转位蛋白18kDa的抑制通过ELAV-like RNA-binding protein 1/MAPK-activated protein kinase 3轴抑制胶质瘤的进展

胶质瘤组织采集

共有47名年龄在40-70岁的患者同意参与本研究。所有患者的切片均于2017年6月至2020年5月在中国人民解放军总医院第七医学中心病理科获得。根据WHO中枢神经系统肿瘤分类，所有样本均由三名病理学家独立诊断为原发性胶质瘤。所有患者在样本采集前均未接受放疗和化疗。所有患者均签署了书面知情同意书，我院人类伦理委员会（批准号：2020–106）批准组织采集和使用。

免疫组织化学和评分

所有胶质瘤标本均用4%多聚甲醛固定（目录号30525–89-4，Sigma-Aldrich，USA），嵌入石蜡中，并切割成4μm厚的载玻片。简而言之，将载玻片在二甲苯和分级醇中加热和脱水。在用0.01 M柠檬酸盐（中国武汉服务生物）缓冲液在pH 6.0、95°C下进行抗原回收20分钟后，用3%的过氧化氢封闭组织切片中的内源性过氧化物酶，然后添加5%牛血清白蛋白（中国武汉博斯特生物科技有限公司）以阻断非特异性结合。将载玻片作为TSPO（cat no.ab109497；Abcam，USA）一级抗体在4°C下培养过夜。然后，用PBS清洗切片，并用辣根过氧化物酶结合二级抗体（中国武汉Servicebio）孵育2小时。使用二氨基联苯胺和苏木精（ZSGB-BIO，中国北京）进行颜色显影，并使用正射显微镜（BX53版本；日本奥林巴斯）获得图像。目标蛋白水平是根据我们之前的出版物中描述的强度得分和具体方法计算的[²].

细胞培养和瞬时转染

正常人星形胶质细胞（NHAs）购自国家模型和特征实验细胞资源库（中国上海），胶质瘤细胞U87、U251和T98G取自美国类型培养库（美国）。所有细胞均在含有10%胎牛血清（FBS；Invitrogen）的DMEM（美国加利福尼亚州英维特罗根）中培养，培养温度为37°C，CO含量为5%₂TSPO小干扰RNA（siRNA；si-TSPO）、HUR siRNA（si-HUR）、阴性对照siRNA（NC）均来自中国广州GeneCopoeia。si-TSPO序列为5’-UCUUUGUGCCCGACAAUTT-3’，si-HUR序列为5‘-AAGAGCAAUUACCAGUUUCA-3’，NC序列为5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3’。过表达MAPKAPK3和HUR的质粒来自巨能汇达生物有限公司（中国武汉）。对于瞬时转染，细胞生长在6孔板上，50%汇合，并使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）转染siRNA和质粒。

蛋白质印迹

使用含有苯甲基磺酰氟的放射免疫分析沉淀裂解缓冲液（武汉博斯特生物技术有限公司）（广州东瑞科技有限公司，中国广州）提取神经胶质瘤细胞中的总蛋白。样品的蛋白质浓度采用双钦酸法（武汉博斯特生物技术有限公司）测定。采用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶（Beyotime Biotechnology，Suzhou，China）分离蛋白质。然后，将分离蛋白转移到聚偏二氟乙烯膜（Thermo Fisher Scientific，Waltham，MA，USA）上。在用脱脂奶粉（Beyotime Biotechnology）封闭膜后，用含有TSPO（1:1000，猫号ab109497；Abcam）、E-cadherin（1:1000；猫号20874-1-AP；Proteintech Group，中国武汉）、N-cadherin；Proteintech Group）、β-catenin（1:1000，目录号51067-2-AP；Proteinterch Group）、Slug（1:1000；目录号12129-1-AP；Protientech Group，p-CREB（1:1000，目录号#9198；Cell Signaling Technology，美国）、HUR（1:11000，目录号11910-1-AP；Proteintech Group）、H3（1:1000；目录号17168-1-AP；Proteitech Group）和α-微管蛋白（1:2000，目录编号11224-1-AP；蛋白质技术Group），在4°C下保持12小时。用含有0.1%吐温-20的Tris缓冲盐水冲洗两次，将膜与二级抗体孵育，并使用增强化学发光试剂进行可视化。以α-微管蛋白为负荷对照，计算总蛋白和胞浆蛋白的相对表达；以H3为负荷对照，计算核蛋白的相对表达。

细胞计数工具-8

使用细胞计数试剂盒-8（CCK-8；Dojindo Molecular Technologies Inc.，日本）检测胶质瘤细胞的能力。简而言之，每个孔共有3000个胶质瘤细胞放置在96 well板中（每组6个），并在37°C下培养24和48小时。然后，在更换培养基后，添加10μL CCK-8并培养2 h。使用多模读卡器（美国Bio-Rad实验室）在450 nm波长下检测每个孔的吸光度。这个实验进行了三次。

5-乙基-2-脱氧尿苷（EDU）掺入试验

根据BeyoClick™EDU-488细胞增殖检测试剂盒（Beyotime Biotechnology，中国杭州）的制造商规范进行5-乙炔基-2-脱氧尿苷（EDU）检测。简单地说，在共聚焦培养皿中培养的胶质瘤细胞转染后，加入EDU试剂并培养2小时。用磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤两次后，用4%多聚甲醛固定细胞30分钟。然后，将细胞与阿波罗染色反应液孵育30分钟，以检测阳性细胞。用4,6-二氨基-2-苯基吲哚染色鉴定细胞核后，在488nm的荧光显微镜下观察免疫荧光。

伤口愈合分析

细胞在无血清培养基中培养24小时，然后用丝裂霉素（1µg/mL）处理以抑制细胞分裂。然后，使用200µL移液管尖端刮除单层伤口，同时用PBS清洗浮动细胞三次。用无血清DMEM培养细胞，记录0～24h的伤口愈合情况。细胞迁移能力通过划痕愈合区域进行测量。

Transwell分析

胶质瘤细胞（5×10⁴细胞/孔）在200μL无FBS的DMEM中重新悬浮，并接种到预先涂有Matrigel（Invitrogen）的上跨阱室（Invitorgen）上，同时将含有10%FBS的700μL培养基添加到下跨阱室内。24h后，将入侵细胞固定并用0.5%结晶紫染色。最后，使用倒置显微镜拍摄五个随机区域，并计算每个区域中的平均侵袭细胞数。

免疫荧光和共焦显微镜

将胶质瘤细胞接种到共聚焦培养皿中，用4%甲醛固定，用0.2%Triton X（Beyotime Biotechnology，Suzhou，China）渗透。用5%BSA封闭后，在4°C下过夜，用抗E-cadherin（1:200）、Slug（1:200。用PBS洗涤并用CY3或FITC-标记的第二抗体孵育后，用4,6-二氨基-2-苯基吲哚试剂对细胞核进行染色，并使用Ti2-U荧光显微镜（日本尼康）或Axiotron 300 XYZ共焦显微镜（德国蔡司）进行可视化。

定量实时PCR

使用TRIzol试剂从培养细胞中分离出总RNA，使用RevertAid First Strand cDNA合成试剂盒（Thermo Fisher Scientific）用2μg总RNA合成互补DNA（cDNA）。使用Aceq Universal SYBR qPCR Master Mix（Vazyme，中国南京）在罗氏LightCycler 480系统（罗氏，中国上海）上进行RT-qPCR，以检测特定基因表达的变化。α-微管蛋白作为负载对照。第2个^−ΔΔ采用Ct法测定靶基因的相对表达。本研究中使用的引物如下：

TSPO转发：5'-CCTGCTCTACCCTACCTACGTACG-3'

TSPO反面：5'-GCCATCGCAGTAGTTGAGTG-3'

MAPKAPK3正向：5'-GGAAGGTGTGAGTTGTTCAG-3'

MAPKAPK3反面：5'-GCCATATCGCATACTCTG-3'

α-微管蛋白前向：5'-TCGATATTGAGCGTCCAACCT-3'

α-微管蛋白反向：5'-CAAAGGCACGTTTGGCATACA-3'

免疫沉淀（IP）和质谱鉴定

简单地说，使用弱放射免疫分析沉淀溶解缓冲液（Beyotime Biotechnology，杭州，中国）来溶解U251细胞。然后将细胞裂解物在12000 g下于4℃离心20 min，然后将上清液与TSPO抗体在4℃培养过夜，然后在4℃用蛋白A/g包被的琼脂糖珠（美国默克公司）再培养4 h。随后，用冷免疫沉淀（IP）缓冲液清洗样品三次，并通过2000 g离心1分钟去除上清液。然后在95°C下使用加载缓冲液将蛋白质从珠子中分离5分钟。收集上清液，并通过印迹法和质谱法检测所示抗体。

在胶质瘤组织和细胞系中观察到TSPO的高表达

根据TCGA的数据，TSPO在胶质瘤组织中高度表达(图1a)而TSPO表达增加与预后不良相关(图1b). 同样，与邻近组织相比，在我们研究队列中的胶质瘤组织中，TSPO也高表达(图1c–d). 此外，我们发现与NHA细胞相比，U251、U87和T98细胞中TSPO的表达更高(图1e–f).

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图1。

胶质瘤中TSPO表达增加（a）TCGA数据库中胶质瘤和邻近正常组织中TSPO的表达。（b） 在TCGA数据库中，胶质瘤组织中TSPO的表达增加预示着预后不良。（c-d）来自我们研究队列的TSPO在神经胶质瘤和邻近组织中的表达。（e-f）NHA、U251、U87和T98G细胞中TSPO的蛋白表达水平**P（P）< 0.01.

TSPO的敲除抑制神经胶质瘤的增殖和迁移

将NC和TSPO siRNA转染胶质瘤细胞株U87和U251。qRT-PCR和Western blotting结果表明，TSPO siRNA显著降低了U87和U251细胞的表达(图2a-b). CCK-8测定表明，TSPO表达减少可在48小时内抑制U87和U251细胞的细胞活力(图2c-d). 此外，EDU分析表明TSPO表达降低抑制U87和U251细胞的快速增殖(图2e). 同样，TSPO表达较低的U87和U251细胞也表现出迁移减少(图3a-b)和入侵能力(图3c-d). 先前的研究表明，上皮细胞向间充质细胞转化（EMT）是多种类型癌症活动性的关键过程[²²]。然后，测定几种EMT生物标记物在U87和U251细胞中的表达水平。Western blotting结果表明，TSPO低表达的U87和U251细胞中E-cadherin表达水平上调，而N-cadherin、vimentin、β-catenin和Slug表达降低(图3e-g). 与Western blotting的结果类似，免疫荧光结果也表明E-cadherin在U87和U251细胞中的表达显著升高，而TSPO被抑制(图3h)Slug和β-catenin减少(图3i–j). 有趣的是，虽然TSPO在NHA细胞中的表达降低(补充图1A–C)，扩散发生重大变化(补充图1D)和移动性(补充图1E)未找到NHA的。这些结果表明TSPO可能作为一种癌蛋白促进胶质瘤细胞的增殖和迁移。

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图2。

抑制TSPO抑制U251和U87细胞的增殖（a）通过qRT-PCR检测U251和U87细胞靶向TSPO siRNA的转染效率。（b） 通过Western blotting检测靶向U251和U87细胞TSPO siRNA的转染效率。（c） 采用CCK-8法检测TSPO抑制的U87和U251细胞24h增殖情况。（d） CCK-8法检测48h TSPO抑制的U87和U251细胞增殖情况。（e） EDU分析显示，TSPO表达降低抑制了U87和U251细胞的增殖**P（P）< 0.01.

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图3。

抑制TSPO可减少U251和U87细胞的迁移和侵袭（a–b）伤口愈合试验用于检测TSPO敲除的U251和U87细胞的伤口愈合率。伤口愈合率代表迁移能力。（c-d）使用Transwell侵袭分析来评估NC和si-TSPO组的每个领域中的侵袭细胞数量。（e–g）在NC和si-TSPO组中，使用Western blotting检测EMT生物标记物，包括e-cadherin、N-cadherin，vimentin、β-catenin和Slug。（h-j）免疫荧光用于检测具有TSPO抑制的U87和U251细胞中E-钙粘蛋白、Slug和β-连环蛋白的表达**P（P）< 0.01.

抑制TSPO表达降低MAPKAPK3 mRNA的稳定性

为了进一步探讨TSPO在胶质瘤中的分子机制，首先，根据TCGA数据库中的数据分析了胶质瘤中TSPO的共表达基因。共发现2648个基因(图4a). 生物过程富集和KEGG分析表明，TSPO共表达基因富集于“信号转导”、“GTPase活性的正向调节”、“免疫反应”、“炎症反应”、”先天免疫反应“、”小GTPase介导的信号转导“、”MAPK信号通路“、，'和'Ras信号通路'(图4b–c). 众所周知，MAPK信号通路参与了胶质瘤的发展[²⁰]。必须密切关注MAPK信号通路，该通路的一个成员MAPKAPK3在TCGA胶质瘤组织和我们的胶质瘤组织中与TSPO显著共表达(图4d-f). 我们发现MAPKAPK3在胶质瘤组织中高表达，高表达与预后不良相关(图4g-h). 此外，我们发现抑制TSPO表达显著降低MAPKAPK3的mRNA水平(图5a). 通过与U251细胞中TSPO和MAPKAPK3的联合免疫染色，我们发现TSPO表达低的细胞具有较弱的MAPKAPK 3信号(图5b). 此外，通过Western blotting发现，在TSPO敲除的U251和U87细胞中，MAPKAPK3和p-MAPKAPK2均减少(图5c-d). 由于CREB是MAPKAPK3的下游靶点，因此检测到CREB的表达。CREB的总表达没有发现显著变化，而TSPO抑制的U251和U87细胞中p-CREB显著降低(图5c-d). 此外，当使用amanitin（0.1µM）抑制mRNA合成时，抑制TSPO表达会增加MAPKAPK3 mRNA的降解速率(图5e).

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图4。

MAPKAPK3与TSPO显著共表达（a）根据TCGA数据库的数据，确定了胶质瘤（包括LGG和GBM）中TSPO的共表达基因。（b-c）对TSPO共表达基因进行生物学功能和KEGG分析。（d-e）在TCGA数据库中，分别从LGG和GBM组织样本中确定TSPO和MAPKAPK3表达之间的相关性。（f） 我们队列中的胶质瘤组织中发现TSPO和MAPKAPK3表达之间的相关性。（g–h）根据TCGA数据库显示MAPKAPK3在胶质瘤患者中的表达及其与生存率的关系。

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图5。

抑制TSPO降低MAPKAPK3的表达并增加其mRNA降解（a）用qRT-PCR检测TSPO抑制的U87和U251细胞中MAPKAPK3 mRNA的水平。（b） U251细胞的共免疫抑制表明，TSPO敲低的细胞具有较低的MAPKAPK3信号。（c-d）Western blotting显示，在TSPO抑制下，MAPKAPK3、p-MAPKAPK2和p-CREB的蛋白水平降低。（e） 鹅膏素（0.1µM）用于在0、2、4、6和8小时抑制mRNA合成，qRT-PCR结果表明，TSPO表达的抑制增加了MAPKAPK3 mRNA的降解率*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.

TSPO从细胞核向细胞质募集HUR

为了探讨TSPO如何调节MAPKAPK3的mRNA稳定性，使用质谱法鉴定了TSPO的相互作用蛋白(图6a). 有趣的是，细胞成分富集分析表明TSPO的相互作用蛋白在细胞质中富集(图6b). 生物过程富集分析表明，TSPO的相互作用蛋白在mRNA分解代谢过程中富集并调节mRNA稳定性(图6c). HUR（也称为ELAVL1）是一种富集蛋白，在神经胶质瘤中高度表达，与患者预后呈负相关(图6d-e). 同样，IP分析表明HUR直接与TSPO结合(图6f). 抑制TSPO表达不会改变HUR的表达(图6g-h)但招募的HUR从细胞核穿梭到细胞质(图6i-k).

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图6。

TSPO从细胞核向细胞质募集HUR（a）采用质谱法鉴定TSPO的相互作用蛋白。（b-c）对TSPO相互作用蛋白进行细胞成分富集和KEGG分析。（d-e）根据TCGA数据库显示HUR在胶质瘤患者中的表达及其与生存率的关系。（f） Western blotting表明HUR与TSPO直接结合。（g–h）Western blotting表明，抑制TSPO不会改变HUR的蛋白表达。（i） 免疫荧光显示，TSPO抑制了HUR从U87和U251细胞的细胞核向细胞质的穿梭。（j–k）提取细胞核和细胞质组分，并用Western blotting检测U251和U87细胞核和细胞质部分HUR的表达**P（P）< 0.01.

HUR增加MAPKAPK3 mRNA的稳定性并调节细胞增殖和迁移

通过Western blotting，抑制HUR明显降低MAPKAPK3、p-MAPKAPK2和p-CREB的表达，而过度表达MAPKAPK可逆转HUR的作用(图7a-b). HUR抑制在48小时内显著降低了U251和U87细胞的活性，而MAPKAPK3的过度表达则显著减轻了其影响(图7c). 同样，HUR的抑制在24小时内显著降低了U251和U87细胞的侵袭性，而MAPKAPK3的过度表达则显著减轻了其影响(图7d–e). 此外，我们发现HUR的过度表达增加了TSPO敲除的U251和U87细胞中MAPKAPK3的表达(图7f–g). 此外，HUR的过表达增加了TSPO低表达的U251和U87细胞中MAPKAPK3 mRNA的稳定性(图7h).

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图7。

HUR调节MAPKAPK3表达及细胞增殖和迁移U251和U87细胞用NC siRNA+载体、HUR siRNA+vector和HUR siRNA+MAPKAPK3过表达质粒（MAPKAPK3-OE）处理。（a–b）Western blotting检测各组HUR、MAPKAPK3、p-MAPKAPK 3和p-CREB的蛋白表达。（c） 使用CCK-8测定法检测各组在48小时内的细胞活力。（d-e）使用Transwell分析检测各组每个区域的侵袭细胞数量。（f–g）使用蛋白质印迹来检测具有HUR过表达的TSPO敲低细胞中MAPKAPK3的表达。（h） 用鹅膏碱（0.1µM）抑制mRNA合成0、2、4、6和8小时，qRT-PCR结果表明，HUR的过度表达增加了TSPO抑制的U87和U251细胞中MAPKAPK3 mRNA的稳定性*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01.