丹皮酚通过AMPK/mTOR信号通路上调自噬对血管平滑肌细胞增殖的抗动脉粥样硬化作用

化学品和试剂

丹皮酚（98.5%）购自中国安徽白草生物科技公司。Ox-LDL购自新源嘉禾生物科技公司（中国北京）。CCK-8和BrdU细胞增殖试剂盒分别从Beyotime生物技术研究所（中国上海）和Roche Diagnostics GmbH（德国曼海姆）购买。本研究中使用了以下抗体：PCNA（ab92552，Abcam）、LC3（ab128025，Abcam）、p62（ab56416，Abcam）、AMPK（ab80039，Abcam）、mTOR（ab32028，Abcam）、p-AMPK（ab133448，Abcam）、p-mTOR（5536，细胞信号传导）和α-SMA（ab7817，Abcam）。辣根过氧化物酶结合二级抗体购自中山金桥生物科技有限公司（中国北京）。免疫荧光的二级抗体为山羊抗鼠IgG Alexa Fluor-488和山羊抗兔IgG Alexa Fluxor-594（Invitrogen，Carlsbad，CA，United States）。所有其他化学试剂均来自商业供应商。

动物模型

ApoE-敲除小鼠，C57BL/6背景，购自中国北京Vital Riverv实验动物科学部，用于建立动脉粥样硬化动物模型。将6周龄雄性小鼠置于标准实验室条件（温度22–25°C，相对湿度55–65%）下，12:12暗/光。给小鼠喂食高胆固醇饮食（HCD，含21%脂肪和0.15%胆固醇），直到小鼠动脉明显形成动脉粥样硬化病变。随后，将动脉粥样硬化动物随机分为四组(n个=8只小鼠/组）。三组每天口服400、200和100毫克/千克体重的丹皮酚，置于5%CMC-Na溶液中，持续6周。一组小鼠口服CMC-Na溶液作为模型组，6周龄雄性C57BL/6小鼠作为对照组，在整个实验过程中以正常饮食喂养。

小鼠被放血处死。采集血样，取出心脏和动脉，置于冷PBS中。将动脉从周围结缔组织中清除，并包埋在OCT包埋介质中，以进行组织学和免疫荧光分析。

血清生化分析

使用商用试剂盒（中国上海DIASYS公司）测量总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）的浓度。使用商业试剂盒（SEKISUI公司，日本上海）通过酶比色法分析LDL胆固醇（LDL-c）和HDL胆固醇（HDL-c）。使用ELISA试剂盒（美国Biosource）测量ox-LDL水平。这些分析以盲法进行，每个动物组内重复进行。

组织学和免疫荧光

将动脉窦埋入OCT包埋介质中，切割成7μm厚，并用苏木精和伊红（H&E）染色。动脉根部为10μm，进行Oil-red O（ORO）染色。处理冰冻切片，并用抗α-SMA抗体（1:200稀释）和抗LC3抗体（1:2000稀释）孵育。分别用山羊抗鼠IgG Alexa Fluor-488（1:500稀释）和山羊抗兔IgG Alexa Flu-594（1:500稀）观察LC3和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）。这些图像由共焦显微镜（SP5，德国莱卡）捕获。

主动脉面部染色

将包括主动脉弓、胸和腹部在内的全部动脉纵向切开，固定，然后用ORO染色，以测量血管壁表面的脂质。这些图像是由数码相机（佳能EOS 7D，日本东京）拍摄的。

细胞培养和治疗

如我们之前的研究所述，通过外植体技术从C57BL/6J小鼠动脉中分离血管平滑肌细胞(刘等人，2014). 总之，动脉纵向开放，内皮和血管外膜轻微刮伤。动脉的介质层在胶原酶I溶液中消化，切成块，然后放入培养瓶中。在37°C、5%CO的含胎牛血清的DMEM中孵育动脉片段₂细胞融合后，进行传代培养。使用α-SMA（阳性）和因子VIII（阴性）的免疫化学来确认VSMC的纯度。所有实验均涉及不超过第10段的VSMC。在抑制试验中，在加入加入或不加入丹皮酚的ox-LDL培养24小时后，用氯喹（CQ，50μM）、化合物C（CC，10μM）和雷帕霉素（rap，100 nM）处理VSMC 1小时。

通过CCK-8增殖试验评估细胞活性

通过加入CCK-8评估不同浓度（12.5-200μg/mL）的ox-LDL对VSMC增殖的影响。简言之，将VSMCs接种到96孔板中，并与不同浓度的ox-LDL孵育24小时。加入CCK-8溶液并在黑暗中孵育1.5小时，然后通过微孔板吸光度读取器在450nm下测试它们。

BrdU法评估细胞增殖

在不同浓度（7.5、15、30、60、120和240μM）的丹皮酚存在或不存在的情况下，用ox-LDL（50μg/mL）处理血管平滑肌细胞24小时。根据制造商的说明，在实验结束前1小时添加BrdU。相对增殖率是处理后VSMC的吸光度与对照组VSMC的吸光度之比。对照组的BrdU掺入率设置为100%。

流式细胞术的细胞周期分析

收集处理后的VSMC，并在-20°C下与70%甲醇孵育24 h。细胞用含有Triton X-100、柠檬酸钠和PI（50μg/mL）的碘化丙锭（PI）溶液重新悬浮。采用流式细胞术检测PI染色的VSMC（BD-Acuri C6，Becton-Dickinson，Mansfield，MA，美国）。使用BD-Accuri C6软件（1.0.264版，美国马萨诸塞州曼斯菲尔德）分析细胞百分比。

免疫荧光显微镜的细胞染色

血管平滑肌细胞与抗LC3抗体和抗p62抗体（均为1:500）孵育，然后与相应的二级抗体孵育。然后用DAPI培养细胞以观察细胞核。最后，通过倒置荧光显微镜对细胞进行评估。

吖啶橙（AO）细胞染色

血管平滑肌细胞在37°C的黑暗中用AO（1μg/mL）处理15分钟。在倒置荧光显微镜下观察VSMC。或者，收集AO染色的VSMCs，并通过流式细胞术进行分析。酸性囊泡细胞器的积累被量化为红/绿荧光比率（FL3/FL1平均值）。

透射电子显微镜（TEM）分析

样品用2.5%戊二醛固定，用2%OsO后固定₄在梯度醇中脱水后，将样品嵌入Epon-Araldite树脂中。薄片用醋酸铀酰和柠檬酸铅染色。利用透射电子显微镜（透射电子显微镜，TEM，H-7650，Hitachi，Japan）观察自噬体。

Si-RNA技术

根据制造商的协议，使用针对小鼠AMPK-α1的小干扰RNA（si-AMPK序列，意义：5′-GAG CGA CUA UCA AAG ACA UTT-3′，反义：5′-AUG UCU UU AUA GUC GCU CTT-3′）和加扰si-RNA，并从Santa Cruz Biotechnology购买。

西部印记

血管平滑肌细胞在RIPA裂解缓冲液中裂解，并在冰上培养30分钟。离心后收集上清液。提取小鼠中层血管平滑肌细胞如下：纵向打开小鼠动脉，刮去内皮和血管外膜，然后用裂解缓冲液溶解。蛋白质浓度通过双茚四酮酸测定进行测试（中国上海贝尤蒂姆）。蛋白质通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶分离并转移到PVDF膜上。在PBS中用5%脱脂牛奶和0.05%吐温20封闭斑点，并在4°C下与一级抗体孵育过夜。孵育过夜后，将印迹与辣根过氧化物酶偶联的第二抗体孵育，并通过增强化学发光检测试剂盒进行检测。

分子对接分析

为了研究丹皮酚与AMPK活性位点的可能结合构象，使用Surflex-Dock程序进行了分子对接研究(Jain，1996年)SYBYL7.1（Tripos公司，美国密苏里州圣路易斯）。人AMPK[PDB ID:4CFE的晶体结构(肖等人，2013)，用于对接的分辨率=3.02º]来自RSCB蛋白质数据库¹从蛋白质中除去水分子和其他杂原子，随后加入氢原子。丹皮酚的3D结构以MOL2格式制备，并在能量最小化后对接到蛋白质中。使用了Surflex-Dock程序的默认参数。最后，选择核构象最高的构象来研究AMPK与丹皮酚的相互作用。

丹皮酚抑制ApoE动脉中层细胞增殖和诱导自噬^-/-老鼠

生理上，VSMC是血管壁中层的唯一细胞类型。众所周知，血管平滑肌细胞在动脉粥样硬化中的作用与其增殖特性有关。血管平滑肌细胞增殖、生长并迁移至内膜，诱导动脉粥样硬化斑块的形成。因此，我们使用载脂蛋白E介质层的α-SMA染色检测了丹皮酚对VSMC增殖的影响^-/-老鼠。如所示数字2A、B，丹皮酚降低apoE中层α-SMA水平^-/-老鼠。动脉组织上的Western blotting显示，与模型组相比，丹皮酚处理的小鼠PCNA的表达高度降低(图​图2C2摄氏度和补充图第1节a). 总之，这些结果证实了丹皮酚抑制VSMC增殖并防止血管纤维化体内这可能是丹皮酚可以限制apoE中动脉粥样硬化发展的原因之一^-/-老鼠。

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图2

丹皮酚诱导血管平滑肌细胞自噬并抑制apoE细胞增殖^-/-老鼠。（A）解剖动脉并用于共聚焦免疫荧光分析。自噬标记LC3II（红色）与平滑肌标记α-SMA（绿色）的典型共焦荧光图像。棒材=100μm。（B）平滑肌面积的量化。（C）小鼠动脉中层PCNA的蛋白表达。（D）总结了LC3II与α-SMA在小鼠动脉中层的共定位系数。（E）小鼠动脉介质层中LC3II的蛋白质表达。数据为平均值±SD，n个= 3.^∗∗P（P）< 0.01,^∗P（P）与对照组相比<0.05，^#P（P）< 0.05,^##P（P）与模型组相比<0.01。（F）小鼠动脉中层的电镜分析。黑色箭头表示自噬体。Bar=200 nm。Pae-H，400 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-M，200 mg/kg体重的丹皮酚。Pae-L，100 mg/kg体重的丹皮酚。

在动脉粥样硬化形成的早期，增强VSMC的自噬有利于减少细胞增殖和防止纤维化。我们还通过对载脂蛋白E斑块介质层的LC3II斑点进行染色来检测丹皮酚对自噬的影响^-/-老鼠。如所示数字2A、D，代表性的共聚焦显微镜图像和总结的共定位系数表明，与模型小鼠相比，丹皮酚处理小鼠的动脉介质中的LC3II增加得更多，在模型小鼠中，它主要与平滑肌标记物α-SMA共定位。免疫荧光分析显示，丹皮酚增加了载脂蛋白E斑块介质层中LC3II的蛋白水平^-/-小鼠，证实丹皮酚诱导VSMC自噬体内动脉中层组织提取物的Western blotting显示，与模型组相比，经丹皮酚处理的小鼠中LC3II的表达显著增加(图​图2E第二版和补充图S1b类). TEM进一步证实了这一结果，TEM也显示apoE介质层中的自噬体增加^-/-pae-L、pae-M和pae-H组的小鼠(图​图2F2楼).

与模型组相比，apoE的媒体层^-/-白芍醇处理后小鼠VSMC增殖受到抑制，自噬增加；因此，丹皮酚可诱导血管平滑肌细胞自噬，并对动脉粥样硬化中的细胞增殖起保护作用。

丹皮酚抑制ox-LDL诱导的血管平滑肌细胞增殖

图​图3A3A级通过CCK-8分析显示ox-LDL浓度（12.5-200μg/mL）对细胞增殖的影响。如所示图​图3A3A级ox-LDL（12.5-200μg/mL）处理24h后，细胞增殖增加，在50μg/mL ox-LDL.时达到最高值。超过200μg/mL的Ox-LDL浓度显示出明显的细胞毒性作用。在本研究中，选择用50μg/mL ox-LDL处理24小时用于后续实验。我们首先使用CCK8分析研究了丹皮酚对细胞增殖的影响。丹皮酚以剂量依赖性方式显著抑制VSMC增殖(图​图3B第3页). BrdU掺入试验用于进一步研究丹皮酚对DNA合成的影响。丹皮酚以剂量依赖的方式显著抑制ox-LDL刺激诱导的BrdU掺入(图​图3C3C公司). 此外，在没有ox-LDL的情况下，丹皮酚治疗并没有降低VSMC的活性或其与BrdU的结合，这表明这些浓度的丹皮酚处理对细胞没有细胞毒性作用；因此，导致细胞DNA丢失的是丹皮酚n靶DNA合成的抑制作用，而不是细胞毒性(数字3B、C).

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图3

丹皮酚治疗通过ox-LDL刺激阻止VSMC增殖和DNA合成。（A）不同浓度的ox-LDL对VSMC增殖的影响，如CCK8分析所评估的。（B）在没有或存在ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用指示浓度的丹皮酚（7.5–240μM）处理VSMC 24小时。用CCK8法检测细胞活力。（C）BrdU法检测细胞增殖。数据为平均值±SD，n个= 3.^∗第页< 0.05,^∗∗第页与对照组相比<0.01。^#第页< 0.05,^##第页与ox-LDL组相比<0.01。

丹皮酚在细胞周期G1/G0期阻滞VSMCs

细胞增殖受细胞周期进展的控制。我们分析了丹皮酚处理对VSMC细胞周期阶段分布的影响。如流式细胞仪所示(图​图44)ox-LDL刺激显著增加了S期细胞的百分比，降低了G0/G1期细胞的比例，而丹皮酚显著减少了VSMC中S期细胞数量，增加了G0/G1期的比例。值得注意的是，丹皮酚介导的S期阻滞也与观察到的细胞周期S期BrdU掺入减少相一致。

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图4

丹皮酚治疗可防止VSMC的细胞周期进展。在不存在或存在ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用不同浓度的丹皮酚处理VSMCs 24小时，然后用PI染色细胞核并通过流式细胞术进行分析。给出了三个独立实验的汇编评估。数据为平均值±SD，n个= 3.^∗∗第页与对照组相比<0.01。^##第页与ox-LDL组相比<0.01。

丹皮酚诱导的VSMC自噬

在ox-LDL与丹皮酚联合或不联合治疗后，进一步研究了激活自噬机制的分子事件。荧光显微镜和流式细胞仪分析均显示丹皮酚处理细胞中AO红色荧光增强(数字​图5A5A级–D类). 在ox-LDL治疗中添加丹皮酚对自噬水平产生了剂量依赖性的协同效应，自噬空泡的形成增加证明了这一点。通过免疫印迹分析检测LC3处理和LC3II积累来评估VSMC的自噬水平。因此，丹皮酚以剂量依赖性的方式增加LC3II/肌动蛋白的比率(图​图5E第五版和补充图S2a公司)表明丹皮酚在VSMC中诱导自噬。丹皮酚治疗可显著降低p62水平(图​图5F5楼和补充图S2b美元)，自噬降解的指标(Ichimura等人，2008年)这实际上代表了自噬介导的蛋白水解的增加。最后，TEM分析证实了自噬的诱导。对照组和ox-LDL组的TEM图像显示细胞质正常，以线粒体、不规则细胞核、游离核糖体、自噬体和溶酶体为特征。相反，丹皮酚组表现出广泛的细胞质空泡化，在不同时期细胞质中有许多自噬体(图​图5G5克).

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图5

丹皮酚诱导的VMSC自噬。在没有或存在ox-LDL（50μg/mL）的情况下，用不同浓度的丹皮酚处理细胞24小时。荧光显微镜显示细胞中AO染色，Bar=50μm（A）和流式细胞术（B）.（C）自噬值计算为AO的百分比⁺与单元格总数相关的单元格。（D）通过红到绿（FL3/FL1）平均荧光强度计算细胞内酸化。（E）LC3处理和（F）western blot检测VSMC中p62水平。数据为平均值±标准差，n个= 3.^∗∗第页与对照组相比<0.01。^#第页< 0.05,^##第页与ox-LDL组相比<0.01。（G）VSMC的典型TEM图像。箭头表示自噬体。条形=500 nm。

丹皮酚通过上调自噬抑制ox-LDL诱导的VSMC增殖

为了研究丹皮酚是否可以通过自噬诱导来阻止VSMC增殖，我们通过抑制自噬来测试自噬和细胞增殖的变化。用CQ预处理VSMC 1h，在不存在或存在丹皮酚（30μM）的情况下用ox-LDL（50μg/mL）处理24h。在不存在CQ或存在CQ的情况下，用免疫印迹法评估LC3II积累和p62降解水平。

与对照组相比，CQ单独导致LC3II表达明显增加，这反映了自噬通量抑制导致自噬体积聚。在ox-LDL和丹皮酚联合治疗组中添加CQ导致LC3II水平高于ox-LDL-和丹皮醇联合治疗组。与对照组或ox-LDL组相比，丹皮酚明显增加LC3II的积累(图​图6A6A级和补充图第3章). 此外，在丹皮酚诱导的自噬被CQ抑制后，丹皮酚的抗增殖作用消失，如使用CCK8测定所评估的(图​图6B6亿). 与ox-LDL组相比，ox-LDL单独组的CQ预处理对细胞增殖无影响。这些结果表明，丹皮酚的抗增殖作用有助于VSMC的自噬。

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图6

丹皮酚通过诱导VSMC自噬抑制ox-LDL诱导的细胞增殖。（A）在没有或存在CQ的情况下用丹皮酚处理的ox-LDL诱导的VSMC中LC3处理的代表性斑点。（B）CCK8法检测VSMC增殖情况。（C）LC3阳性点占细胞总面积的百分比。（D）p62阳性点占细胞总面积的百分比。数据为平均值±SD，n个= 3.^∗第页< 0.05,^∗∗第页< 0.01.（E）LC3（红色）和DAPI染色的免疫荧光代表性图像。（F）p62（绿色）和DAPI染色的免疫荧光代表性图像。巴=50μm。（G）VSMC的TEM图像。箭头表示自噬体。条形=500 nm。

为了进一步证实丹皮酚诱导的VSMC自噬，利用免疫荧光揭示LC3和p62的细胞内定位。对照组和ox-LDL组的VSMC几乎没有LC3（红色）染色。相反，用丹皮酚或丹皮酚加CQ处理的VSMC显示LC3阳性染色分布(数字6C、E). 对于p62，经丹皮酚处理的VSMC几乎没有p62染色(数字第6天，第6天). TEM也检测到VSMC的超微结构变化(图​图6G6克). 用丹皮酚或丹皮酚加CQ处理的VSMC显示自噬体分散在细胞质中。

本研究得到了国家自然科学基金项目（No.81473386和81773937）、安徽省教育厅自然科学计划项目（KJ2015A061）和安徽省高校杰出青年人才支持计划重点项目（gxyqZD2016135）的支持。