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公共科学图书馆一号。2008; 3（12）：e4064。
2008年12月29日在线发布。 数字对象标识：10.1371/journal.pone.0004064
预防性维修识别码：PMC2603309型
PMID：19112497

TRAF6对IL-1和RANKL反应中NFκB和MAPK通路的自泛素非依赖性激活

马修·沃尔什, 格雷戈里·金, 保罗·毛里齐奥, 伊丽莎白·莫尔纳,和崔永元（Yongwon Choi）*
德里亚·乌努特马兹，编辑器
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摘要

适配器蛋白TRAF6对于介导IL-1R/TLR和TNFR超家族成员的信号转导至关重要。TRAF6环指结构域作为泛素E3连接酶发挥作用，能够生成非降解的K63连接泛素链。人们认为这些链是形成信号复合物的对接位点，TRAF6的K63连接的自泛素化对于涉及激酶TAK1及其适配器TAB1和TAB2的复合物的形成和激活至关重要。为了独立评估TRAF6的E3连接酶和泛素底物功能，我们分别生成了RING结构域和完全赖氨酸缺失的TRAF6突变体。我们发现，虽然激活TAK1需要TRAF6环结构域，但它对于TRAF6与TAK1-TAB1-TAB2复合物之间的相互作用是不必要的。同样，发现赖氨酸缺陷的TRAF6与TAK1-TAB1-TAB2复合物相互作用，但令人惊讶的是，还发现其完全能够激活TAK1以及NFκB和AP-1报告子。此外，赖氨酸缺乏的TRAF6挽救了IL-1介导的NFκB和MAPK活化，以及逆转录病毒挽救的TRAF6缺乏的成纤维细胞中IL-6的分泌。赖氨酸缺乏的TRAF6也拯救了RANKL介导的NFκB和MAPK活化，以及逆转录病毒拯救的TRAF6缺乏的骨髓巨噬细胞中的破骨细胞生成。虽然自身不能泛素化，但我们证明赖氨酸缺失的TRAF6仍然能够诱导IKKγ/NEMO的泛素化。此外，这种NEMO修饰有助于TRAF6介导的NFκB活化。总之，我们的结果表明，虽然TRAF6的自泛素化可能是激活的标志，但它不太可能支持环指依赖的TRAF6功能。

介绍

近年来，非传统的K63连接泛素化作为信号转导过程中蛋白质支架构建复合物形成的机制受到关注。激活后，HECT或含环指结构域的E3泛素连接酶将这些非降解泛素链粘附到蛋白质底物上，然后作为下游信号传导介质的招募平台[1],[2]由这些支架产生的因子的紧密接近被认为会促进能量低效的构象适应或磷酸化事件[1],[2],[3]一种特别显著的K63特异性环指E3泛素连接酶是TNFR-associated factor 6（TRAF6），从IκB激酶（IKK）激活复合物中分离出来后被鉴定具有这种活性[4],[5]与大多数其他TRAF一样，TRAF6由一个N端环指结构域、一系列锌指、一个线圈结构域和一个C端TRAF结构域组成。TRAF6与其他TRAF的独特之处在于它利用了一种独特的相互作用基序，这种基序存在于其上游激活子中[6]因此，TRAF6参与了多种受体家族代表性成员的信号传导，包括TNF受体超家族（TNFRSF）、IL-1R/TLRSF、TGFβR、IL-17R和IL-25R以及NOD样模式识别受体[7],[8],[9],[10],[11],[12],[13]TRAF6激活导致PI3K、丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联以及转录因子家族NFκB、NFAT和IRF的下游激活[12],[14],[15]大量的生物化学和遗传学研究揭示了TRAF6利用泛素化传播多种信号的机制。迄今为止，最突出的模型认为，通过TRAF6同源异构化激活后，环指泛素E3连接酶结构域与K63特异性E2结合酶（Ubc13/Uev1a，或可能是UbcH7）复合物介导非降解K63连接泛素链与TRAF6底物的连接，特别是TRAF6本身[4],[16]这些链招募因子，如适配器TAB2/3，其包含非典型锌指结构域，对结合K63连接的泛素链具有特殊亲和力[17]作为预形成复合物的一部分，TAB2/3将TAB1和假定的IKK和MKK激酶TAK1带到TRAF6[5]据信，TAK1随后通过复合物形成所产生的近距离接触而可能发生的反磷酸化事件被激活[1],[18]激活TAK1后磷酸化下游因子。然而，研究泛素介导的信号事件所涉及的复杂性使得该模型的某些方面难以正式证明。例如，假定的泛素靶点通常在多个位置都具有K48连锁降解链和K63连锁非降解链的泛素化。另一个复杂因素是泛素化复合物倾向于在给定的修饰位点生成不同长度的链体内这使得传统尺寸分离技术对泛素化的检测具有挑战性。试图通过基因操作蛋白质底物上的赖氨酸受体位点来消除E3连接酶特异的泛素化，可能会导致修饰大大减少，同时无法完全消除碰巧附着在低水平或异型长度上的生理相关泛素链。最后，虽然在在体外泛素化，这些分析的特点是在缺乏替代靶点的情况下，E3连接酶杂合性增加，因此观察到相同的自泛素化事件在体外可能与生理无关体内 [19],[20]因此，我们试图通过遗传学方法研究TRAF6环指泛素E3连接酶活性与TRAF6（auto）之间的关系泛素化（为了清楚起见，我们将TRAF6的所有K63连接泛素化称为自泛素化，同时认识到额外的泛素E3连接酶可能参与TRAF6 K63连接修饰体内)下游信号的招募和激活。我们发现，虽然激活TAK1需要TRAF6环指结构域，但它对于TRAF6与TAK1-TAB1-TAB2复合物之间的相互作用是不可或缺的。令人惊讶的是，我们发现TRAF6自身泛素化对于与TAK1信号复合物的相互作用和激活都是可有可无的。此外，TRAF6自身泛素化，而非环指功能，被发现分别对IL-1或RANKL依赖性IL-6的表达或破骨细胞生成是不必要的。最后，发现TRAF6的自身泛素化不需要TRAF6泛素化替代靶点，特别是IKKγ（NEMO）。

结果

在缺乏功能性TRAF6环指结构域的情况下，TRAF6与TAK1-TAB1-TAB2复合物相关

以前已经证明TRAF6环指功能、K63连接的泛素化和TAB2的泛素结合域是TRAF6介导下游信号通路激活所必需的[17]据信，TRAF6自动泛素化是TAB2的招募点，因此TAB1和TAK1也是如此。如果是这样，我们推断，具有缺陷环指（C70A）的TRAF6突变体的过度表达，因此不能自动泛素化，不应抑制TAK1及其激活物TAB1的共同过度表达诱导的NFκB活化。相反，在NFκB的报告基因测定中，我们发现，尽管野生型TRAF6与TAB1和TAK1联合的过表达比单独的TAB1和TAK1增强了报告基因活性，但环指突变体TRAF6（C70A）的过表达导致活性降低了2倍以上(图1A). 为了评估TRAF6环指功能对与TAK1复合物相互作用的重要性，我们进行了共免疫沉淀分析，发现另一种含有缺陷环指的TRAF6突变体（C85A/H87A）与TAK1的相互作用比野生型TRAF6更强(图1B). 与其他TRAF蛋白一样，TRAF6通过C末端TRAF结构域形成同型和异型相互作用[21]为了排除全长TRAF6环突变体可能通过与内源性TRAF蛋白的相互作用来补偿缺陷复合物形成的可能性，我们生成了TRAF6的C末端被细菌回旋酶B的人工寡聚结构域取代的突变体，我们发现环突变体TRAF6也与TAB2相互作用，或更好(图1C)，表1(图1D)和TAK1(图1E). 鉴于TRAF6的自泛素化需要一个功能性的环指，这些观察结果挑战了TRAF6自泛素与TAK1信号复合物向TRAF6募集之间的假定关系。

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在缺乏功能性TRAF6环指结构域的情况下，TRAF6与TAK1-TAB1-TAB2复合物相关。

（A） 如图所示，用NFκB荧光素酶、40 ng TAB1和TAK1以及400 ng空载体（EV）、TRAF6或TRAF6 C70A转染293T细胞。细胞裂解物通过荧光素酶报告分析进行分析。数值表明比背景增加了倍，并根据β-半乳糖苷酶内部标准进行了标准化。（B） 用等量（1µg）表位标记的TRAF6（FLAG）或TAK1（Myc）表达质粒转染293T细胞，并用抗FLAG琼脂糖进行免疫沉淀（IP）。如图所示，用抗Myc或抗FLAG免疫印迹IP和全细胞提取物（WCE）。（C） 如图所示，用WT或C70A FLAG-TRAF6（1-358）-Gyrase B转染（D）、（E）293T细胞，再加上等量的Myc-tagged TAB2（C）、TAB1（D）或TAK1（E）。细胞裂解物按（B）进行处理和分析。

赖氨酸缺失的TRAF6 N-末端-草甘膦酶B融合蛋白与TAK1相互作用并激活TAK1，诱导NFκB和AP-1报告活性

与许多E3泛素连接酶一样，TRAF6具有自身泛素化的能力在体外 [4], (图S1). 从双重观察中推断出TRAF6自泛素化的生理相关性：1）检测到TRAF6的自泛素体内TRAF6依赖性受体的参与，以及2）TRAF6环指是传播下游信号转导所必需的。最近的工作是绘制TRAF6上的赖氨酸残基在在体外自动泛素化[22]然而，尚不清楚TRAF6是否或以何种模式与其他K63特异性E3泛素连接酶结合以泛素化TRAF6体内因此，我们试图将TRAF6的环指功能与其作为泛素化底物的能力分离开来。我们采用了一种针对单个赖氨酸残基的突变方法，该赖氨酸残留物与泛素的羧基末端甘氨酸76形成异肽键，以消除TRAF6的自泛素化体内过度表达。然而，我们只能实现泛素化的部分减少，这可能是由于TRAF6在多个位点上的修饰所致。因此，我们可以将重点放在N末端，因为它在与回转酶B融合时能够激活下游信号，因此我们同时突变了全长和（1-358）-回转酶B的所有N末端TRAF6赖氨酸残基（K32-348）(图2A). 我们测试了全长TRAF6（K32-348R）突变体在在体外泛素化分析发现，TRAF6的K63特异性修饰被降低到与TRAF6环指突变体（C70A）相似的水平(图2B). 通过利用TRAF6（1-358）-回旋酶B突变体（ΔK）评估293T细胞中与TAK1的相互作用，我们发现ΔK与TAK1的相互作用比野生型TRAF6强，但比C70A弱(图2C)，证明了TRAF6自身泛素化对于与TAK1形成复合物的可有可无性。在IL-1信号通路中，TAK1介导的JNK和NFκB的最佳激活需要TAK1在T187的磷酸化(图S2). 为了评估TRAF6突变体激活TAK1的能力，我们转染了低水平的TRAF6（1-358）-回旋酶B突变体，并使用药物Coumermycin A1诱导寡聚。虽然所有TRAF6结构体在没有药物的情况下都表现出与TAK1的相互作用，并且只有RING突变体在药物存在的情况下未能激活TAK1，但与野生型TRAF6相比，即使在没有药物治疗的情况下，ΔK突变体也表现出TAK1激活增强(图2D)提示TRAF6的自泛素化可能对TAK1介导的信号的激活是不必要的。然后，在报告人检测中测试了各种TRAF6-Gyrase B突变体的NFκB和AP-1，并与其激活TAK1的明显增强能力相一致，ΔK突变体诱导了NF-κB(图2E)和AP-1(图2F)报告子水平高于野生型TRAF6。

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赖氨酸缺失的TRAF6 N-末端-聚合酶B融合蛋白与TAK1相互作用并激活TAK1，诱导NFκB和AP-1报告活性。

（A） 在环指、锌指和线圈线圈域（TRAF6 K32-348R）（顶部）或环指、锌指和线圈圈域中产生含有赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变的鼠TRAF6突变版本，但TRAF6-C域替换为回旋酶B人工寡聚化域（TRAF 6（1-358）ΔK-回转体B）（底部）。（B） 将显示的全长版本的FLAG-TRAF6转染293T细胞，然后用FLAG免疫沉淀裂解产物，并用在体外使用重组WT、仅K48或仅K63泛素，在有或无ATP的情况下泛素化。用抗TRAF6免疫印迹法检测未修饰和修饰的TRAF6。（C） 将等量（1µg）表位标记的TAK1（Myc）与野生型（WT）、环突变体（C70A）或赖氨酸缺陷型（ΔK）TRAF6（1-358）-回旋酶B（FLAG）表达质粒联合转染293T细胞，并用抗FLAG琼脂糖进行免疫沉淀（IP）。如图所示，用抗Myc或抗FLAG免疫印迹IP和全细胞提取物（WCE）。（D） 将10 ng TAK1与野生型（WT）、环突变体（C70A）或赖氨酸缺陷型（ΔK）TRAF6（1-358）-回旋酶B（FLAG）表达质粒联合转染293T细胞，在收获前未经处理或用Coumermycin A处理5分钟，然后用抗FLAG琼脂糖IP处理。IP和全细胞提取物（WCE）用所示的抗磷酸TAK1（T187）、抗TAK1或抗FLAG进行免疫印迹。（E） 如图所示，用NFκB-荧光素酶（E）或AP-1-荧光素酶（F）加WT、C70A或K32-348R TRAF6（1-358）-回旋酶B转染（F）293T细胞。细胞裂解物通过荧光素酶报告分析进行分析。数值表明比背景增加了倍，并根据β-半乳糖苷酶内部标准进行了标准化。

赖氨酸缺陷突变体TRAF6在TRAF6缺陷的成纤维细胞中拯救IL-1介导的NFκB和MAPK活化以及IL-6的产生

为了评估生理受体信号传导过程中TRAF6自身泛素化的需求，我们用FLAG标记的野生型、环指突变型（C70A）或总赖氨酸缺乏型（K32-518R）TRAF6逆转录再培养TRAF6缺陷的成纤维细胞系(图3A). 对这些蛋白进行抗-FLAG免疫沉淀，然后进行在体外泛素化试验不仅证明C70A和K32-518R都不能自动泛素化，而且证明两者的混合物在反式(图3B)表明TRAF6寡聚化对E3连接酶活性的重要性。TRAF6缺陷的成纤维细胞中IL-1R信号传导完全缺陷。体内在表达野生型TRAF6的成纤维细胞系中检测到了对IL-1的反应，而在表达TRAF6基因的C70A或K32-518R版本中未检测到治疗(图3C)尽管如此体内TRAF6 K32-518R的表达水平始终低于野生型TRAF6。无论如何，TRAF6 K32-518R能够以类似于野生型TRAF6的方式激活激酶TAK1和IKK以响应IL-1(图3D). 在TRAF6 K32-518R挽救的细胞中，MAPKs JNK和p38的IL-1依赖性激活以及NFκB抑制剂IκBα的磷酸化和降解也正常(图3E). 虽然在没有TRAF6自身泛素化的情况下这些关键下游信号通路的激活似乎正常，但TRAF6介导的基因调控涉及多个转录因子家族的复杂协调，因此TRAF6 K32-518R的基因调控可能存在缺陷。为了解决这种可能性，我们检测了逆转录病毒再培养的成纤维细胞对IL-1治疗的反应中炎症细胞因子IL-6的表达，发现虽然TRAF6 C70A不能诱导IL-6的产生，但TRAF6 K32-518R挽救的细胞产生的IL-6水平略高于野生型TRAF6挽救的细胞(图3F).

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赖氨酸缺陷突变体TRAF6可在TRAF6缺陷的成纤维细胞中拯救IL-1介导的NFκB和MAPK活化以及IL-6的产生。

（A） 在所有赖氨酸残基（称为TRAF6 K32-518R或TRAF6ΔK）处产生了一个含有赖氨酸（K）到精氨酸（R）突变的全长TRAF6的突变版本，并且突变与TRAF6结构域位置有关。（B） TRAF6缺陷的成纤维细胞用指定的全长版本的FLAG-TRAF6逆转录病毒拯救，然后用FLAG免疫沉淀裂解物，并进行在体外在有或无ATP的情况下，使用重组K63泛素进行泛素化。最后两个通道代表免疫沉淀前混合1∶1的C70A和K32-518R裂解物，以评估TRAF6单体的转泛素化潜力。用抗TRAF6免疫印迹法检测未修饰和修饰的TRAF6。（C） 用IL-1β处理（B）中使用的细胞株5分钟，然后在N-乙基马来酰亚胺（NEM）存在下裂解，并用抗TRAF6进行免疫印迹，以检测未修饰和高分子量形式的TRAF6。（D） ，（E）TRAF6缺陷的成纤维细胞与指定的全长版本的FLAG-TRAF6逆转录病毒再融合后，按照IL-1β的指示进行处理，然后进行裂解，并对活化的磷酸化形式的TAK1（D）、IKKα/β（D）IκBα（E）、JNK（E）和p38（E）进行免疫印迹。（F） TRAF6缺陷的成纤维细胞用指定的全长版本的FLAG-TRAF6逆转录病毒复性后，未经治疗或用IL-1β治疗12小时。收集上清液并通过ELISA测定IL-6的产生。将数值标准化为细胞培养板的结晶紫测定。

赖氨酸缺陷突变体TRAF6可挽救RANKL介导的NFκB和MAPK活化，以及TRAF6缺陷BMM的破骨细胞生成

除了通过与IRAK的相互作用介导IL-1R/TLRSF信号外，TRAF6还通过直接受体结合传播TNFRSF信号。为了研究TRAF6自泛素化在TNFRSF信号传导中的作用，我们生成了表达TRAF6 K32-518R的TRAF6缺陷骨髓巨噬细胞，并用TNFSF成员RANKL进行治疗。我们再次发现赖氨酸缺乏的TRAF6能够激活NFκB、JNK和p38通路(图4A)尽管蛋白质表达显著减少。RANKL处理在体外足以使BMM以TRAF6依赖的方式发展为破骨细胞[23]我们发现，用K32-518R而非C70A挽救TRAF6缺陷的BMM，其破骨能力与野生型再灌注BMM相似(图4B). 通过测定破骨细胞标志物酒石酸抗性酸性磷酸酶（TRAP）的表达，定量证实了这一观察结果(图4C)和大型多核细胞总数(图4D). 这些数据证实，在没有TRAF6自身泛素化的情况下，TRAF6可以介导复杂的生物过程。

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赖氨酸缺陷突变体TRAF6可挽救RANKL介导的NFκB和MAPK活化，以及TRAF6缺陷BMM中的破骨细胞生成。

（A） 用野生型（WT）、环突变体（C70A）或赖氨酸缺陷型（ΔK）全长FLAG-TRAF6的野生型或TRAF6缺陷型骨髓巨噬细胞（BMM）逆转录病毒再悬浮，按照RANKL的指示进行处理，然后进行裂解，并对IκBα、JNK和p38的活化磷酸化形式进行免疫印迹。B类将（A）中所述的BMM进行再植，并与M-CSF和RANKL培养5天，以诱导破骨细胞分化。（C） 固定（B）中描述的破骨细胞，并进行TRAP溶液分析，并在405nm吸光度下定量。（D） （B）中描述的每孔逆转录病毒再切割破骨细胞的总细胞数，定义为含有至少3个细胞核且直径至少为100µM的细胞。

赖氨酸缺陷型TRAF6 N-末端-草糖酶B融合蛋白能够介导NEMO的TRAF6特异性泛素修饰

大量证据表明K63连锁泛素化在促进TRAF6介导的信号转导中的一般作用，虽然TRAF6环指结构域是必需的，但TRAF6自身泛素化的可有可无打开了这样一种可能性，即环结构域的关键功能与泛素E3连接酶活性无关。因此，我们试图确定一个独立于TRAF6自身泛素化发生的TRAF6环介导的泛素化的例子。IKKγ是IKK调节成分，也称为NEMO，在TRAF6依赖的IL-1R/TLRSF刺激下泛素化[7]，并已被证明是TRAF6 E3连接酶活性的K63连接靶点在体外泛素化测定[22]与这些观察结果一致，我们发现在使用IL-1治疗后，来自野生型而非TRAF6缺陷的成纤维细胞的NEMO免疫沉淀被泛素化(图5A). 为了确定NEMO修饰的特异性，我们将NEMO与TRAF6或各种TRAF6相关因子（TRAF2、TRAF5、组成活性IKKβ（IKK？EE）、TAK1/TAB1、MEKK3、ASK1）共转染，已知其作用于TRAF6依赖信号通路的下游或平行[24],[25],[26],[27],[28]我们发现，尽管这些不同的因子与NFκB报告子的激活有关，但只有TRAF6的共同表达诱导了NEMO的这种独特的修饰(图5B). 在明确了TRAF6诱导的NEMO修饰后，我们试图确定它是否需要TRAF6环指结构域或TRAF6的泛素化。使用NEMO与含有RING（C70A）或总赖氨酸（ΔK）突变的TRAF6（1-358）-回旋酶B融合构建物的共表达，我们发现虽然NEMO修饰需要RING指，但TRAF6的自泛素化是不必要的。为了确认所鉴定的修饰事实上是泛素化，我们从制备凝胶中切除了修饰带，并对其进行了纳米LC-MS/MS质谱分析，并在NEMO K285中鉴定出与泛素化一致的m/z特征(图5D)，这与以前的报告一致[7],[29]我们产生了一个NEMO K285R突变株，并比较了在赖氨酸285存在或不存在的情况下TRAF6介导的NEMO修饰。证实TRAF6在泛素化NEMO中的可能作用独立于TRAF6自身泛素化，我们发现野生型TRAF6或TRAF6ΔK与NEMO K285R的共同表达导致野生型NEMO上观察到的TRAF6依赖性修饰完全消失(图5E).

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赖氨酸缺失的TRAF6 N-末端-草酸酶B融合蛋白仍然能够介导NEMO的TRAF6-特异性泛素修饰。

（A） 用IL-1β刺激野生型（WT）和TRAF6缺陷型（KO）成纤维细胞5分钟，然后用含有NEM的缓冲液溶解。确定体内泛素化、裂解物在用抗NEMO免疫沉淀之前被解离和变性。用抗泛素对WCE和IP提取物进行免疫印迹。（B） 用等量（1µg）的Myc-tagged NEMO和TRAF6、TRAF2、TRAF5、组成活性IKKβ（IKK？EE）、TAB1和TAK1、MEKK3或ASK1的表达质粒转染293T细胞。在磷酸酶抑制剂和NEM存在下裂解细胞，然后用抗NEMO免疫印迹WCE以检测NEMO的修饰。（C） 用等量（1µg）的Myc-tagged NEMO和野生型、RING突变型（C70A）或赖氨酸缺陷型FLAG-TRAF6（1-358）-回旋酶B的表达质粒转染293T细胞。在磷酸酶抑制剂和NEM存在的情况下溶解细胞，然后用抗NEMO免疫印迹WCE以检测NEMO的修饰。（D） 用10µg Myc-NEMO转染293T细胞，并用野生型或C70A TRAF6（1-358）-回旋酶B（10µc）联合转染。将这些板和未转染的板用抗Myc琼脂糖进行裂解和免疫沉淀。IP提取物在非还原性SDS-PAGE缓冲液中通过加热（65°C）从抗Myc琼脂糖中分离，并通过离心从琼脂糖分离。将还原剂添加到IP提取物中，每种提取物的10%用于抗Myc的免疫印迹，以确认NEMO修饰的存在（未显示），而90%在制备凝胶上运行，并用胶体考马斯蓝染色（未示出）。切除与野生型共转染但未与C70A TRAF6（1-358）-回旋酶B共转染的lane中发现的NEMO修饰带，用胰蛋白酶消化，并用质谱分析。描述了NEMO肽QEVIDKLKEEAEQHK的m/z分布，除包含赖氨酸285的片段外，所有检测到的离子都给出了预测值7和y8残渣质量为242.2。该特征与一个赖氨酸和两个甘氨酸一致，表明NEMO K285的泛素修饰。（E） 将等量（1µg）的Myc标记野生型或K285R NEMO与野生型、RING突变型（C70A）或赖氨酸缺陷型FLAG-TRAF6（1-358）-回旋酶B的表达质粒联合转染293T细胞，然后用抗NEMO免疫印迹法检测WCE对NEMO的修饰。

TRAF6相关的NEMO泛素化是IL-1介导的NFκB最佳激活所必需的

TRAF6环指依赖信号中缺乏对TRAF6自身泛素化的要求，这表明TRAF6 E3连接酶活性的替代生理靶点必须存在。为了证实TRAF6介导的NEMO泛素化与生理性NFκB活化的相关性，我们用野生型或K285R NEMO逆转录拯救NEMO缺陷的成纤维细胞，并用IL-1治疗。我们发现，尽管TAK1激活正常，IκBα磷酸化接近正常，但IKKα/β的激活显著减少，Iκ）Bα的降解略有减少(图6A). 为了确定这些信号缺陷是否影响NFκB依赖性细胞因子的产生，我们检测了IL-1处理的成纤维细胞上清液中IL-6的产生，发现与野生型NEMO相比，K285R解救的成纤维纤维细胞减少了50%以上。这些观察结果不仅表明TRAF6介导的NEMO泛素化与生理相关，而且TRAF6依赖的信号传导可能涉及TRAF6 E3连接酶活性的靶点，而不仅仅是TRAF6本身。

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TRAF6泛素化NEMO是IL-1介导NFκB活化的部分必要条件。

（A） 用野生型或K285R NEMO逆转录病毒复性的NEMO缺陷成纤维细胞按照IL-1β的指示进行处理，然后进行裂解，并对活化的磷酸化形式的TAK1、IKKα/β和IκBα进行免疫印迹。（B） 用WT或K285R NEMO逆转录复性的NEMO缺陷成纤维细胞未经治疗或用IL-1β治疗12小时。收集上清液并通过ELISA检测其IL-6生成。数值标准化为细胞培养板的结晶紫分析。

讨论

TRAF6的非传统环指E3连接酶活性对激活关键炎症和发育途径IL-1R和RANK的下游信号至关重要。TRAF6自身泛素化通常被用作环指活动的激活标记，目前认为TRAF6上的K63连接泛素链是下游介质（如TAK1）的对接平台[1]在这种情况下，TRAF6自身泛素化的要求尚未得到正式证明。我们试图通过将TRAF6的环指功能与其泛素底物功能分离来实现这一目的。令人惊讶的是，我们发现在缺乏TRAF6自身泛素化的情况下，IL-1和RANKL依赖性信号传导在存在功能性环指结构域的情况下保持完整。逆转录病毒释放的TRAF6缺陷的成纤维细胞产生IL-6以响应IL-1，逆转录病毒携带的TRAF6-缺陷的BMM在RANKL的作用下发展为破骨细胞，两者均独立于TRAF6自身泛素化。TRAF6的自泛素化也被发现是NEMO的TRAF6环依赖性泛素化所必需的。此外，我们发现TRAF6与TAK1复合物的相互作用既不需要TRAF6的自泛素化，也不需要环指结构域。

我们最初对TRAF6上特异性泛素受体赖氨酸的鉴定表明，虽然在某些情况下我们可以检测到TRAF6自身泛素化的降低，但这些降低并不伴随着TRAF6功能的降低。即使是TRAF6 K124也是如此，最近发现的受体位点同时对TRAF6的自泛素化和信号传导至关重要[22], (图S3). 通过采取戏剧性的步骤，将TRAF6上的所有赖氨酸突变为精氨酸，以清除所有潜在的受体位点，我们不得不承认某些警告。首先，一些残基可能对蛋白质的稳定性很重要。虽然赖氨酸消融不影响N-末端TRAF6ΔK（1-358）的表达，但全长ΔK蛋白的表达显著降低。无论如何，蛋白质稳定性的任何损失都不足以影响所检测的信号功能。其次，我们可能无意中取消了TRAF6进行其他赖氨酸依赖性修饰的能力，例如乙酰化、甲基化、sumoylation或K48键降解泛素化。已发表的数据表明，TRAF6通过干扰素γ诱导的K48连锁泛素化和蛋白酶体降解的负调控机制[30]我们观察到TRAF6 N末端的赖氨酸消融(图2)导致NFκB和AP-1活性增加可能表明干扰了类似类型的负调控。需要更多的努力来全面描述这种突变模式对TRAF6蛋白稳定性和周转的影响。

累积起来，我们关于TRAF6自身泛素化的遗传可有性的研究结果导致我们对TRAF6介导的NFκB和MAPK通路激活的模型进行了修正(图7). 受体结合后，K63连接的泛素链被粘附到TRAF6上，至少部分通过TRAF6环指结构域的E3泛素连接酶活性。TRAF6自动泛素化和TRAF6环指结构域对于TAB1-TAB2-TAK1复合物的招募似乎是不必要的。以前的报道表明，这种相互作用依赖于TAB2泛素结合域与K63连接的泛素链的连接能力[17]，提示一个未知因子“X”，它独立于自身泛素化与TRAF6相互作用，可能是TAB2的结合伙伴。同时，TAK1到TRAF6的招募不足以激活TAK1，这特别需要TRAF6环指活动。另一未知因子“Y”可能被指示为TRAF6介导的K63连锁泛素化的底物。在泛素化后，因子“Y”将促进TAK1磷酸化，导致MAPK和IKKα/β活化。TRAF6介导的IKKα/β复合物激活仅部分依赖于TAK1[31]，但对调节成分IKKγ（NEMO）有绝对要求[32],[33].NEMO通过TRAF6在K285上泛素化是IKKα/β最佳活化所必需的。TRAF6对TAK1和IKKα/β的环指依赖性激活可能涉及许多靶点的K63连接泛素化，这些靶点共同形成足以满足激活阈值的信号复合物。

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在没有TRAF6自身泛素化的情况下，MAPK和IKK信号通路的TRAF6依赖性激活的修正模型。

受体结合后，K63连接的泛素链被粘附到TRAF6上，至少部分通过TRAF6环指结构域的E3泛素连接酶活性。TRAF6自动泛素化和TRAF6环指结构域对于TAB1-TAB2-TAK1复合物的招募似乎是不必要的。以前的报道表明，这种相互作用依赖于TAB2泛素结合域与K63连接的泛素链的连接能力[17]，提示一个未知因子“X”，它独立于自身泛素化与TRAF6相互作用，可能是TAB2的结合伙伴。同时，TAK1到TRAF6的招募不足以激活TAK1，这特别需要TRAF6环指活动。另一未知因子“Y”可能被指示为TRAF6介导的K63连锁泛素化的底物。在泛素化后，因子“Y”将促进TAK1磷酸化，导致MAPK和IKKα/β活化。TRAF6介导的IKKα/β复合物激活仅部分依赖于TAK1[31]，但对调节成分IKKγ（NEMO）有绝对要求[32],[33]TRAF6对K285的NEMO泛素化是IKKα/β最佳激活所必需的。TRAF6对TAK1和IKKα/β的环指依赖性激活可能涉及许多靶点的K63连接泛素化，这些靶点共同形成足以满足激活阈值的信号复合物。事实上，在缺乏替代泛素底物的情况下，或在缺乏强健冗余的尚未测试的信号系统中，可能需要TRAF6自动泛素化。该示意图强调了一点，即与TRAF6环指E3连接酶活性在介导下游信号传导中的绝对要求相反，TRAF6的K63连接泛素化应被视为激活标记。

各研究小组最近的研究已确定TRAF6 E3泛素连接酶活性的其他靶点，包括TLRs 7-9和LMP1下游的IRF-7[34],[35]TLR7和9下游的IRF-5[36]、NRIF、TrkA和TrkB，与NGFR相关[16],[37],[38]，以及节点下游的RIP2和NEMO[7],[39]有趣的是，在IL-1R通路中，最近已经证明，通过TRAF6相互作用基序与TRAF6相互作用的IRAK-1被K63连接的泛素化以TRAF6环指依赖的方式修饰[40],[41]此外，已经证明NEMO包含一个K63特异性泛素结合域，该域是IL-1介导的IKK激活所必需的，它介导与泛素化IRAK-1的相互作用，但不介导泛素化TRAF6[40],[41]。在这方面检查我们的数据表明，IRAK-1和TRAF6泛素化可能是多余的，或者通过TAB2/3泛素结合招募TAK1可能是通过IRAK-1泛素化（和/或上面列出的替代TRAF6靶点之一）而非TRAF6介导的。事实上，在缺乏替代泛素底物的情况下，或在缺乏稳健冗余的其他信号系统中，可能需要TRAF6自动泛素化。多个TRAF6相关支架系统之间的串扰，特别是IL-1R/TLR通路中的TRAF6-IRAK-NEMO和非典型PKC通路中的RAF6-p62[42]也可能产生冗余，从而避免TRAF6的自动泛素化。此外，虽然我们在这里关注的是TRAF6介导的TAK1通路的激活，但应该注意到，激酶MEKK3控制着一个替代的TRAF6依赖的信号通路，而TRAF6自身泛素化的作用尚不清楚[25]。

在本研究中，我们对TRAF6所服务的不断扩大的信号通路阵列进行了有限的调查。评估TRAF6自身泛素化的生理作用可能需要对TLR、NLR、其他TNFRSF成员、TGFβR、IL-17R和IL-25R等发出的信号进行细胞型特异性检查。然而，我们的数据表明，TRAF6的自泛素化对TRAF6在两个关键信号通路中的功能显然是不必要的，并且表明TRAF6介导的K63连锁泛素化在激活期间靶向多个相关蛋白底物。希望这些发现将有助于明确TRAF6功能的机制，并通常有助于阐明非传统泛素化在信号转导中的作用。

材料和方法

细胞系、试剂和抗体

HEK293细胞购自美国典型培养物保藏中心（ATCC）。Plat-E逆转录病毒包装细胞系、NEMO缺陷成纤维细胞和TAK1缺陷成细胞分别由T.Kitamura（东京大学）、Michael Karin（圣地亚哥加州大学圣地亚哥分校）和Sankar Ghosh（耶鲁大学）提供。TRAF6缺陷的成纤维细胞来源于E14.5胎儿的肺或腹膜组织。IL-1α和IL-1β购自R&D Systems（明尼阿波利斯，明尼苏达州）。可溶性RANKL从昆虫细胞中纯化，M-CSF由David Fremont（密苏里州圣路易斯华盛顿大学）善意提供。TRAP溶液底物和Coumermycin A购自Sigma（密苏里州圣路易斯）。FLAG（M2和M5）和Myc（9E12）的特异性抗体来自Sigma（密苏里州圣路易斯）；对于磷酸化TAK1（T187），磷酸化p38、磷酸化IκBα、磷酸化IKKα/β、IκBα、p38、JNK、TAK1、IKK和NEMO来自Cell Signaling（Danvers，MA）；TRAF6来自MBL（日本东京）；磷酸JNK来自BD Biosciences（新泽西州富兰克林湖）；Ubiquitin来自Millipore（马萨诸塞州Billerica）。

质粒

小鼠TRAF2、TRAF5和TRAF6被克隆到CMV2-pFLAG（西格玛；密苏里州圣路易斯）的NotI和BamHI位点。Gyrase B-EF由Jun-ichiro Inoue（东京大学）提供。通过将Gyrase B克隆到TRAF6（1-358）和BamHI位点下游的EcoRI位点，并与之框架内，构建TRAF6 N端Gyrase-B融合构建物。使用Stratagene（La Jolla，CA）Quick Change定点突变试剂盒通过PCR产生各种TRAF6和NEMO点突变。使用小鼠脾脏cDNA通过PCR将TAK1、TAB1、TAB2和MEKK3克隆到使用Zero Blunt Topo的pcr2.1中，并将其亚克隆到pcDNA3.1-MycHis（Invitrogen；Carlsbad，CA）中。FLAG-NEMO和FLAG-IKKβEE由Michael May（宾夕法尼亚大学）提供。FLAG-ASK1由Eui-Ju Choi（韩国大学）提供。

细胞培养、转染和逆转录病毒转导

5×106293T和plat-E细胞在补充有10%FBS、青霉素/链霉素（均购自Invitrogen；Carlsbad，CA）的DMEM中在10 cm组织培养处理的培养皿中培养。用15µL Superfect（荷兰Qiagen；Venlo）和DNA鸡尾酒转染细胞2小时，然后用新鲜培养基清洗，再培养36小时，然后采集细胞或上清液。转染36小时后收集逆转录病毒上清液，将其与新鲜培养基混合1∶1，并添加到细胞中，以用5µg/mL聚brene（Sigma；St.Louis，MO）转导6小时。转导后24小时，感染细胞被替换到含有2µg/mL嘌呤霉素的新鲜培养基中，进行2天的筛选。

免疫沉淀和Western印迹

用冰镇PBS收集细胞，刮取、造粒并用1mL裂解缓冲液（20 mM HEPES缓冲液pH 7.5，150 mM NaCl，10%（w/v）甘油，蛋白酶抑制剂鸡尾酒（罗氏；瑞士巴塞尔），2 mM原钒酸钠，2 mM-NaF，100 ng/mL Calyculin A（Cell Signaling；丹弗斯，MA），1.25 mg/mL N-乙基马来酰亚胺（西格玛；圣。Louis，MO））与1.0%（w/v）Triton-×100或0.5%NP-40（用于免疫沉淀）混合。将裂解物在冰上孵育20分钟，并通过以20000×g离心10分钟来澄清。将全细胞提取物等分，添加到6×SDS负载缓冲液中并煮沸。的摘录体内泛素化分析首先用10%十二烷基硫酸钠煮沸10分钟，然后用裂解缓冲液稀释10倍。否则，将IP提取物转移到50µL抗FLAG或抗Myc琼脂糖（西格玛，圣路易斯，密苏里州）中，并在4°C下摇晃培养3小时。IP琼脂糖珠用裂解缓冲液洗涤3倍，再悬浮在SDS加载缓冲液中并煮沸。样品在10%SDS-PAGE上运行，并转移到PVDF膜（Millipore；Billerica，MA）。用含0.1%吐温-20的PBS中溶解的5%牛奶中的一级抗体检测斑点，然后用二级抗兔HRP或抗鼠HRP（普罗米加；威斯康星州麦迪逊）检测斑点。Western blot与ECL底物（Pierce；Rockford，IL）孵育并暴露于薄膜中。

体外试验泛化

使用含有300 mM HEPES的缓冲液，在pH 7.2、50 mM MgCl的条件下，在30µL反应中进行检测2和2 mM二硫苏糖醇。其他成分包括0.15微克重组兔E1激活酶（Boston Biochem）和0.6微克重组小鼠Ubc13/Uev1a结合复合物（Boston-Biochen）。如图所示，添加2.5µg重组泛素（Boston Biochem），其中包含所有赖氨酸、仅K48或仅K63。如图所示，添加20 mM ATP。泛素E3连接酶/底物被制备为50µL IP细胞裂解物，其中含有指示版本的FLAG-tagged TRAF6，从中向2×反应鸡尾酒中添加15µL。反应在30°C下以450 rpm摇晃培养1小时，然后仅用缓冲液清洗3×，以从含有TRAF6底物的IP珠中分离未合并成分。

破骨细胞培养

从嵌合体小鼠的股骨和胫骨中提取骨髓干细胞，这些嵌合体小鼠用从野生型或TRAF6缺陷E14.5胎儿中获取的肝细胞重建，并与M-CSF（30 ng/ml）在含有10%胎牛血清的α-最小必需培养基（α-MEM）中培养5天。在第2天用逆转录病毒转导附着细胞，并在第3天用嘌呤霉素（2µg/mL）替换48小时。在第5天将选定的骨髓巨噬细胞（BMM）移植到96个钢板（2×10）中4/well）用新鲜培养基补充M-CSF（30 ng/ml）和RANKL（100 ng/ml）4天（培养基和细胞因子在2天后刷新）以诱导破骨细胞生成。对于TRAP溶液分析，细胞用10%福尔马林固定，用甲醇/丙酮（1∶1）渗透，干燥，然后在室温下用TRAP底物溶液培养30分钟。将底物溶液2∶1与1N NaOH混合，并通过405nm吸光度定量。破骨细胞计数通过计数直径大于100µm且每个孔中有三个以上细胞核的TRAP+细胞来确定。

报告人分析

将HEK293细胞分为三份，分别用测试质粒、50 ng荧光素酶报告质粒和10 ngβ-半乳糖苷酶控制质粒转染到6孔板中。收集细胞并用Tropix裂解缓冲液（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行裂解。在通过离心澄清之前，将裂解液冻融3倍。将15µL裂解液与Tropix底物混合30分钟，添加到100µL Tropix加速器中，并以比色法测定β-半乳糖苷酶。将15µL裂解物与100 mL萤光素酶底物（Promega；威斯康星州麦迪逊市）混合，并用比色法测定报告活性。报告者活性标准化为β-半乳糖苷酶水平。

质谱法

凝胶条带中的蛋白质用改性胰蛋白酶消化，肽用微流反相-HPLC/MS/MS、ThermoFinnigan LCQ Deca XP LTQ-OrbitrapXL质谱仪和纳米毛细管HPLC在正离子模式下以250 nl/min的流速和75µm（ID）×15µm×5 cm C18柱进行分析。SEQUEST（ThermoFinnigan，San Jose，CA）软件用于识别NEMO修饰的赖氨酸残基对应泛素修饰的所有MS/MS数据（GG，114.1 Da）。

支持信息

图S1

TRAF6的体外自泛素化是环指依赖性的。用FLAG-TRAF6或FLAG-TRAF 6 C85A/H87A转染293T细胞，用FLAG免疫沉淀，并用生物素化重组泛素在有或无ATP的情况下进行体外泛素化的裂解物。用抗TRAF6免疫印迹法检测未修饰TRAF6，用链霉亲和素-辣根过氧化物酶（SA-HRP）检测多泛素化。

（63百万桶/立方英尺）

图S2

TAK1 T187是最佳IL-1依赖性NFκB和MAPK信号传导所必需的。TAK1缺陷的成纤维细胞用空载体逆转录病毒再纯化，野生型TAK1或TAK1 T187A按照IL-1β的指示进行处理，然后裂解并对活化的磷酸化形式IκBα和JNK进行免疫印迹。

（1.05 MB畅通节能法）

图S3

TRAF6 K124不是IL-1依赖性NFκB和MAPK信号传导所必需的。TRAF6缺陷的成纤维细胞用指定的全长版本的TRAF6逆转录病毒再培养，包括K124处含有单个赖氨酸到精氨酸突变的成纤维纤维细胞，并用IL-1β处理，然后裂解并进行免疫印迹，以对抗活化的磷酸化形式的IκBα或JNK。

（1.13 MB畅通节能法）

致谢

我们感谢C.Yuan在质谱分析方面的协助，感谢S.Hou的技术协助，感谢H.Jang和P.Cejas的有益讨论。

脚注

竞争利益：提交人声明，不存在相互竞争的利益。

基金：这项工作得到了5R01AI044264-10（Y.C.）拨款的支持。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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文章来自PLOS ONE系列由以下人员提供多环芳烃