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.2010年7月16日；285(29):22576-91.
doi:10.1074/jbc。M110.118976。 Epub 2010年5月7日。

p62/SQSTM1是转录因子NRF2的靶基因，通过诱导抗氧化反应元件驱动的基因转录，形成正反馈回路

杰恩先生 1, 特隆·拉马克, 伊娃·斯约特姆, 肯尼思·鲍维茨·拉森, Jane Atesoh啊, AudØvervatn公司, 迈克尔·麦克马洪, 约翰·海耶斯, 泰耶·约翰森
附属公司

p62/SQSTM1是转录因子NRF2的靶基因，通过诱导抗氧化反应元件驱动的基因转录，形成正反馈回路

杰恩先生等。 生物化学杂志. .

摘要

p62/SQSTM1（固碳体1）蛋白作为一种货物受体，对泛素化靶点进行自噬降解，并受到各种应激源的上调。氧化应激诱导p62基因由NF-E2-相关因子2（NRF2）介导，同时，p62蛋白有助于NRF2的激活，但迄今为止所涉及的机制尚不清楚。在此，我们在p62启动子中定位了一个抗氧化反应元件（ARE），该元件负责通过NRF2通过氧化应激诱导其表达。染色质免疫沉淀和凝胶迁移率测定证实NRF2在体内和体外与该顺式元素结合。此外，p62通过一个指定KEAP1相互作用区（KIR）的基序直接停靠在类Kelch ECH-associated protein 1（KEAP1）的Kelch-repeat结构域上，从而阻断KEAP1和NRF2之间的结合，导致转录因子的泛素化和降解。p62中的KIR基序位于LC3相互作用区（LIR）的C端，类似于NRF2利用ETGE基序与KEAP1相互作用。p62需要KIR来稳定NRF2，p62对KEAP1的抑制发生在细胞内的细胞质位置。LC3和KEAP1不能同时参与LIR和KIR基序，但由于p62是聚合物，KEAP1和p62之间的相互作用导致KEAP1在p62体内积累，随后KEAP1自噬降解。我们的数据解释了p62如何通过创建正反馈回路来促进NRF2靶基因的激活，以响应氧化应激。

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数字

图1。
图1。
NRF2结合位点在第62页启动子/增强子。 A类和B类，报告基因分析使用野生型（−1781/+46）或指示的缺失或突变第62页启动子/增强子结构。HEK293细胞与一个空载体（pcDNA3.1）（100 ng）或编码小鼠Nrf2的质粒（pcDNA1-V5-mNrf2）（100 nm）以及第62页启动子构建体（60ng）。转染24小时后收集细胞。相对启动子活性表示为测定的荧光素酶和β-半乳糖苷酶活性之间的比率。所示数据是在一个实验中获得的平均活性，一式三份，代表三个或更多个独立实验。对于每个第62页启动子结构，NRF2介导的折叠激活如右图所示。C类，与野生型或突变的p62启动子结构共同转染的HEK293细胞分析如下A类用萝卜硫烷处理细胞20小时(南部, 15 μ米)或N个-乙酰半胱氨酸(NAC公司，5米米)如图所示。野生型启动子的相对活性设置为1。给出了三次独立实验中获得的平均激活倍数。D类，ChIP分析表明NRF2可以与第62页发起人。HeLa细胞提取物（1.5×107用免疫前血清、多克隆抗NRF2抗体或抗乙酰化组蛋白H3抗体作为阳性对照进行免疫沉淀。还包括输入控制（1:50）。使用ARE两侧的引物（分别位于−1324和−1173位置）对免疫沉淀染色质进行PCR分析(上部面板). 使用与组织蛋白酶D启动子−3351和−3069位置对齐的引物对沉淀的染色质进行PCR分析，作为对照。
图2。
图2。
NRF2-MAFG绑定到中的ARE第62页发起人在体外. A类中的ARE第62页启动子在人类、小鼠、大鼠和大象物种中保守，构成顺式-可归类为MARE（Maf识别元素）的元素。B类和C类凝胶流动性转移分析证明NRF2-MAFG与野生型NRF2反应ARE元件结合第62页发起人(B类)但不是变异的ARE站点(C类). GST、GST-NRF2和GST-MAFG蛋白，从大肠杆菌，与[γ-32P] ATP标记的寡核苷酸（位置−1303/−1288）包含野生型ARE基序第62页发起人(B类)或者变异的ARE基序(C类). 与DNA孵育的重组蛋白量为5μg或10μg GST(车道1和2)0.75μg或3.75μg GST-NRF2(车道3和4)0.5或2.5μg GST-MAFG(车道5和6)、0.5μg GST-MAFG或1.5μg(车道7,9、和11)，或3.75μg(车道8,10、和12)GST-NRF2。含有野生型ARE的冷寡核苷酸（1μg）的竞争实验(车道11和12)或突变ARE(13号车道和14)根据第62页启动子表明，结合对野生型元素是特定的。D类SDS-PAGE凝胶考马斯染色显示GST融合蛋白用于B类和C类.
图3。
图3。
p62蛋白通过一个短而保守的序列基序与KEAP1相互作用。 A类，KEAP1和p62的映射，指示域的位置和中使用的删除结构B类绘制这两种蛋白质之间的相互作用。B类MBP下拉分析显示，p62中的氨基酸321–370对于与KEAP1结合至关重要，并且p62与KEAPl的Kelch-repeat结构域相互作用。所描述的KEAP1结构包括在体外在以下人员在场的情况下翻译[35S] 蛋氨酸，并在MBP下拉分析中测试与所示MBP-p62结构体的相互作用。这个底部凝胶板显示考马斯蓝(CB（断路器）)-用各种MBP-p62构建物染色的SDS-聚丙烯酰胺凝胶作为下拉分析的输入。全长蛋白质用星号。C类GST下拉分析表明，p62的339–358氨基酸足以与KEAP1相互作用。GST-p62构建物包含来自p62的指示肽，在GST下拉分析中测试其与由在体外翻译；测试了全长KEAP1（1–624个氨基酸）、一个含有C末端Kelch重复序列的片段（308–624个氨基酸）以及一个含有N末端BTB结构域和IVR的片段（1–307个氨基酸）。这个图形在顶部显示了使用的p62构造以及保守D的p62和NRF2之间的对齐XX年TGE基序（p62中的氨基酸347-352）。D类MBP下拉分析显示D中单点突变的影响XX年第62页的TGE图案。显示了三个独立实验的平均%结合标准偏差的量化在放射自显影上面。E类，示意图基于NRF2中与KEAP1的Kelch-repeat结构域结合的Neh2肽的晶体结构。选择位于Kelch-repeat环中的七个氨基酸残基进行突变分析，以确定其对p62结合的影响。F类和G公司，对与p62相互作用很重要的Kelch重复结构域中氨基酸残基的定位。在MBP-p62的MBP下拉试验中测试KEAP1的指示单点突变结构。显示了三个独立实验的平均%结合标准偏差的量化。H（H），mCherry-KEAP1与来自HeLa细胞提取物的FLAG-p62共免疫沉淀。转染24小时后，用指示的构建物共同转染细胞，并用FLAG抗体免疫沉淀FLAG-p62。使用所示抗体通过Western blotting检测沉淀的FLAG-p62和共沉淀的mCherry-KEAP1。对于B类,C类、和H（H），给出了具有类似结果的三个独立实验的代表性数据。
图4。
图4。
p62和NFR2的相互调节。 A类和B类，含有ARE-元素的启动子由p62诱导。报告基因分析测试所示p62启动子的激活(A类)和Nqo1启动子(B类)报告者通过Nrf2或p62在第62页−/−MEF公司。将100 ng空载体V5-Nrf2、Myc-p62或Myc-p62-G351A与60 ng所示荧光素酶报告体共同转染细胞。中的插图B类显示了对治疗的Nqo1-ARE-Luc报告子激活的影响第62页−/−MEF与N个-乙酰半胱氨酸(NAC公司)和萝卜硫烷(南部)如图所示。C类，报告基因检测通过p62野生型和各种突变体的联合表达来检测Nqo1-ARE-Luc报告基因的激活第62页−/−MEF公司。将所示的Myc-p62构建物与60 ng Nqo1-ARE-Luc报告子共同转染细胞。转染24小时后对细胞进行分析。中的数据A类,B类、和C类显示基于三个独立实验（一式三份）的具有标准偏差的平均折叠归纳法。D类，Western blot实验证明转染后不同Myc-tagged p62构建物的表达第62页−/−MEF公司。使用抗Myc抗体在转染后24小时收获细胞提取物。E类p62的内源性表达水平与不同人类细胞系内源性NRF2的表达水平相关。使用所示抗体通过Western blotting分析所示人类细胞系的提取物。抗肌动蛋白印迹显示，凝胶上的细胞裂解物中含有等量的蛋白质。F类和G公司HeLa细胞p62的敲除降低NRF2水平，反之亦然。分别转染KEAP1、NRF2或p62 siRNAs的HeLa细胞用所示抗体进行Western blotting分析。干扰siRNA和模拟转染作为对照。量化基于三个独立的实验。
图5。
图5。
KEAP1与LC3B竞争与p62的交互作用。 A类，p62的图谱，显示了LIR（LC3相互作用区）和KIR（KEAP1相互作用区）基序的近端位置。B类和C类GST下拉分析显示LC3B和KEAP1与p62结合存在竞争。GST-LC3B与在体外翻译的野生型p62（聚合物）或PB1 p62缺失突变体（单体），在存在或不存在越来越多的在体外翻译成KEAP1。数据表明，随着KEAP1浓度的增加，与LC3B结合的p62数量减少。在所有反应中，p62和LC3B的量是恒定的。D类在稳定表达四环素诱导启动子GFP标记蛋白的HEK293 Flp-in T-Rex细胞中，KEAP1抑制GFP-p62的自噬降解，但不抑制GFP-NBR1。细胞在富含四环素的培养基（10%血清）中培养过夜，导致GFP标记蛋白的积累。然后去除四环素（启动子关闭），GFP标记蛋白降解24小时。通过流式细胞术在指定的时间点测量GFP标记蛋白质的降解，读数为绿色荧光的损失。分析的细胞要么是未转染的，要么是用mCherry或mCherry-KEAP1瞬时转染的。流式细胞术验证mCherry或mCherry-KEAP1的表达。
图6。
图6。
过度表达的KEAP1被招募到p62体并被自噬降解。 A–D，如野生型或突变GFP-KEAP1（Y572A）所示，单独转染HeLa细胞(A类和C类)或与mCherry-p62一起使用(B类和D类). 如图所示添加巴非霉素A1（16 h）(下部面板s） ●●●●。E–H（E–H）,第62页−/−如野生型或突变GFP-KEAP1（Y572A）所示，单独转染MEF(E类和G公司)或与mCherry-p62一起使用(F类和H（H）). 如图所示添加巴非霉素A1（16 h）。A–H转染24h后，用共聚焦显微镜对细胞进行分析。酒吧，10微米。
图7。
图7。
过度表达的KEAP1积聚在酸性囊泡中。 A类，转染mCherry-GFP-KEAP1或mCherry-GFP的HeLa细胞在转染24 h后通过共焦显微镜进行分析。中性状态下含有mCherry-GFP-KEAP1的细胞比例点(绿色和红色)和酸性点(只有红色)并且基于>300个转染细胞的计数的代表性实验的结果显示给正确的。B类,第62页−/−转染mCherry-GFP-KEAP1的MEF，无论是单独转染还是与Myc-p62一起转染，均在转染后24和48小时通过共焦显微镜进行分析。C类,第62页−/−转染后24小时，通过共聚焦显微镜分析用mCherry-GFP-LC3B单独或与Myc-p62一起转染的MEFs。致正确的显示了代表性实验中带有中性点或酸性点的细胞百分比的量化，每个实验基于150多个转染细胞的计数。在A–C,酒吧表示10μm。
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参考文献

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