的过度表达增强了MAPKAPK3的mRNA稳定性。此外，救援实验表明，HUR/MAPKAPK3轴解释了TSPO介导的对胶质瘤细胞增殖和迁移的影响。总之，我们的研究表明TSPO可能促进HUR的核质穿梭，从而增加MAPKAPK3的mRNA稳定性，促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。HUR/MAPKAPK3轴可能是阻断TSPO作用的关键靶点，并可能有助于胶质瘤治疗。

关键词：胶质瘤；HUR；MAPKAPK3；TSPO；流动性；增殖。

PubMed免责声明

利益冲突声明

提交人没有报告任何潜在的利益冲突。

数字

无
图形摘要
图1。
图1。
胶质瘤中TSPO表达增加（a）TCGA数据库中胶质瘤和邻近正常组织中TSPO的表达。（b） 在TCGA数据库中，胶质瘤组织中TSPO的表达增加预示着预后不良。（c-d）我们的研究队列中TSPO在胶质瘤和邻近组织中的表达。（e-f）TSPO在NHA、U251、U87和T98G细胞中的蛋白表达水平**P（P）< 0.01.
图2。
图2。
抑制TSPO抑制U251和U87细胞的增殖（a）通过qRT-PCR检测U251和U87细胞靶向TSPO siRNA的转染效率。（b） 通过Western blotting检测靶向U251和U87细胞TSPO siRNA的转染效率。（c） 采用CCK-8法检测TSPO抑制的U87和U251细胞24h增殖情况。（d） CCK-8法检测48h TSPO抑制的U87和U251细胞增殖情况。（e） EDU分析显示，TSPO表达降低抑制了U87和U251细胞的增殖**P（P）< 0.01.
图3。
图3。
TSPO的抑制降低了U251和U87细胞的迁移和侵袭（a–b）伤口愈合试验用于检测TSPO敲除的U251和U87细胞的伤口愈合率。伤口愈合率代表迁移能力。（c-d）采用Transwell侵袭试验评估NC组和si-TSPO组各区域的侵袭细胞数量。（e–g）在NC和si-TSPO组中，使用Western blotting检测EMT生物标记物，包括e-cadherin、N-cadherin，vimentin、β-catenin和Slug。（h-j）免疫荧光法检测TSPO抑制的U87和U251细胞中E-cadherin、Slug和β-catenin的表达**P（P）< 0.01.
图4。
图4。
MAPKAPK3与TSPO显著共表达（a）根据TCGA数据库的数据，确定了胶质瘤（包括LGG和GBM）中TSPO的共表达基因。（b-c）对TSPO共表达基因进行生物学功能和KEGG分析。（d-e）在TCGA数据库中，分别从LGG和GBM组织样本中确定TSPO和MAPKAPK3表达之间的相关性。（f） 我们队列中的胶质瘤组织中发现TSPO和MAPKAPK3表达之间的相关性。（g–h）根据TCGA数据库显示MAPKAPK3在胶质瘤患者中的表达及其与生存率的关系。
图5。
图5。
抑制TSPO降低MAPKAPK3的表达并增加其mRNA降解（a）用qRT-PCR检测TSPO抑制的U87和U251细胞中MAPKAPK3 mRNA的水平。（b） U251细胞的共免疫抑制表明，TSPO敲低的细胞具有较低的MAPKAPK3信号。（c-d）Western blotting显示，在TSPO抑制下，MAPKAPK3、p-MAPKAPK2和p-CREB的蛋白水平降低。（e） Amanitin（0.1µM）在0、2、4、6和8小时抑制mRNA合成，qRT-PCR结果表明，抑制TSPO表达增加了MAPKAPK3 mRNA的降解速率*P（P）< 0.05; **P（P）<0.01。
图6。
图6。
TSPO从细胞核向细胞质募集HUR（a）采用质谱法鉴定TSPO的相互作用蛋白。（b-c）对TSPO相互作用蛋白进行细胞成分富集和KEGG分析。（d-e）根据TCGA数据库显示HUR在胶质瘤患者中的表达及其与生存率的关系。（f） Western blotting表明HUR与TSPO直接结合。（g–h）Western blotting表明，抑制TSPO不会改变HUR的蛋白表达。（i） 免疫荧光显示，TSPO抑制了HUR从U87和U251细胞的细胞核向细胞质的穿梭。（j–k）提取细胞核和细胞质组分，并用Western blotting检测U251和U87细胞核和细胞质部分HUR的表达**P（P）< 0.01.
图7。
图7。
HUR调节MAPKAPK3表达及细胞增殖和迁移U251和U87细胞用NC siRNA+载体、HUR siRNA+vector和HUR siRNA+MAPKAPK3过表达质粒（MAPKAPK3-OE）处理。（a–b）Western blotting检测各组HUR、MAPKAPK3、p-MAPKAPK 3和p-CREB的蛋白表达。（c） 采用CCK-8法检测各组48小时内的细胞活力。（d-e）使用Transwell分析检测各组每个区域的侵袭细胞数量。（f–g）Western blotting检测HUR过表达的TSPO敲除细胞中MAPKAPK3的表达。（h） 用鹅膏碱（0.1µM）抑制mRNA合成0、2、4、6和8小时，qRT-PCR结果表明，HUR的过度表达增加了TSPO抑制的U87和U251细胞中MAPKAPK3 mRNA的稳定性*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
图8。
图8。
HUR或MAPKAPK3的过度表达逆转了TSPO对胶质瘤细胞的抑制作用U251和U87细胞用NC siRNA、TSPO siRNA、TS PO siRNA+HUR-OE和TS PO siRNA+MAPKAPK3-OE处理。（a） CCK-8分析用于检测上述条件处理后24和48小时内各组U87和U251细胞的增殖率。（b） EDU检测各组EDU阳性率。（c） 采用Transwell法检测各组每个区域的侵袭细胞数量*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.
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赠款和资金

本研究得到解放军医学青年训练项目（16QNP002）的支持。