1. 发育生物学
  2. 干细胞和再生医学

Fam60a（一种Sin3a亚单位）的缺失导致胚胎致死，并与基因启动子子集的异常甲基化有关

  1. Ryo Nabeshima先生
  2. 西村修（Osamu Nishimura）
  3. 前田孝子
  4. 清水夏目漱石
  5. 高弘艾德
  6. 肯塔·亚西罗
  7. 酒井雅雄
  8. 奇卡拉·梅诺
  9. Mitsutaka Kadota公司
  10. Hidetaka Shiratori公司
  11. Kuraku志宏  是通讯作者
  12. 滨田浩史  是通讯作者
  1. 日本大阪大学
  2. 日本RIKEN发育生物学中心
  3. 日本RIKEN生命科学技术中心
  4. 日本RIKEN生物系统动力学研究中心
https://doi.org/10.7554/eLife.36435
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  1. Ryo Nabeshima先生
  2. 西村修（Osamu Nishimura）
  3. 前田孝子
  4. 清水夏目漱石
  5. 伊德高弘
  6. 肯塔·亚西罗
  7. 酒井雅雄
  8. 奇卡拉·梅诺
  9. Mitsutaka Kadota公司
  10. Hidetaka Shiratori公司
  11. Shigehiro Kuraku先生
  12. 滨田浩史
(2018)
Fam60a（一种Sin3a亚单位）的缺失导致胚胎致死，并与基因启动子子集的异常甲基化有关
电子生活 7：e36435。
https://doi.org/10.7554/eLife.36435
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摘要

我们已经检查了Fam60a系列在小鼠发育过程中，一种在胚胎干细胞中高度表达的基因。Fam60a与Sin3a-Hdac转录共抑制复合物的成分相互作用，并且大多数Fam60a系列–/–胚胎表现为内脏器官发育不全，在宫内死亡。Fam60a被招募到基因子集的启动子区域，这些基因的表达在Fam60a系列–/–胚胎。Fam60a靶基因的DNA甲基化水平Adhfe1公司在胚胎第7.5天（E）保持不变，但在胚胎第9.5天显著减少Fam60a系列–/–胚胎，表明DNA去甲基化在突变体中增强。全基因组DNA甲基化检测确定了几个不同的甲基化区域，这些区域在家庭60a–/–胚胎。我们的数据表明，Fam60a是正常胚胎发生所必需的，至少部分是由于它在特定基因启动子处调节DNA甲基化。

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.001

eLife摘要

随着胚胎的发育，其细胞继续分裂并从非特异性胚胎干细胞转化为形成成人身体组织和器官的特异性细胞。这个复杂的过程是由基因网络控制的。尽管大多数成年细胞携带相同的基因，但不同的细胞类型各自激活特定的基因集，这最终赋予了它们独特的特性。同样，发育中的细胞也有独特的基因表达模式，指导细胞的发育、行为及其与邻近细胞的相互作用。

例如，Fam60a基因在胚胎干细胞中高度活跃，但直到现在，还不知道该基因起什么作用。为了进一步研究这一点，Nabeshima等人研究了Fam60a水平正常或降低的小鼠。结果表明，在正常水平下，Fam60a负责肠道的正常发育。然而，水平降低的小鼠的肠道生长非常缓慢。

此外，Farm60a似乎还调控其他几个基因，这些基因的活性在这些小鼠中不再得到适当控制。Nabeshima等人发现，这是因为Fam60a可以与负责抑制或激活基因的蛋白质复合体相互作用。通过改变这些复合物的活性，Fam60a可以影响许多其他基因的活性。

下一步将是找出Fam60a是如何与影响基因活性的蛋白质复合体相互作用的。更好地了解基因是如何促进胚胎发育的，可能有助于理解流产的原因，并找到预防流产的方法。

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.002

介绍

Sin3a蛋白是哺乳动物转录辅抑制复合物的核心成分，该复合物包括组蛋白脱乙酰酶（Hdacs）(Hassig等人，1997年；Zhang等人，1997年). 虽然Sin3a本身不结合DNA，但它为具有特定DNA结合活性的几种转录因子提供了支架，从而促进Hdacs向特定靶基因的募集并随后抑制特定靶基因。缺乏Sin3a的小鼠在胚胎发生期间大约在植入时死亡(McDonnel等人，2012年)表明Sin3a-Hdac复合物对早期胚胎发育至关重要。虽然最初认为这种复合物只抑制基因表达，但它也能以依赖于细胞环境的方式刺激转录(Icardi等人，2012年).

基因表达也受DNA甲基化调控。在哺乳动物中，DNA甲基化主要发生在CpG序列，哺乳动物基因组中约70%的基因启动子包含CpG岛。一般来说，转录活性启动子的CpG岛没有甲基化，而启动子中CpG的甲基化与转录沉默有关。在小鼠发育过程中，基因组DNA的甲基化模式是在预移植阶段由新生甲基转移酶Dnmt3a和Dnmt3 b建立的。一旦建立，这种甲基化模式在DNA复制期间由Dnmt1忠实地维持。DNA甲基化模式的精确形成和维持对小鼠胚胎发生至关重要，因为缺乏Dnmt酶的胚胎会出现明显的形态缺陷并在子宫内死亡(Li等人，1992年；Okano等人，1999年).

甲基化的DNA可以进行去甲基化，这是一个由5-甲基胞嘧啶双加氧酶Tet家族介导的过程，它催化5-甲基胞苷（5mC）转化为5-羟甲基胞嘧啶（5hmC）(Tahiliani等人，2009年). Tet蛋白对DNA的去甲基化可以激活基因启动子，但这些蛋白质也可以通过组蛋白修饰来调节基因表达(Wu等人，2011年；Wu和Zhang，2017年). 考虑到缺乏Tet1和Tet2的小鼠胚胎以及含有Tet1、Tet2和Tet3缺陷细胞的嵌合胚胎畸形，也需要对Tet蛋白进行严格调控，以确保正常发育(Dawlaty等人，2014年；2013). 然而，这种Tet调节的机制尚不清楚。

我们之前已经确定家庭60a(Sinhcaf公司)作为一个功能未知的基因（基因226在[Saijoh等人，1996年])在小鼠胚胎干细胞（ES）中高度表达，并且在这些细胞中的表达在分化时下调。我们现在已经研究了Fam60a在小鼠发育中的作用。我们的数据表明，Fam60a是Sin3a-Hdac共升压复合物的胚胎成分，并通过调节基因启动子子集的DNA甲基化至少部分调节基因表达。

结果

Fam60a与Sin3a-Hdac复合物的成分相互作用

为了检测Fam60a的生化功能，我们培育了一只携带Fam60a:：维纳斯BAC（细菌人工染色体）转基因(图1——图补充1A; 如下所述，由该转基因编码的Fam60a-Venus融合蛋白具有功能）。免疫染色显示Fam60a-Venus蛋白存在于携带转基因的胚胎第9.5天（E）胚胎细胞核中，Fam60a定位于未分化P19（小鼠胚胎癌）细胞的细胞核中(图1-图补充2).

为了鉴定可能与Fam60a相互作用的蛋白质，我们从含有Fam60a:：维纳斯在三种不同条件下进行转基因，将提取物与绿色荧光蛋白（GFP）抗体进行免疫沉淀，并对沉淀蛋白进行质谱分析。鉴定的主要蛋白质有Arid4a、Arid4b、Sin3a、Sap130、Hdac1、Hdac2、Suds3和Brms1l(图1A)，所有这些都是Sin3a-Hdac共升压复合物的成分(Cunliffe，2008年；Fleischer等人，2003年；Grzenda等人，2009年；Nikolaev等人，2004年；Shiio等人，2006年；Silverstein和Ekwall，2005年). 如果用放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液制备核提取物，则未检测到Arid4a和Arid4b(图1A)，这是所用三种条件中最严格的，表明这些蛋白质与Sin3a-Hdac复合物的其他组分相互作用较弱(Lai等人，2001年).

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小鼠胚胎中Fam60a-相互作用蛋白的鉴定。

(A类)在三种不同条件下从携带Fam60a:：维纳斯将转基因基因与GFP的珠偶联抗体进行免疫沉淀，这些抗体要么已经（对照）接触过，要么之前没有接触过重组GFP。然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离结合到珠子的蛋白质，并通过银染色显示。非特异性结合到珠子上的蛋白质用星号表示，特异性结合的蛋白质的身份由质谱测定。用GFP抗体对珠结合蛋白进行免疫印迹（IB）分析，以检测Fam60a-Venus。(B类)E10.5 WT胚胎、未分化P19细胞或含有Fam60a:：维纳斯如图所示，用珠偶联的抗-Fam60a、抗-GFP或对照兔免疫球蛋白G（IgG）对转基因进行免疫沉淀（IP），并用Sin3a、Hdac1和Hdac2的抗体对所得沉淀物进行免疫印迹分析（上图）。核提取物（输入）以及暴露于用于免疫沉淀的抗体（Preclear）之前与珠非特异性结合的材料也进行免疫印迹分析。或者，用Sin3a、Hdac1、Hdac2或FLAG表位（对照）抗体对E10.5 WT胚胎的核提取物进行免疫沉淀，并用Fam60a抗体对所得沉淀进行免疫印迹分析（下表）。另请参见图3——图补充1至3.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.003

进一步的联合免疫沉淀分析证实Fam60a与Sin3a-Hdac复合物的成分相互作用。因此，从带有Fam60a抗体的E10.5野生型（WT）胚胎核提取物制备的免疫沉淀物中发现含有Sin3a、Hdac1和Hdac2(图1B). 此外，这三种蛋白在由核提取物制备的免疫沉淀物中检测到Fam60a:：维纳斯抗GFP抗体转基因胚胎(图1B). 从具有Fam60a抗体的未分化P19细胞制备的免疫沉淀物也含有Sin3a和Hdac1，但不含Hdac2(图1B). E10.5 WT胚胎核提取物的交互免疫共沉淀分析表明，Fam60a存在于用Sin3a或Hdac1抗体制备的免疫沉淀中，但不存在于用Hdac2抗体制备者中(图1B)这表明Hdac2和Fam60a之间的相关性相对较弱。总之，这些数据表明Fam60a是发育中的小鼠胚胎和未分化的P19细胞中Sin3a-Hdac共升压复合物的一种成分。这与最近的研究结果一致，即Fam60a是ES细胞中变异Sin3a复合体的核心亚单位(Streubel等人，2017年). 然而，考虑到Hdac1、Hdac2和RbAp46/48与来自家庭60a–/–ES细胞(图1——图补充3).

Fam60a系列小鼠胚胎和成年肠道中的表达

为了阐明Fam60a的生理功能，我们首先检查了Fam60a系列小鼠胚胎发生过程中的表达。的表达式Fam60a系列在E9.5中是普遍存在的，但随着发育的进行，它逐渐局限于细胞的一个子集(图2——图补充1). 在E12.5处，Fam60a系列因此，在神经管、神经嵴细胞、肺、胰腺和肠中表达明显，但在肝脏中不表达。肠道上皮细胞显示高水平的Fam60a系列E15.5处的表达式(图2A)肠道绒毛间继续表达Fam60a系列E17.5处(图2B和C). 在成年小鼠中，Fam60a在十二指肠隐窝中保持表达(图2D-F). 鉴于肠干细胞和祖细胞存在于隐窝中，我们研究了Fam60a的命运+用三苯氧胺给携带αFam60a-CreERT2系列转基因和lacZ公司报告基因。注射三苯氧胺后第1、3和5天对小鼠的检查显示，LacZ+细胞在第1天出现在肠绒毛的底部，随后在接下来的4天内向绒毛尖端迁移(图2G-I). 因此，这些数据表明Fam60a系列在包括肠道体细胞在内的细胞亚群中表达。

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的表达式Fam60a系列在胚胎和成年小鼠肠道中。

(A–C)原位杂交分析Fam60a系列E15.5在小鼠胚胎肠切片中的表达(A类)和E17.5(B类和C类).Fam60a系列在E15.5的胃肠道上皮细胞和E17.5的肠绒毛间表达。中图像的放大倍数更高的视图(B类)如所示(C类). 比例尺，100µm。(D–F型)成人十二指肠Fam60a表达的免疫组织化学分析。对一只野生型小鼠进行染色，并将其作为对照，但不含初级抗体(D类)或带有Fam60a抗体(E类)，而对于一只携带Fam60a:：维纳斯用GFP抗体进行转基因(F类). 比例尺，100µm。(G–I型)LacZ的谱系痕迹分析+在注射三苯氧胺（6 mg）后的第1、3或5天，分别在含有Fam60a-CreERT2系列转基因和拉奇报告基因。比例尺，500µm。另请参见图1——图补充1.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.007

发育缺陷Fam60a系列突变小鼠

我们下一步生成的老鼠缺乏Fam60a系列.产生了两种类型的突变等位基因：Fam60a系列–和Fam60a系列β地缘(图3——补充图1A和B).Fam60a系列–/–和Fam60a系列βgeo/βgeo小鼠表现出难以区分的表型，表明这两个等位基因在功能上都为空，随后的分析是用Fam60a系列–/–小鼠，除非另有说明。这两种类型的杂合子也与WT小鼠无明显区别。我们确认了Fam60a系列mRNA和Fam60a蛋白在Fam60a系列–/–胚胎(图3——补充图1C和D,图3-源数据1).Fam60a系列–/–老鼠出生的频率远低于预期。它们在E9.5和E10.5的预期频率下被检测到，但此后它们的数量开始下降，在E18.5时大大减少(补充文件1). 检查Fam60a系列–/–E13.5胚胎显示，包括心脏、肺、肝脏和肠道在内的许多内脏器官明显小于WT胚胎(图3A-C). 特别是，右心室发育不全明显，也经常观察到室间隔缺损Fam60a系列–/–胚胎(图3D).Fam60a系列在发育中的心脏中表达，主要在E13.5时WT胚胎的右心室和流出道中表达(图3G). 许多Fam60a系列–/–存活至E18.5的胚胎表现为大动脉转位、右心室双出口、心室间隔缺损以及脾脏发育不全、肺分叶不良和肠道旋转异常(图3-图补充2和三). 虽然这些异常似乎让人联想到侧位缺陷，但左右不对称表达坑x2维持在E8.0（数据未显示），表明异常并非直接由左右模式受损所致。

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内脏器官生长迟缓Fam60a系列–/–老鼠。

(A–C)WT的整个胚胎和指示器官(Fam60a系列+/+, (A类)和Fam60a系列–/–(B类和C类)E13.5小鼠。比例尺，1 mm(D–F型)WT核心部分(D类)或Fam60a系列–/–(E类和F类)胚胎E13.5用苏木精-伊红染色。突变胚胎表现为室间隔缺损（红色箭头）。比例尺，500µm。(G公司)的表达式Fam60a系列用全原位杂交技术检测E13.5心脏。(H（H）和我)Fam60a系列–/–和WT胚胎分别在E9.5。突变胚胎表现出整体生长迟缓，流出道缩短（红条）和严重的神经管缺陷。比例尺，1 mm。另请参阅图3-图补充1至4和补充文件1.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.009
图3-源数据1

的数值数据图3——补充图1C.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.014
图3-源数据2

的数值数据图3-图补充4I.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.015

这个Fam60a系列–/–胚胎在E9.5已经表现出形态异常，包括生长迟缓、心脏（流出道缩短）和神经管缺陷(图3H和I). 鉴于大多数突变胚胎表现出生长迟缓，我们通过溴脱氧尿苷（BrdU）标记和BrdU阳性细胞计数，检测了E9.0至E9.5胚胎不同组织中的细胞增殖率(图3-图补充4,图3-源数据2). 横隔、次级心脏场（SHF）和心外膜前区的细胞增殖程度显著降低，而心室的细胞增殖不受影响，神经管的细胞增殖轻微增加家庭60a–/–胚胎与对照胚胎进行比较。假设流出道来自SHF细胞(白金汉等人，2005年)还有那个Fam60a系列在WT胚胎的SHF衍生区域表达(图3G)SHF细胞增殖率降低可能导致流出道缩短，继而在突变胚胎中出现明显的右心室发育不全。因此，这些结果表明Fam60a系列是小鼠胚胎细胞增殖和器官发生所必需的。

Fam60a被募集到启动子区域并调节基因表达

鉴于Sin3a-Hdac复合物被认为通过与启动子区域结合来抑制基因表达，我们检测了Fam60a系列–/–通过RNA-sequencing（RNA-seq）分析胚胎。的比较Fam60a系列–/–在E9.5的WT胚胎中，558个基因表达上调，172个基因表达下调(图4A和B,图4-来源数据1和2). 基因本体分析表明，突变胚胎中与营养反应或细胞外基质组织相关的基因表达增加，而与脂质生物合成相关的基因则减少(图4——补充图1). 这些数据表明，Fam60a在E9.5胚胎中以阴性和阳性两种方式调节基因表达，但主要以阴性方式调节。

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改变基因表达谱Fam60a系列–/–胚胎。

(A类)维恩图显示了通过ChIP-seq分析确定的Fam60a靶基因与表达上调或下调的基因之间的重叠Fam60a系列–/–RNA-seq分析显示E9.5的胚胎。(B类)E9.5中差异表达基因RNA-seq值的折叠变化Fam60a系列–/–ChIP-seq分析还发现，它们与TSS区域的Fam60a-Venus结合。数据为三个胚胎的平均值±标准差。(C类)通过RT-qPCR分析验证E9.5 WT和Fam60a系列–/–胚胎。数据为五个独立实验的平均值±标准差*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001（学生未成对t吨测试）。另请参见图4——补充图1和2.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.016
图4——源数据1

的靶基因列表Fam60a系列.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.019
图4——源数据2

的数值数据图4B.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.020
图4——源数据3

的数值数据图4C.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.021
图4-源数据4

的数值数据图4——补充图2B.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.022
图4-源数据5

的数值数据图4补充图2C.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.023
图4——源数据6

的数值数据图4——图补充2D.

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我们还使用E9.5进行染色质免疫沉淀，然后进行深度测序（ChIP-seq）分析Fam60a:：金星转基因胚胎和GFP抗体，以确定基因组中Fam60a结合位点。由该转基因编码的Fam60a-Venus融合蛋白能够修复Fam60a系列突变小鼠(图1——补充图1B和C)，表明它功能齐全。在两个独立实验（分别为ChIP-seq1和ChIP-seq2）中检测到约17000和14000个峰，约80%的峰位于基因位点，尤其是转录起始位点（TSS）附近(图5A和B；图5补充图1A和B,图5-源数据1). 该分布模式与之前测定的Sin3a的分布模式非常相似(鲍曼等人，2014年). E10.5转基因胚胎的共免疫沉淀分析显示Fam60a-Venus与Ing2相互作用(图5——补充图1C)，一种与赖氨酸结合的蛋白质4-三甲基化组蛋白H3（H3K4me3），表明Fam60a主要被招募到转录基因的启动子中。对所有基因的TSS区域（相对于TSS在-3 kb到+3 kb之间）进行检查，结果鉴定出7989个基因，这些基因在该区域可重复显示至少一个Fam60a结合位点(图5C)表明这些基因可能直接受Fam60a调控。

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Fam60a对基因启动子的全基因组定位。

(A类)通过对带有GFP抗体的E9.5转基因胚胎进行ChIP-seq分析，确定了所有基因TSS区域Fam60a-Venus的平均结合谱，以及结合峰。距离是相对于TSS表示的。(B类)ChIP-seq分析的峰值分布如(A类). 约80%的峰位于基因位点。UTR，未翻译区域。(C类)Venn图显示两个独立的ChIP-seq分析的Fam60a靶基因重叠（那些结合峰在TSS的±3 kb内）（ChIP-seq1和ChIP-se_q2）。(D类)用ChIP-qPCR分析Fam60a-Venus和Sin3a分别与E9.5转基因和WT胚胎中所示基因的TSS区结合。淡蓝色和橙色条分别代表GFP和Sin3a抗体的IgG对照。数据以输入百分比表示，三个独立实验的平均值±标准差。Actb公司作为阳性对照进行检查。(E类)E9.5的Fam60a-Venus ChIP-seq结果示例Fam60a-维纳斯胚胎。ChIP-seq1和ChIP-seq2均使用GFP抗体进行检测。显示了四个Fam60a靶基因在TSS周围的峰值，红色箭头指示转录方向。另请参见图5——图补遗1和2.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.025
图5-源数据1

ChIP-seq分析确定的目标基因组区域列表。

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.028
图5-源数据2

的数值数据图5D.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.029
图5-源数据3

的数值数据图5——补充图2.

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在558个上调和172个下调基因中家庭60a–/–胚胎，分别有245和45个基因，在TSS区域至少有一个Fam60a结合峰(图4A). 鉴于74%（127/172）的下调基因在该区域缺乏Fam60a结合位点，大多数下调基因的表达变化可能是由于Fam60a缺失的次级效应。我们从290个（245+45）已鉴定的基因中选择了18个基因进行进一步分析，这些基因是根据RNA-seq显示的突变胚胎中表达的大幅度变化而确定的(图4B). 逆转录和定量聚合酶链反应（RT-qPCR）分析证实，WT和Fam60a系列–/–胚胎在E9.5，具有长度9,Adhfe1公司,Mxd3型,Dchs1公司、和纳克上调和Gt（ROSA）26Sor公司突变体下调(图4C,图4——源数据3). 其中一些上调基因的表达（例如长度9,Dchs1公司、和纳克)年也有所增加Fam60a系列–/–ES细胞与对照ES细胞的比较(图4补充图2A和B,图4-源数据4). 三个上调基因的ChIP-qPCR分析(Adhfe1公司,纳克,Dchs1公司)还揭示了E9.5转基因和WT胚胎中它们的启动子区域分别与Fam60a-Venus和Sin3a的关联(图5D,图5-源数据2). 通过ChIP-seq分析确定的Fam60a结合峰位于Adhfe1公司,纳克、和Dchs1公司如所示图5E虽然Sin3a-Hdac复合物具有组蛋白去乙酰化活性，但Lys水平9-Fam60a靶基因启动子区乙酰化组蛋白H3（AcH3K9）(Adhfe1公司,纳克,Dchs1公司)WT和Fam60a系列–/–胚胎(图5——补充图2,图5-源数据3). 然而，类似的分析Fam60a系列–/–ES细胞显示三个此类基因启动子区的AcH3K9水平(长度9,Dchs1公司,纳克)增加了(图4补充图2C,图4-源数据5).

Fam60a与DNA甲基化和Tet的关联

我们研究了Fam60a系列具有一个包含无脊椎动物同源物的序列数据集以及一个paralog，指定家族60b(图6A). 系统发育树揭示了导致Fam60a系列和家族60b在颌骨脊椎动物受到辐射之前的早期脊椎动物谱系中，很可能是在这一时期发生的经过充分研究的基因组扩展（2R-WGD，两轮全基因组复制）期间。它还强调了重叠前正交的起源家族60在后生动物早期。对编码Sin3、Tet和Dnmt蛋白的基因家族以及单个物种中DNA甲基化的存在或不存在的分析表明Fam60a与DNA甲基化、Tet、Sin3相关(图6B). 因此，在所有被检测的脊椎动物中都发现了约220个氨基酸残基的Fam60a蛋白，在昆虫中也检测到了Fam60a-同源序列，但在线虫或酵母菌中没有检测到(图6——图补充1) (Smith等人，2012年). DNA甲基化和Tet蛋白在人类和昆虫中也保守，但在线虫或酵母菌中不保守，而在酵母菌和人类中Sin3保守得更广。

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Fam60a和Tet1的系统发育和功能关系。

(A类)Fam60a及其相关蛋白的分子系统发育。该树是用最大似然法和99个氨基酸残基推断出来的。引导值显示在各个节点上。(B类)Fam60、Sin3、Tet和Dnmt家族的基因库。黑框表示存在至少一个经过系统发育验证的直系祖先，而白框表示没有直系祖先。2R-WGD，两轮全基因组复制。根据目前的知识，个体物种中是否存在DNA甲基化(铃木和小鸟，2008；Zemach和Zilberman，2010年)图中还显示了。(C类和D类)Fam60a抑制NIH3T3细胞中的Tet1活性。对表达FLAG-Tet1和Fam60a的NIH3T3细胞进行5hmC和FLAG-Tet1免疫荧光染色(C类)或独自一人(D类). 通过强力霉素诱导FLAG-Tet1表达24小时后，对细胞进行分析。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）染色。红色箭头表示5hmC和FLAG免疫反应阳性的细胞。白色箭头表示FLAG为阳性，5hmC为阴性。(E类)在表达FLAG-Tet1的细胞中，5hmC与FLAG-Tet1的平均荧光强度图，如(C类)和(D类). (F类)FLAG-Tet1比例+在类似于(C类)和(D类). 数据为三个独立实验的平均值±标准差*p<0.05（学生未成对t吨测试）。另请参见图6-图补充1和2.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.031
图6——源数据1

的数值数据图6E.

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图6——源数据2

的数值数据图6F.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.035

Fam60a与DNA甲基化和Tet的关联，以及Sin3a-Hdac复合物与甲基化CpG结合蛋白2（MeCP2）、Dnmt1和Tet1等甲基化调节蛋白相互作用的事实(Nan等人，1998年；Williams等人，2011年)，提示Fam60a可能调节Tet-介导的DNA去甲基化。我们在转染了多西环素诱导的FLAG表位表达载体（标记的Tet1）和Fam60a和Venus表达载体或相应的空载体的NIH3T3细胞中测试了这种可能性。因此，在Fam60a缺失或存在的情况下，转染细胞暴露于强力霉素可诱导Tet1的表达(图6——图补充2). 在没有Fam60a的情况下，83%的FLAG-Tet1+细胞5hmC阳性（即只有17%的FLAG-Tet1+给予多西环素24小时后，细胞保持阴性（5hmC），提示FLAG-Tet1可以有效地将5mC转化为5hmC。然而，在存在Fam60a的情况下，55%的FLAG-Tet1+细胞保持阴性5hmC(图6C-F,图6——源数据1和2)表明Fam60a可能抑制Tet1活性。Tet1在Fam60a靶基因启动子区的招募(长度9,Dchs1公司,纳克)在中未受影响Fam60a系列–/–ES细胞(图4——图补充2D,图4——源数据6)表明Fam60a负调控Tet1活性而不影响其向启动子区的募集。

异常启动子低甲基化Fam60a系列–/–小鼠胚胎

鉴于我们的结果表明Fam60a抑制培养细胞中的Tet1活性，我们接下来确定DNA甲基化在Fam60a系列–/–小鼠胚胎。亚硫酸氢盐序列测定纳克和长度9WT或Fam60a系列–/–E9.5时的胚胎(图7-补充图1)尽管我们的ChIP分析表明Fam60a-Venus被招募到转基因胚胎的这些启动子区域。相反Adhfe1公司被发现在Fam60a系列–/–胚胎，甲基化水平为4至10%，而胚胎发育9.5阶段WT胚胎的甲基化水平约为20%(图7,图7——源数据1). 这种低甲基化可能是由于Tet介导的从头DNA甲基化减少或去甲基化增加所致。为了区分这些可能性，我们检测了Adhfe1公司启动子处于早期发育阶段，因为DNA甲基化主要发生在植入前。WT和Fam60a系列–/–E7.5胚胎，之后该启动子的甲基化水平在突变胚胎中逐渐降低(图7,图7-源数据1). 这些结果表明，甲基化维持受损或去甲基化增加是导致Adhfe1公司启动子Fam60a系列–/–这与Fam60a抑制培养细胞中Tet1活性的观察结果一致。羟甲基DNA免疫沉淀（hMeDIP）分析显示，在WT胚胎中检测到的几乎所有Fam60a靶基因启动子上都有5hmC沉积，这进一步支持了这一观点(图7——补充图2,图7-源数据2). 在印迹控制区域未检测到低甲基化Kcnq1其他1或桩号3在里面Fam60a系列–/–胚胎(图7-图补充3). 总之，这些发现表明Fam60a在一组基因启动子中调节Tet介导的去甲基化。

图7含3种补充剂查看所有内容
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甲基化状态Adhfe1公司野生型和Fam60a系列–/–小鼠胚胎。

(A类)甲基化模式Adhfe1公司代表WT和Fam60a系列–/–亚硫酸氢盐测序显示处于指定发育阶段的胚胎。闭合圆圈和开放圆圈分别表示甲基化和非甲基化CpG位点。箭头表示的TSSAdhfe1公司(B类)甲基化频率Adhfe1公司启动子被确定为(A类)对于每个基因型在每个发育阶段的三个或四个单独胚胎。p值是用Student的unpartiedt吨测试。另请参见图7-图补充1至3.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.036
图7-源数据1

的数值数据图7B.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.040
图7-源数据2

的数值数据图7-图补充2.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.041

基因组中不同的甲基化区域Fam60a系列–/–胚胎

为了验证Fam60a在DNA甲基化调控中的作用，我们检测了基因组中启动子、CpG岛和CpG海岸的甲基化状态Fam60a系列–/–E9.5时的WT胚胎。这些靶区被捕获，进行亚硫酸氢盐转换，并用下一代测序器测序。捕获的DNA中CpG位点的总体甲基化水平约为45%，并且在两者中显示出相似的分布模式Fam60a系列–/–和WT胚胎(补充文件2,图8-图补充1).

鉴于全基因组DNA甲基化水平似乎不受Fam60a缺失的影响，我们首先检测了野生型和野生型中Fam60a-结合启动子（约8000个启动子）的DNA甲基化程度Fam60a系列–/–胚胎。低甲基化通常在Fam60a结合区观察到，但野生型和Fam60a系列–/–胚胎(图8-图补充2). 接下来，我们通过关注差异甲基化区域（DMR）来检查DNA甲基化水平是否在基因启动子子集中受到影响。检测到7245个DMR，高甲基化和低甲基化DMR的DNA甲基化平均变化分别为11.87和10.99%(图8-图补充3). 在检测到的7245个DMR中，3049个和4196个区域在Fam60a系列–/–胚胎，发现388个高甲基化DMR（12.7%）和1257个低甲基化DMRs（30.0%）与Fam60a结合区重叠(表1). 在突变体和野生型胚胎之间甲基化水平差异最大的500个高甲基化和低甲基化的DMR中，83个高甲基化DMR（16.6%）和254个低甲基化DMR（50.8%）包含Fam60a结合位点(表1)，提示Fam60a结合位点与低甲基化DMR优先相关。的发起人Adhfe1公司，在Fam60a系列–/–胚胎(图7)，被列入前500名低甲基化DMR(图8-源数据1).

表1
高甲基化和低甲基化DMR的数量与ChIP-seq峰重叠。

E9.5胚胎DMR与Fam60a结合位点的关系。获得了三个样本的甲基seq数据Fam60a系列–/–ChIP-seq1和ChIP-seq2实验获得了三个WT胚胎和ChIP-seq数据。显示了与所有或前500个高甲基化和低甲基化DMR重叠的ChIP-seq峰的数量。

https://doi.org/10.7554/生活.36435.042
数据集DMR总计方向数字式万用表与ChIP-seq峰重叠
与所有DMR相比（%）与前500名相比（%）
3个胚胎（三倍）（平均差异>=0.05）7245超（Hyper）3049388 (12.7)83 (16.6)
海波41961257 (30.0)254 (50.8)

接下来，我们研究了基因组中前500个高甲基化和前500个低甲基化DMR的位置。这两类区域的分布不同，高甲基化DMR优先位于TSS下游5至50kb的基因外显子区域(图8A和C)而大多数低甲基化的DMR位于TSS下游0-5kb的内含子区域(图8B和D). 低甲基化DMR的分布模式(图8B)与Fam60a结合位点相似(图5B和图5——补充图1B). 因此，这些数据表明Fam60a与小鼠胚胎中的DNA甲基化状态有关。

图8含3种补充剂查看所有内容
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不同甲基化区域（DMRs）Fam60a系列–/–胚胎。

(A类和B类)前500个高甲基化和低甲基化DMR在各种基因组特征中的分布。(C类和D类)前500个高甲基化和低甲基化DMR相对于最近TSS的基因组位置概况。请注意，总数超过500，因为DMR附近的两条绞线上的TSS都已计算在内。另请参见图8-图补遗1和2和补充文件2.

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.043
图8-源数据1

低甲基化和高甲基化DMR列表。

DMR按列areaStat排序，该列是CpG的t-统计量之和。请注意Adhfe1公司被包括在前500个低甲基化DMR中。

https://doi.org/10.7554/eLife.36435.047

讨论

Fam60a系列在小鼠胚胎发育过程中普遍表达，直至E9.5，之后其表达逐渐局限于细胞亚群，包括参与增殖的细胞。在成年老鼠身上，Fam60a系列在位于肠腺的干细胞中表达，表明其表达可能与分化潜能有关。与这个概念一致，Fam60a系列基因敲除小鼠内脏器官发育迟缓。基因本体论分析表明，表达异常的基因Fam60a系列–/–胚胎包括与营养物质反应、细胞外基质组织和脂质生物合成有关的胚胎，这表明这些过程的破坏可能导致突变胚胎中明显的器官生长迟缓。

对Fam60a相互作用蛋白的搜索确定了Sin3a-Hdac转录辅抑制复合物。Fam60a的化学计量比和免疫沉淀物中该复合物的成分(图1)提示给定细胞中的大多数Fam60a与复合物有关。因此，Fam60a可能与Sin3a-Hdac复合物相关。而Sin3a基因敲除小鼠在着床前后胚胎发生期间死亡(McDonel等人，2012年),Fam60a系列–/–胚胎发育到后期。因此，Sin3a可能具有独立于Fam60a的功能，包括在多种蛋白复合物中的功能，或者Sin3a基因敲除小鼠的早期缺陷是由于卵母细胞中缺乏该蛋白。Fam60a最近被证明是ES细胞中包括Tet1和Ogt的变体Sin3a复合物的核心亚基(Streubel等人，2017年).

一般来说，Sin3a-Hdac复合物被认为通过组蛋白去乙酰化抑制基因表达。然而，这种复合物也可以促进转录激活，其方式取决于细胞环境(Suganuma和Workman，2013年；Icardi等人，2012年). 事实上，我们发现许多基因的表达在Fam60a系列–/–胚胎。因此，Fam60a不仅有助于Sin3a-Hdac复合物的转录共抑制活性，也有助于其促进转录激活。鉴于Fam60a靶基因启动子的组蛋白乙酰化水平在WT和Fam60a系列–/–胚胎。

系统发育分析揭示了祖先的广泛分类分布家族60后生动物中的基因以及在脊椎动物早期进化过程中该基因的复制家庭60a和家族60b伞兵。缺席家族60和泰特基因和DNA甲基化秀丽隐杆线虫酵母表明Fam60a可能参与与DNA甲基化和Tet相关的Sin3a功能。与这种可能性一致，已知Sin3a与MeCP2、Dnmt1和Tet1相互作用(Nan等人，1998年；Williams等人，2011年). 值得注意的是，Tet蛋白在进化上保守的基因增强子在早期发育的藻型阶段的去甲基化中发挥作用(Bogdanović等人，2016年).Adhfe1公司发现其启动子在Fam60a系列–/–胚胎似乎是受Fam60a和Tet活性调节的典型基因。的表达式Adhfe1公司因此，由于Fam60a介导的Tet活性抑制导致其启动子甲基化，通常被抑制，但在家庭60a–/–因为Fam60a缺失导致启动子低甲基化而导致胚胎。表达上调的其他基因Fam60a系列–/–胚胎（例如长度9和纳克)尽管Fam60a-Venus在转基因胚胎中被有效招募到这些启动子中，但在WT或突变胚胎中，它们的启动子区域几乎没有DNA甲基化。除了作为DNA去甲基化酶发挥作用外，Tet蛋白还与Sin3a-Hdac结合，并以独立于其去甲基化活性的方式作为转录阻遏物(Williams等人，2011年；Zhang等人，2015年). 上调基因，如长度9和纳克在里面Fam60a系列–/–因此，胚胎可能是由于Tet蛋白缺乏后者的功能。

对Fam60a结合位点的全基因组搜索显示，Fam60a被招募到与CpG岛重叠的基因启动子区域。通常，转录活性基因的此类CpG岛启动子在H3K4me3中富集。与Fam60a的基因组定位一致，我们发现Fam60a与Ing2相互作用，Ing2已知与H3K4me3结合(Goeman等人，2008年). Tet蛋白与Sin3a相互作用，被认为定位于CpG岛启动子，以保持CpG岛屿未甲基化，此类启动子通常标记为H3K4me3。这些观察结果表明Fam60a主要定位于转录基因启动子，通过Sin3a和Tet负向和正向调节基因表达水平。

Fam60a如何调节Tet活动？它可能抑制双加氧酶的酶活性或损害Tet向DNA的募集。在这方面，PGC7（也称为Stella）保护小鼠受精卵中雌性原核免受Tet3依赖性的5mC到5hmC的转化，并抑制小鼠ES细胞中Tet3与染色质的结合(Nakamura等人，2012年). Fam60a可能同样影响Tet与染色质的结合，尽管这不太可能，因为在Fam60a系列–/–ES细胞。或者，Fam60a可能与Tet蛋白发生物理相互作用并抑制其活性。然而，鉴于我们在寻找Fam60a-相互作用蛋白时没有发现Tet蛋白，Fam60a不太可能直接与Tet相互作用。Fam60a影响Sin3a和Tet功能的机制的进一步表征将为胚胎发生期间的基因调控提供新的见解。

材料和方法

关键资源表
试剂类型（种类）
或资源		任命来源或参考标识符其他信息
基因(小肌肉)家庭60a不适用NCBI基因：56306也称为SINHCAF
基因(小肌肉)测试1不适用NCBI基因：52463
应变，应变背景
(小肌肉)		国际竞争对手规则查尔斯河
应变，应变背景
(小肌肉)		C57BL/6J型查尔斯河
应变，应变背景
(小肌肉)		129查尔斯河
应变，应变背景
(小肌肉)		B6C3F1/铬查尔斯河
遗传试剂（EMCV）内部核糖体入口
站点（IRES）-βgeo		不适用
遗传试剂
（P1噬菌体）		液氧磷不适用
遗传试剂
（P1噬菌体）		FRT公司不适用
遗传试剂
(酿酒酵母)		燃油CAGPMID:16651697
遗传试剂
（P1噬菌体）		CAG-核心电话：9268708
遗传试剂
（维多利亚州埃科雷亚）		Fam60a-维纳斯这篇论文
遗传试剂
（P1噬菌体）		Fam60a-CreERT2系列这篇论文
细胞系(小肌肉)第19页PMID:7056443
细胞系(小肌肉)NIH3T3 Tet-On 3G技术Clontech公司631197
抗体Fam60a抗体
（α-E15W）（兔多克隆）		这篇论文IHC或WB的1/1000稀释
抗体抗GFP
（兔多克隆）		MBL公司代码598
RRID：AB_591819号		IP为10µl，
IF的1/2000稀释
抗体对照兔IgG神谷生物医学PC-124型用于IP控制
抗体对照兔IgG赛默飞世尔科技公司用于IP控制
抗体抗HDAC1
（小鼠单克隆）		abcam公司约31263
RRID：AB_732774号		该产品已停产
由abcam提供
抗体防FLAG
（小鼠单克隆）		Sigma-Aldrich公司F3165型
RRID：AB_259529号		IF为1/2000
抗体抗HDAC2
（兔多克隆）		abcam公司约7029
RRID：AB_305706号		WB的1/1000稀释
抗体抗Sin3a
（兔多克隆）		圣克鲁斯
生物技术		sc-994型
RRID：AB_2187760号		WB的1/1000稀释
抗体抗Ing2
（兔多克隆）		abcam公司约109504
RRID：AB_10861294号		WB的1/2000稀释度
抗体抗BrdU
（小鼠单克隆）		BD生物科学347580
RRID：AB_10015219号		IHC的1/200稀释
抗体抗5hmC
（兔多克隆）		主动基序39769
RRID：AB_10013602号		IF的1/2000稀释
抗体抗组蛋白H3K9ac
（兔多克隆）		主动基序39917
RRID：AB_2616593型		用于ChIP分析
抗体抗RbAp46/48
（兔多克隆）		主动基序39199
RRID：AB_2615007号		WB的1/2000稀释
重组
DNA试剂		pTRE3G-标记-Tet1这篇论文
重组
DNA试剂		pEF-BOS-Fam60a-IRES-Venus软件这篇论文
重组
DNA试剂		pEF波士顿PMID:1698283
肽，重组
蛋白质		E15瓦这篇论文为了…的崛起
抗Fam60a抗体
肽，重组
蛋白质		重组
GFP蛋白		abcam公司ab85191号
商业分析或试剂盒EpiTect亚硫酸氢盐试剂盒凯杰编号：59104
商业分析或试剂盒PrimeScript RT试剂盒
带gDNA橡皮擦		塔卡拉RR047A型
商业分析或试剂盒SOLiD Total RNA-Seq试剂盒生活科技4445374
商业分析或试剂盒SureSelect甲基-Seq
目标浓缩系统		安捷伦科技公司931052
商业分析或试剂盒EZ甲基化金试剂盒Zymo研究
化合物，
药物		英国标准3赛默飞世尔科技公司产品编号21580抗体结合
到发电机
化合物，
药物		盐酸多西环素Sigma-Aldrich公司D9891号
化合物，
药物		三苯氧胺Sigma-Aldrich公司T5648-1G型溶于玉米油
软件、算法LifeScope软件应用生物系统
软件、算法Mac电脑PMID:18798982
软件、算法欧洲原子能委员会采购经理人指数：19689956
软件、算法库马PMID:18487274
软件、算法弓形2PMID:22388286
软件、算法俾斯麦PMID:21493656
软件、算法Samtools公司PMID:19505943
软件、算法Picard工具包布罗德学院
软件、算法methyKit程序项目管理标识号：23034086
软件、算法BSseq程序PMID:23034175
软件、算法床上工具项目管理标识号：20110278
软件、算法很棒项目管理标识号：20436461
软件、算法a树叶项目管理标识代码：23677614
软件、算法MAFFT公司PMID:23329690
软件、算法装饰铝PMID:19505945
软件、算法RAxML公司项目管理标识号：24451623

老鼠

Fam60a系列β地缘，一个突变的等位基因Fam60a系列通过基因靶向小鼠ES细胞，分别在内含子4和内含子1中插入一个内部核糖体进入位点（IRES）-βgeo盒和一个loxP位点(图2——图补充1A). A类Fam60a系列弗洛克斯等位基因随后通过使用燃油CAG转基因(Kanki等人，2006年)、和Fam60a系列——缺少外显子2至4的等位基因是通过使用CAG-核心转基因(酒井和宫崎骏，1997年). 两者Fam60a系列β地缘和Fam60a系列–等位基因在功能上为零。突变小鼠保持在129/C57B6混合背景上。用于基因分型的PCR引物为Fam60a-5A（5′-ATATGCTAGGTGCCACAG-3′）、Fam60a-3A（5’-TTCTCACTAGCACAGG-3′。BAC转基因(Fam60a:：维纳斯)利用BAC重组系统从小鼠BAC克隆RP23-100A22构建Fam60a-Venus融合蛋白编码区(图3——图补充1A) (Copeland等人，2001年). Fam60a-Venus蛋白，其中Venus与Fam60a的COOH末端融合，具有功能性，因为转基因能够拯救家庭60a突变小鼠(图3——补充图1C). BAC转基因(Fam60a-CreERT2系列)通过将CreERT2插入Fam60a系列BAC克隆。

细胞系来源和验证

请求详细协议

P19胚胎癌细胞系(麦克伯尼和罗杰斯，1982年)是迈克尔·麦克伯尼（渥太华大学）送的礼物。NIH3T3 Tet-On 3 G细胞系（631197，Clontech）购自日本京都的Takara-bio Clontech。

Fam60a-相互作用蛋白的鉴定

请求详细协议

E10.5胚胎携带Fam60a:：维纳斯在PBS中回收转基因以制备核提取物。胚胎通过带有柱塞的70µm细胞过滤器，并通过在缓冲液a（10 mM Hepes-KOH（pH 7.9）、10 mM KCl、1.5 mM MgCl）中培养使细胞膨胀2、0.1 mM EGTA、1 mM二硫苏糖醇和罗氏完整蛋白酶抑制剂鸡尾酒）在冰上放置15分钟，然后在Dounce均质器中使用20次适合的杵进行均质。然后将Nonide P-40以0.1%的最终浓度添加到匀浆中，并使用另外20次杵。匀浆在960×克在4°C下悬浮5 min，将所得核团悬浮并在4°C下培养3 h，或在RIPA缓冲液（50 mM Tris-HCl（pH 8.0）、150 mM NaCl、2 mM EDTA、1%Nonide P-40、0.5%脱氧胆酸钠、0.1%SDS、1 mM二硫苏糖醇和罗氏完全蛋白酶抑制剂混合物）、缓冲液C（20 mM Hepes-KOH（pH 7.9）、400 mM NaC1、，0.1 mM EDTA、0.1 mM EGTA、0.1%Nonidet P-40、1 mM二硫苏糖醇和罗氏完全蛋白酶抑制剂混合物），或在含有苯甲酸酶核酸酶的非变性裂解缓冲液中（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、137 mM NaCl、2 mM EGTA、1.5 mM MgCl2、10%甘油、1 mM二硫苏糖醇、苯甲酸酶核酸酶（125 U；70446–3，Novagen）和罗氏完全蛋白酶抑制剂混合物）。样品在18000×克在4℃下培养10分钟，所得上清液（核提取物）与Dynal Protein G珠（Invitrogen）在4℃培养3小时。去除珠子后，将提取物分成两半。其中一半在4°C下用与GFP抗体结合的Dynal Protein G珠培养3小时，而另一半则用先前暴露于重组GFP（ab84191，Abcam）的相同抗体结合珠培养，以掩盖抗原结合位点。用不含二硫苏糖醇的1×SDS样品缓冲液在37°C下孵育30分钟，洗脱与珠结合的蛋白质。然后通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳和银染色对其进行分离。通过液相色谱法和串联质谱法以及纳米UPLC Q-TOF MS/MS系统（SYNAPT G2，Waters）鉴定目标蛋白。

免疫沉淀和免疫印迹分析

请求详细协议

用上述RIPA缓冲液从E10.5胚胎或未分化P19细胞制备的核提取物在4°C下培养3小时，首先用Dynal Protein G珠单独培养，然后用抗体结合珠培养。与抗体结合珠结合的蛋白质用不含二硫苏糖醇的1×SDS样品缓冲液在37℃孵育30分钟洗脱，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜。然后用一级抗体、辣根过氧化物酶结合二级抗体和ECL Plus试剂（RPN2133，Amersham）对膜进行免疫印迹分析。

世系追踪

请求详细协议

口服1 ml玉米油（C8267，Sigma-Aldrich）中的他莫昔芬（6 mg；T5648，Sigma-Aldrich）至Fam60a-CreERT2:：ROSA26RlacZ公司8周龄小鼠。他莫昔芬给药后1、3或5天，处死小鼠，取出十二指肠，然后在4°C的磷酸盐缓冲盐水（PBS）中固定过夜，该盐水含有1%多聚甲醛、0.2%戊二醛和0.02%诺奈德P-40。的表达式lacZ公司如前所述，通过X-gal染色检测转基因(Saijoh等人，1999年).

原位杂交和组织学

请求详细协议

胚胎在PBS中解剖并用4%多聚甲醛固定。用全山制剂进行原位杂交(Sakai等人，2001年)或节(Yashiro等人，2000年). 的3′非翻译区Fam60a系列用作原位杂交的探针。为了进行组织学分析，胚胎用4%多聚甲醛固定，脱水，并包埋在石蜡中。根据标准程序，用苏木精-伊红对连续切片（厚度为7µm）进行染色。

抗体

通过注射与小鼠蛋白COOH末端区域相对应的合成肽（EEQGPAPLPISTQEW），在兔子体内产生Fam60a抗体（α-E15W），并进行亲和纯化。其他抗体包括对照兔IgG（Kamiya Biomedical或Thermo Fisher Scientific）、可避免检测用于免疫沉淀的变性兔IgC的鼠抗兔IgG的构象特异性单克隆抗体（#3678，细胞信号），以及抗GFP的兔多克隆抗体（598，MBL International），至Hdac1（ab31263，Abcam）、FLAG（F3165，Sigma-Aldrich）、Hdac2（ab7029，Abcam）、Sin3a（sc-994，Santa Cruz Biotechnology）、Ing2（ab109504，Abcan）、RbAp46/48（39199，Active Motif）、AcH3K9（39917，Active Moti）、BrdU（347580，BD Biosciences）和5hmC（39769，Active Mothif）。用于免疫染色的FLAG小鼠单克隆抗体来自Sigma。

胚胎免疫染色

请求详细协议

冷冻切片与一级抗体在4°C下孵育过夜。用辣根过氧化物酶结合二级抗体（ImmPRESS试剂，Vector labs）或Alexa Fluor 488结合二级抗原（分子探针）检测免疫复合物。细胞核用4'，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）复染。使用共焦显微镜（Olympus FV1000D或Zeiss LSM510META）获取共焦图像。

BrdU掺入分析

请求详细协议

怀孕小鼠腹腔内注射未稀释的BrdU标记试剂（RPN20LR，Amersham），剂量为每100 g体重1 ml。在注射BrdU 30分钟后解剖胚胎，并按照前面所述进行BrdU免疫染色(Santarelli等人，2003年)使用Vectastain ABC试剂盒（Vector labs）和二氨基联苯胺。增殖指数计算为BrdU掺入阳性细胞的百分比。

RT-qPCR分析

请求详细协议

使用TRIzol试剂（15596026，Invitrogen）从E9.5胚胎中分离出总RNA，并使用带有gDNA擦除器的PrimeScript RT试剂盒（RR047A，Takara）对部分RNA（1/20µl）进行RT。使用Power SYBR Green PCR Master Mix（4367659，Applied Biosystems）对得到的cDNA（对应于15的RNA量，或0.92 ng的β-actin qPCR）进行实时PCR分析。为了定量mRNAs，我们用已知浓度的RNA系列稀释液建立了标准曲线。数据通过β-肌动蛋白mRNA丰度进行标准化。PCR引物（正向和反向）分别为：5′-GGTCATCACTGTGCAACG-3′和5′-ACGGATGCAACTACT-3′Actb公司（β-肌动蛋白）；5′-TACCAGGGTAGCAACCCAAT-3′和5′-GGTTTCTGACAGCCCTCTC-3′用于Adhfe1公司; 5′-CTGATGAGAGTTGAGGC-3′和5′-AGCTACAGTTGGAGCCTG-3′用于纳克; 5′-CTGACTTTTTCGGTGGCTACA-3′和5′-GGCGCAGAATGGCTCTTC-3′用于长度9; 5′-GGCCTGCTCCTTTAGTCTC-3′和5′-TGTCAGCCTGTGGCTGTT-3′用于Dchs1公司; 5′-GCTCAGACCACCAGAGAG-3′和5′-TGCTGGTGAGTAGTAGCTGC-3′用于Mxd3型; 5′-GGGGG AATGAGTGCTTGAAG-3′和5′-TCACCTGGACCTCAAATGTC-3′用于AA465934号; 5′-AAAAGAGAACTGCCAACGC-3′和5′-TATCATACCTGGCCGAG-3′用于2610020C07里亚克; 5′-GTAGGGGATCGGACTCTGG-3′和5′-TCCTCCAAGGAATGATCGGC-3′用于Gt（ROSA）26Sor公司; 和5′-CAATTACAGAAGTGGGACT-3′和5′-CACCTTCCCCAGTTCTT-3′Acsl3公司.

ChIP-seq和RNA-seq

请求详细协议

E9.5胚胎中含有Fam60:：维纳斯在PBS中回收转基因用于ChIP，如前所述进行GFP抗体(Hayakawa等人，2007年). 使用SOLiD片段库核心试剂盒（PN 4464412，Life Technologies）将分离的DNA应用于ChIP-seq文库构建。使用SOLiD四仪器（生命技术）进行测序。使用LifeScope软件（Applied Biosystems）将测序读数与小鼠基因组（mm9）对齐。使用MACS版本1.4.1调用对齐峰值，并生成BED和Wig文件(Zhang等人，2008年)文件在UCSC基因组浏览器中显示为自定义轨迹。根据以下标准过滤所称峰：假发现率（FDR）≤1%，折叠富集度≥2.0。为了获得基因周围的峰值分布和平均峰值分布，我们使用CEAS 1.0.2版分析了过滤后的峰值。UCSC RefGene中TSS的过滤峰在±3 kb范围内的基因被定义为Fam60a靶基因。

对于RNA-seq，E9.5胚胎收集在PBS中，并在-80°C下储存在RNAlater（AM7020，Ambion）中。用卵黄囊DNA进行基因分型后，从WT和Fam60a系列–/–使用MicroPoly（a）Purist Kit（AM1922，Life Technologies）提取含有TRIzol试剂和mRNA的胚胎两次。使用SOLiD Total RNA-Seq试剂盒（4445374，Life Technologies）进行文库准备。对每个基因型的三个生物重复进行分析。图书馆用不同的条形码适配器进行标记。使用SOLiD4仪器进行测序，并使用LifeScope软件将测序数据映射到小鼠基因组（mm9）。用edgeR Bioconductor软件包鉴定差异表达基因。FDR<0.01的转录物被认为是显著上调或下调的。

亚硫酸氢盐测序

请求详细协议

从WT和Fam60a系列–/–胚胎按照标准程序，用分光光度法测定其浓度。用亚硫酸氢盐处理DNA（500至1000 ng）并使用EpiTect亚硫酸氢试剂盒（59104，Qiagen）纯化，然后使用以下引物集进行PCR扩增：5′-ATTTAGTGGGGTTTTGTTATTG-3′（Adhfe1 Bis F1）和5′-TATTTACACATAACATACCATAC-3′（Adfe1 Bis R1）初始PCR和Adhfe1 Bis F1和5′-ACTAAACACACATACCATCCC-3′（Adhfe1-Bis R2）半嵌套PCR；5′-TGGAAGGAGGTTAAGTAG-3′（Leng9 Bis F1）和5′-AAATATACTAAACCCTC-3′（Leng 9 Bis R1）；5′-ATTTTTAGGAGTTTAGTTGGGGTG-3′（Nagk Bis F1）和5′-CAACTACACACACTCCAAATTAAC-3′（Nagk BisR1）；5′-AGAGGTGTATGTTGTAGAGTAGTTAGGTG-3′（Peg3 Met11）和5′-CATCCCATCCCCCCCCTCCAAACTCTAC-3′（Peg3 Met12.1）；和5′-GTATTTAGTTTATTATGAGAGAGAGATT-3′（Kcnq1ot1 1F）和5′-CAAAAACTACCAAAAAACTATAA-3′（K cnq1ot 1 1R）。用琼脂糖凝胶电泳分离扩增片段并切除靶带。使用QIAquick凝胶提取试剂盒（28706，Qiagen）从切除的凝胶片中回收DNA，然后使用双启动子TA克隆试剂盒（K207020，Invitrogen）将其克隆到pCRII载体中。用QUMA工具（甲基化分析定量工具；网址：http://quma.cdb.riken.jp).

Fam60a和FLAG-Tet1的强制表达

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将NIH3T3 Tet-On 3G成纤维细胞（631197，Clontech）接种在直径为15 mm、涂有0.1%明胶的盖玻片上，约80%的融合处，并放置在24孔板中。将细胞在补充有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基中在37°C下培养至少2小时，然后用125 ng pTRE3G-FLAG-Tet1（编码FLAG标记的小鼠Tet1）转染24小时，加入或不加入250 ng pEF-BOS-Fam60a-IRES-Venus（编码小鼠Fam60a和Venus）使用Lipofectamine LTX试剂（15338500，Invitrogen）。未转染或转染pEF-BOS-Fam60a-IRES-Venus的细胞也分别转染375或125 ng的pEF-BOS空载体。通过将细胞暴露于多西环素（1µg/ml）24小时诱导FLAG-Tet1的表达，然后用4%多聚甲醛在PBS中固定15分钟，用0.2%Triton X-100在PBS内渗透15分钟，使用2 M HCl处理20分钟，用100 mM Tris-HCl（pH 8.0）中和10分钟，用PBS洗涤，并在室温下暴露于封闭缓冲液中1小时（1%牛血清白蛋白和PBS中0.1%吐温20）。然后，在4°C下将细胞与FLAG的小鼠单克隆抗体（1:2000稀释）和5hmC的兔多克隆抗体（1:1000稀释）在封闭缓冲液中孵育过夜。分别用Alexa Fluor 568或Alexa Fluor 647结合二级抗体（分子探针）检测免疫复合物，并用DAPI（250 ng/ml）对细胞核进行染色。将细胞安装在ProLong Gold防褪色试剂（P36930，Invitrogen）中，并用共焦显微镜（Olympus FV1000D）获取图像。将5hmC的荧光强度与FLAG的荧光强度进行对比。如果FLAG荧光强度>40，则认为该细胞为FLAG-Tet1阳性；如果5hmC荧光强度>30，则认为该细胞为5hmC阳性。

ChIP-qPCR

请求详细协议

如上所述进行ChIP，并使用以下引物（分别正向和反向）对沉淀的DNA进行qPCR分析：5′-CTAGCCACGAGAGAGAGAAG-3′和5′-AGCTTTTGCAGCTCTC-3′Actb公司; 5′-GACCGGATTGGCTGTGTGTAGTG-3′和5′-TAGGTGCCGAGAGTGTG-3′用于Adhfe1公司; 5′-CTAGGAGAGAGAGCGCAGACC-3′和5′-GGCGTCAGAGTGTGAGATCA-3′用于冷9; 5′-CTGAGATTCATGCACAAGG-3′和5′-TATAGGAACCAGGCGTTC-3′用于纳克; 5′-GCGAGACACTCACTGACTC-3′和5′-AGTGTTGGTGGTGCTTGAG-3′用于Dchs1公司; 5′-GTGGACGACACTCGCGTAC-3′和5′-AATGGCCCTAATGAGACG-3′用于Mxd3型; 5′-TTGGGAATCCAGTGAAACT-3′和5′-AGCCATGCACAAAGTTCG-3′用于Acsl3公司; 5′-CTGGAGTGCAGATCACG-3′和5′-CCTTTTCTGGGAGTCTCTGC-3′用于Gt（ROSA）26Sor公司; 5′-TAAGAGAAACTGCCAACGC-3′和5′CTCATAGGACGTTCTGGC-3′用于2610020C07瑞克; 和5′-CTGTCAAGACTGCGGAATG-3′和5′-CTCGAAGCCATCTGGTAG-3′用于AA465934号. 

hMeDIP分析

请求详细协议

E9.5胚胎在PBS中回收并储存在-80°C下。基因分型后，在含有20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、，

4 mM EDTA、20 mM NaCl、1%SDS和蛋白酶K（0.4 mg/ml，Nacalai）。然后在37°C下将其暴露于RNase A（5 mg/ml，Sigma）中30分钟，然后首先通过酚-氯仿处理和乙醇沉淀纯化基因组DNA，然后使用QIAamp DNA Micro Kit（56304，Qiagen）。使用生物破坏者UCD-250（Diagenode）对DNA进行剪切（低功率下15秒开启，15秒关闭，持续10分钟）。将剪切DNA的部分（500 ng）在98°C下变性10分钟，置于冰上，然后在4°C下在100µl含有20mM Tris-HCl（pH 8.0）、2mM EDTA、150mM NaCl、1%Triton X-100、4µg 5hmC抗体和1%牛血清白蛋白的hMeDIP缓冲液中旋转孵育过夜。然后将Dynal Protein G珠添加到样品中以沉淀抗体-DNA复合物，然后用hMeDIP洗涤缓冲液（20 mM Tris-HCl（pH 8.0）、2 mM EDTA、300 mM NaCl、1%Triton X-100、0.1%SDS）将珠洗涤三次，然后在55°C下用蛋白酶K在hMeDIP洗脱缓冲液中处理过夜（20 mM-Tris-HCl（pH 8.0）、，8 mM EDTA、300 mM NaCl、0.5%十二烷基硫酸钠）。使用QIAquick PCR纯化试剂盒（28106，Qiagen）纯化洗脱的DNA，并使用上述ChIP-qPCR引物进行qPCR分析。

甲基seq文库建设

请求详细协议

使用SureSelect Methyl-Seq靶向富集系统（安捷伦科技公司）从3µg基因组DNA制备与Illumina平台兼容的文库。用聚焦超声仪E220（Covaris）在4°C下通过聚焦超声破坏基因组DNA（占空比，10%；PIP，175；每脉冲周期，200；时间，360 s）。将片段DNA末端修复，在3′端进行腺苷酸化，并连接到甲基化适配器。将制备的文库与生物素化的SureSelect Methyl-Seq Capture Library（安捷伦科技公司）进行杂交，该文库涵盖总计109Mb的基因组区域，包括GENCODE启动子；CpG岛屿、海岸和大陆架；DNase I–超敏位点；和RefGenes。在PCR扩增之前，使用链霉亲和素结合珠收集重叠靶区的文库分子，并使用EZ甲基化金试剂盒（Zymo Research）与亚硫酸氢盐进行转化。使用SureSelect Methyl-Seq索引引物（安捷伦科技公司）进行进一步扩增，以便在Illumina平台上进行多重测序。

甲基seq和DMR的检测

请求详细协议

在快速运行模式下，用Illumina HiSeq 1500仪器以2×127个周期对扩增的文库补充20%的phiX测序对照文库进行测序。序列读取是通过HiSeq控制软件（HCS）2.2.58版和实时分析（RTA）1.18.64.0版获得的。使用FastQC版本0.11.5对获得的成对末端读数进行质量控制(https://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/)使用Trim Galore！删除了适配器序列和低质量读取！版本0.4.2，参数为'-e 0.1-q 30'(http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/trim_galore). 在Bowtie2版本2.3.0中删除phiX-derived读取之后(Langmead和Salzberg，2012年)，使用Bismark 0.17.0版将有效读数映射到UCSC mm9参考基因组序列(克鲁格和安德鲁斯，2011年)并使用参数“--bowtie2-N 1 L 22--score_min L，-0.6，-0.6”。在每个CpG位点进行甲基化调用之前，使用Bismark和Samtools 1.3.1版从预期链（参考基因组序列的原始底部链）中删除了潜在的PCR重复项，仅提取了读路径(Li等人，2009年)分别为。使用Picard软件包2.8.1版的CollectHsMetrics计算映射读取的诱饵覆盖率(http://broadinstitute.github.io/picard网站). 甲基化CpG是使用bismark的bismark_methylation_extractor函数和参数“--cutoff 5”进行鉴定的。为了比较文库之间的甲基化谱，我们根据Ward的方法使用甲基试剂盒程序1.0.0版进行了分层聚类分析(Akalin等人，2012年)在Bioconductor包中。为了检测三个突变胚胎和三个WT胚胎中的DMR，我们使用了BSseq 1.10.0版(Hansen等人，2012年)在Bioconductor包中。导入Bismark输出的CpG报告文件后，使用BSseq算法处理BSseq数据，以计算平滑甲基化水平。在这两个比较组的三个样本中，至少有两个样本的CpG位点的读取覆盖率至少为五次的区域选择平滑甲基化数据。然后用t统计量对突变体和WT样品进行比较。根据阈值“qcutton（low=0.025，high=0.975）”检测DMR，并进一步缩小到那些至少有三个CpG位点且平均甲基化差异≥0.05的DMR。为了检查DMR和Fam60a-ChIP-seq峰区之间的关系，根据基因组位置合并两个ChIP-se分析的峰，然后使用2.26.0版床具将合并的峰与DMR进行比较(http://bedtools.readthedocs.io). 重叠区域通过使用CEAS 0.9.9.7版对启动子、外显子、内含子、非翻译区（UTR）和远端基因间区域等基因组特征的峰值富集进行统计评估来表征(Shin等人，2009年)，TSS附近的平均剖面图是用GREAT 3.0.0版绘制的(McLean等人，2010年). 利用UCSC集成基因组查看器（IGV）2.3.72版显示印迹基因和DMR的甲基化水平(Thorvaldsdóttir等人，2013年).

分子系统发育学

请求详细协议

aLeaves收集了与人类Fam60a相似的氨基酸序列(Kuraku等人，2013年)，然后修改生成的序列集以删除冗余序列。修改后的序列集首先使用程序MAFFT v7.299b进行多重校准(Katoh和Standley，2013年)使用选项“-linsi”，然后使用程序trimAl v1.4.rev15修剪未对齐和有间隙的场地(Capella Gutiérrez等人，2009年)依次使用选项“-automated1”和“-nogaps”。获得的序列文件用于通过RAxML v8.2.8程序推断最大似然树(Stamatakis，2014年)根据PROTCATWAG模型和1000个引导重采样。

数据可用性

请求详细协议

RNA-seq、ChIP-seq和Methyl-seq数据已保存在日本DNA数据库（DDBJ）中，注册号分别为DRA004841、DRA00484和DRA006579。

统计分析

请求详细协议

定量数据以平均值±标准差表示，并与未配对学生的t吨测试。p值<0.05被认为具有统计学意义。

数据可用性

RNA-seq、ChIP-seq和Methyl-seq数据已保存在日本DNA数据库（DDBJ）中，注册号分别为DRA004841、DRA00484和DRA006579。

生成了以下数据集

工具书类

    1. 格曾达A
    2. 隆伯格G
    3. 张JS
    4. 乌鲁西亚R
    (2009) Sin3：主支架和转录辅抑制因子
    生物化学与生物物理学报（BBA）-基因调控机制 1789:443–450.
    https://doi.org/10.1016/j.bbagrm.2009.05.007

文章和作者信息

作者详细信息

  1. Ryo Nabeshima先生

    1. 日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    2. 日本神户RIKEN发育生物学中心生物模式实验室
    贡献
    概念化、监督、资金获取、项目管理、写作审查和编辑
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-5096-8306号

  2. 西村修（Osamu Nishimura）

    1. 日本神户里肯生命科学技术中心植物信息学部门
    2. 日本神户理研生物系统动力学研究中心系统信息学实验室
    贡献
    概念化、形式分析、调查、方法论、撰写初稿
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0003-1969-2580

  3. 前田孝子

    日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    贡献
    数据管理、软件、形式分析、调查、方法
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  4. 清水夏目漱石

    日本神户RIKEN发育生物学中心生物模式实验室
    贡献
    形式分析、调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0003-2671-4813

  5. 高弘艾德

    日本神户RIKEN发育生物学中心生物模式实验室
    贡献
    软件、形式分析、调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0003-0709-4057

  6. 肯塔·亚西罗

    日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    贡献
    形式分析、调查、方法
    与
    Hidetaka Shiratori公司
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  7. 酒井雅雄

    日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    贡献
    形式分析、调查
    竞争性利益
    未申报竞争利益

  8. 奇卡拉·梅诺

    日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    贡献
    资源、调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  9. Mitsutaka Kadota公司

    1. 日本神户里肯生命科学技术中心植物信息学部门
    2. 日本神户里肯生物系统动力学研究中心植物信息学实验室
    贡献
    资源，调查
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  10. Hidetaka Shiratori公司

    日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    贡献
    软件、形式分析、调查
    与
    肯塔·亚西罗
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益

  11. Shigehiro Kuraku先生

    1. 日本神户里肯生命科学技术中心植物信息学部门
    2. 日本神户里肯生物系统动力学研究中心植物信息学实验室
    贡献
    调查、方法
    用于通信
    shigehiro.kuraku@riken.jp
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0003-1464-8388

  12. 滨田浩史

    1. 日本大阪大学前沿生物科学研究生院发育遗传学小组
    2. 日本神户RIKEN发育生物学中心生物模式实验室
    贡献
    概念化、形式分析、调查、项目管理、写作审查和编辑
    用于通信
    hiroshi.hamada@riken.jp
    竞争性利益
    没有宣布竞争利益
    ORCID图标 “此ORCID iD标识了本文的作者：”0000-0002-7196-5948

基金

教育、文化、体育、科学和技术部（25251029）

  • 滨田浩史

资助者不参与研究设计、数据收集和解释，也不参与将研究成果提交出版的决定。

鸣谢

我们感谢伊藤信介的Tet表达载体和讨论；木村浩史和丰田顺介讨论；Kaori Tatsumi和RIKEN生物系统动力学研究中心多倍体信息学实验室的其他成员，用于生成甲基seq数据；以及福本明美、池川雅也和西村博美，以获得技术援助。这项研究得到了日本文部科学省的资助（25251029）。

伦理学

动物实验：所有小鼠实验均获得大阪大学和RIKEN发育生物学中心相关委员会的批准，许可证号FBS-12-019和AH28-01

版本历史记录

  1. 收到日期：2018年3月6日
  2. 接受日期：2018年7月10日
  3. 发布的记录版本：2018年8月2日（第1版）

版权

©2018，Nabeshima等人。

本文根据知识共享署名许可协议，允许不受限制地使用和重新分发，前提是原始作者和来源得到了认可。

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  1. Ryo Nabeshima先生
  2. 西村修（Osamu Nishimura）
  3. 前田孝子
  4. 清水夏目漱石
  5. 高弘艾德
  6. 肯塔·亚西罗
  7. 酒井雅雄
  8. 奇卡拉·梅诺
  9. Mitsutaka Kadota公司
  10. Hidetaka Shiratori公司
  11. Shigehiro Kuraku先生
  12. 滨田浩史
(2018)
Fam60a（一种Sin3a亚单位）的缺失导致胚胎致死，并与基因启动子子集的异常甲基化有关
电子生活 7：e36435。
https://doi.org/10.7554/eLife.36435

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