Osteopetrosis in TAK1-deficient mice owing to defective NF-κB and NOTCH signaling

doi:10.1073/pnas.1415213112

.2015年1月6日；112(1):154-9.

doi:10.1073/pnas.1415213112。 Epub 2014年12月22日。

NF-κB和NOTCH信号缺陷导致TAK1缺陷小鼠骨质疏松

高拉夫·斯瓦恩卡尔¹, 坎南·卡鲁帕亚¹, 加布里埃尔·姆巴拉维尔², Tim Hung-Po Chen（蒂姆·洪波·陈）¹, 优素福·阿布·阿梅尔^三

附属公司

¹骨科手术和细胞生物学与生理学系。
²密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院医学系骨与矿物科，邮编63110。
^三骨科手术与细胞生物学和生理学系abuamery@wustl.edu。

PMID： 25535389
预防性维修识别码：项目经理4291677
内政部： 10.1073/pnas.1415213112

NF-κB和NOTCH信号缺陷导致TAK1缺陷小鼠骨质疏松

高拉夫·斯瓦恩卡尔等。美国国家科学院程序. 2015.

.2015年1月6日；112(1):154-9.

doi:10.1073/pnas.1415213112。 Epub 2014年12月22日。

作者

高拉夫·斯瓦恩卡尔¹, 坎南·卡鲁帕亚¹, 加布里埃尔·姆巴拉维尔², Tim Hung-Po Chen（蒂姆·洪波·陈）¹, 尤瑟夫·阿默尔^三

附属公司

¹骨科手术和细胞生物学与生理学系。
²密苏里州圣路易斯市华盛顿大学医学院医学系骨与矿物科，邮编63110。
^三骨科手术与细胞生物学和生理学系abuamery@wustl.edu。

PMID： 25535389
预防性维修识别码：第5291677页
内政部： 10.1073/pnas.1415213112

摘要

MAP激酶TGFβ活化激酶（TAK1）在细胞存活、分化、凋亡、炎症和肿瘤发生等生理和病理细胞功能中起着关键作用。然而，其作用机制的全部剧目尚未阐明。在这里，我们发现髓样细胞中Tak1的消融会导致小鼠破骨细胞生成缺陷导致骨质疏松症。从机制上讲，Tak1缺乏与NUMB样（NUMBL）水平增加相关。因此，Numbl的强制表达可消除破骨细胞生成，而其缺失可部分恢复破骨细胞的生成，并逆转Tak1缺陷的表型。Tak1缺失也下调了Notch胞内结构域（NICD），但增加了Jκ位点（RBPJ）转录因子重组识别序列结合蛋白的水平，这与NUMBL通过降解NICD调节Notch信号传导一致，NICD是RBPJ的调节剂。因此，Rbpj的缺失部分纠正了Tak1缺陷小鼠的骨质疏松症。此外，RBPJ/TAK1缺陷细胞中活性IKK2的表达显著恢复了破骨细胞的生成，这表明NF-κB的激活对该途径的完全修复至关重要。因此，我们认为TAK1通过整合NF-κB的激活和通过抑制NUMBL来降低髓系细胞中NOTCH/RBPJ的表达来调节破骨细胞的生成。

关键词：NUMBL；RBPJ；TAK1；破骨细胞；骨质疏松症。

PubMed免责声明

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
Tak1缺陷小鼠表现出骨岩表型。将Tak1-floxed小鼠与溶菌酶-M（LM）cre小鼠杂交，如*材料和方法*小鼠（3-4周龄；n个=每组8个），并对长骨进行组织学处理，并用TRAP染色以显示OC(A类). 显示每个骨骼区域的OC计数(下部). (B)Micro-CT分析。收集骨体积/总体积（BV/TV）、小梁数（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th）和小梁分离（Tb.Sp）参数(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.001).

**图2。**
TAK1的髓样特异性缺失抑制OC祖细胞的分化和信号传导。BMM与TAK1分离^ΔLM和WT小鼠。细胞用M-CSF和RANKL电镀4d，然后固定，TRAP染色并计数(A类). (B)OC基因TRAP、组织蛋白酶K、β3-整合素和MMP9的PCR定量。(C类和D类)TAK1在TAK1中的逆转录病毒表达^∆LM单元格（中的暗条D类代表pMX-GFP，灰色条表示pMX-TAK1）。(E类)WT和TAK1^ΔLM用RANKL刺激30分钟或不治疗。然后裂解细胞，并使用指示的各种抗体进行蛋白质印迹。β-肌动蛋白作为负荷对照。LM，溶菌酶-M(**P（P）*< 0.01, ***P（P）*< 0.001; 图S3）。

**图3。**
NUMBL表达或缺失对破骨细胞生成和骨发育的影响。(A类)WT和TAK1^∆LM用RANKL处理BMM 0、2或4天，裂解，并使用所示抗体进行免疫印迹。(B)WT和TAK1^ΔLM用pMX-GFP、pMX-TAK1和pMX-塔K1K63W转染细胞，并用M-CSF和RANKL涂布4d，然后使用所示抗体进行细胞裂解和免疫印迹。(C类和D类)BMM感染pMx-GFP或pMx-NUMBL并培养用于OC测定。Western blot表示病毒表达的NUMBL与FLAG融合。(E类和F类)OC源自三元组*Tak1/Numb/数字*KO（简称TAK1/N/Nl^ΔLM)与TAK1和Numb/L（N/NL）相比^ΔLM)科威特。(*G公司*和*H（H）*)中描述的对照和空白小鼠的显微CT图像和量化E类(n个=每组6人**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001).

**图4。**
TAK1中增加了NUMBL^ΔLM通过靶向Notch–RBPJ途径抑制破骨细胞生成。(A类)WT和TAK1^∆LM用RANKL处理BMM 0、2和4天，然后裂解并用所示抗体进行免疫印迹。(B)TAK1cKO和TAK1/N/Nl的电池^ΔLM（三重KO）按A类如图所示，对裂解产物进行蛋白质印迹。(C类)用pMx-GFP和pMx-RBPJ转染BMM，然后进行OC培养和TRAP染色。描述了每孔面积OC计数的OC显微定量和RBPJ表达的Western blot。(D类)来自WT和RBPJ的OC^ΔLM(E类)如图所示，BMM接受GSI和RANKL治疗（4天）。然后对细胞裂解物进行NICD、RBPJ和β-肌动蛋白的Western blot。显示NICD/actin和RBPJ/actin的表达率。(F类)用不同浓度的RANKL和GSI处理WT-BMM细胞。描述了OC培养物在不同条件下的显微照片(**P（P）*< 0.01).

**图5。**
删除TAK1中的RBPJ^ΔLM大大拯救了TAK1^ΔLM岩骨表型和NF-κB的同时激活完全恢复OC。(A类–E类)WT、RBPJ的破骨细胞生成^ΔLM，TAK1^ΔLM和TAK1/RBPJ^ΔLM(F类–我)Micro-CT扫描图像和(J–*M（M）*)相应的定量参数骨体积（即BV/TV）、结缔组织密度、小梁数（Tb.N）、小梁厚度（Tb.Th.）和小梁间距（Tb.Sp）。(N个–*S公司*)WT、TAK1cKO和TAK1/RBPJ^ΔLM用pMx-GFP和pMx-SSEE（组成活性IKK2）转染BMM并进行破骨细胞生成。OC显微照片以及TRAP阳性细胞的定量(T型)描述了(**P（P）*< 0.05, ***P（P）*< 0.01, ****P（P）*< 0.001).

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