The Sin3a repressor complex is a master regulator of STAT transcriptional activity

doi:10.1073/pnas.1206458109

.2012年7月24日；109(30):12058-63.

doi:10.1073/pnas.1206458109。 Epub 2012年7月10日。

Sin3a阻遏物复合体是STAT转录活性的主调节器

劳拉·伊卡迪¹, 拉斐尔·莫里, 维奥拉·盖塞尔琴, 斯文·埃克曼, 洛德·德·考沃, 朱迪思·维赫斯特, 科恩·韦考特伦, Xavier Saelens公司, 菲利普·穆勒曼, Geert Leroux-Roels公司, 卡罗琳·德博舍尔, 迈克尔·布特罗斯, Jan Tavernier公司

附属公司

PMID： 22783022
预防性维修识别码：项目经理3409767
内政部： 10.1073/第12065458109页

Sin3a阻遏物复合体是STAT转录活性的主调节器

劳拉·伊卡迪等人。美国国家科学院程序. 2012.

.2012年7月24日；109（30）：12058-63。

doi:10.1073/pnas.1206458109。 Epub 2012年7月10日。

作者

劳拉·伊卡迪¹, 拉斐尔·莫里, 维奥拉·盖塞尔琴, 斯文·埃克曼, 洛德·德·考沃, 朱迪斯·韦尔斯特, 科恩·韦考特伦, Xavier Saelens公司, 菲利普·穆勒曼, Geert Leroux-Roels公司, 卡罗琳·德博舍尔, 迈克尔·布特罗斯, Jan Tavernier公司

附属

¹比利时根特9000 Vlaams Instituut voor Biotechnologie医学蛋白质研究部。

PMID： 22783022
预防性维修识别码：项目经理3409767
内政部： 10.1073/pnas.1206458109

摘要

酪氨酸磷酸化是STAT蛋白活化的标志，但其转录活性也取决于其他二次修饰。I型干扰素可以激活ISGF3（STAT1:STAT2:IRF9）复合物和STAT3，但具有细胞特异性，只能选择性触发ISGF3转录程序。在全基因组RNAi筛选后，我们确定SIN3转录调节器同源物a（Sin3a）是STAT3靶向转录抑制的重要介体。Sin3a直接与STAT3相互作用并促进其脱乙酰化。SIN3A沉默导致活化STAT3的核滞留时间延长，并增强其向SOCS3启动子的募集，同时伴有组蛋白高乙酰化和STAT3依赖性转录增强。相反，Sin3a是ISGF3依赖性基因转录和有效IFN介导的抗病毒保护抵抗甲型流感和丙型肝炎病毒所必需的。因此，Sin3a复合体作为一个上下文相关的ISGF3/STAT3转录开关。

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利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

数字

**图1。**
全基因组RNAi筛选确定Sin3a复合体是STAT3转录活性的负调控因子。(A类)用rPAP1-荧光素酶报告子瞬时转染Hek293T细胞。24小时后，将细胞置于非刺激状态（NS）或用LIF或IFN-α2刺激24小时以进行荧光素酶检测或30分钟以进行磷酸-STAT3检测。荧光素酶读数表示为刺激值和非刺激值之间的比率****P（P）*< 0.001;t吨测试。用抗磷酸化STAT3（Tyr705）和抗STAT3抗体印迹总细胞提取物。(B类)全基因组RNAi筛选策略。使用稳定表达rPAP1荧光素酶报告子的Hek293细胞。靶向潜在STAT3阻遏物的siRNAs将释放STAT3转录刹车并激活rPAP1-荧光素酶报告子（井为黄色），但在含有无关siRNAs（井为灰色）的井中，STAT3活性将受损。内部控制采用白色井。详细的筛选程序在*SI材料和方法*. (C)大多数siRNA表型表现为正态分布数据（线）。偏离正态分布的尾部代表具有显著表型的siRNA（阻遏候选基因）。屏幕中标识的Sin3a复杂组件高亮显示。(D类)24小时后，用指示的siRNA和rPAP1-荧光素酶报告子瞬时转染Hek293T细胞。*雷尼利亚*以荧光素酶siRNA为对照。48小时后，不刺激或用LIF刺激细胞。萤光素酶读数表示为对照沉默NS条件下的比率****P（P）*< 0.001; 采用Bonferroni检验的单向方差分析。(E类)Hek293T、MCF7和HepG2细胞转染对照(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，在不含FCS的情况下培养细胞4小时，然后用LIF或IL-6非刺激或刺激1小时。图中显示了相对于NS样品的mRNA水平****P（P）*< 0.001; 采用Bonferroni检验的单向方差分析。结果代表了三个独立实验。误差条表示SD为三倍

**图2。**
Sin3a与STAT3相互作用并修改其乙酰化模式。(A类)Hek293T细胞在没有FCS的情况下培养4 h，然后用LIF刺激指定的时间点。制备核裂解物，免疫沉淀内源性Sin3a，并显示与抗STAT3抗体共沉淀的内源性STAT3。使用抗Sin3a抗体显示沉淀的Sin3a。(B类)Etag-STAT3截断突变体的示意图。DBD，DNA结合域；SH2，Src同源性2；TAD，事务激活域。用编码GFP-Sin3a和Etag-STAT3截短突变体的质粒转染Hek293T细胞。Sin3a被免疫沉淀，Etag-STAT3突变体与抗Etag抗体共沉淀。以总裂解物作为负荷控制。星星表示特定的波段。(C)*大肠杆菌*用编码GST-STAT3 N端（1-130）、C端（131-770）、GST-MAD1（阳性对照）或GST单独（阴性对照）的质粒转化BL21DE3细胞。细胞裂解物与体外转录和翻译的Flag-Sin3a蛋白孵育。使用谷胱甘肽琼脂糖珠沉淀复合物，并用抗flag抗体显示。GST转化的细菌裂解物用抗GST抗体进行印迹，以控制蛋白质的产生和溶解度。星星表示特定的波段。(D类)Hek293T细胞转染对照组(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，在没有FCS的情况下培养细胞4小时，然后用LIF刺激30分钟。制备核提取物并免疫沉淀乙酰化赖氨酸。STAT3与抗STAT3抗体共沉淀。使用特定抗体检测核裂解物中的内源性Sin3a和STAT3水平。(E类)Hek293T细胞转染编码GFP-Sin3a和Etag-STAT3 WT、乙酰化修饰（K49/87Q和K685Q）或乙酰基缺失（K49/77R和K685 R）突变体的质粒。Sin3a被免疫沉淀，共沉淀的Etag-STAT3突变体被发现带有抗Etag抗体。以总裂解物作为负荷控制。结果代表了三个独立的实验。

**图3。**
Sin3a复合物负调控STAT3依赖基因子集的转录。(A类)显示用对照siRNA转染细胞中LIF诱导基因数量的文氏图(*雷尼利亚*荧光素酶，黄色），带*新加坡3A*siRNA（蓝色），或在两种条件下（绿色）。作为截止点，一根圆木₂-比值>1（上调两倍以上）用于分析基因表达谱。(B类)对照组转染MCF7细胞(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，不刺激或用LIF刺激细胞。图表表示与NS样本相关的mRNA水平。结果代表了三个独立实验。误差条表示SD为三倍****P（P）*< 0.001; 采用Bonferroni检验的单向方差分析。

**图4。**
Sin3a复合物负性调节STAT3核的分布并与*SOCS3系列*基因启动子。(A类)Hek293T细胞转染对照组(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，在无FCS的情况下培养细胞4小时，然后用LIF刺激指定时间。对细胞进行固定和染色，并通过共聚焦分析评估STAT3和Sin3a的定位。显示了代表性细胞场的免疫荧光。（放大倍数：63×。）(*B–E类*)Hek293T细胞稳定转染加扰或*新加坡3A*-针对shRNAmir。转染和沉默效率报告于图S3转染细胞在无FCS的情况下培养4 h，然后用LIF刺激指定的时间点。进行ChIP分析以检查Sin3a的占用情况(B类)，状态3(C)，磷酸二(D类)组蛋白3（H3）K27乙酰化的乙酰化状态(E类)在上*SOCS3系列*发起人。免疫沉淀DNA通过定量PCR定量。图表表示相对于NS样本的占有率水平（折叠诱导）。结果代表了三个独立实验。错误栏指示重复的SD。

**图5。**
Sin3a复合物是IFN刺激的ISG转录和有效抗病毒反应对抗甲型流感和丙型肝炎病毒所必需的。(A类)代表差异基因表达谱的火山图（以对数表示₂折叠更改）*新加坡3A*-沉默与对照MCF7细胞。下调的ISGF3应答基因被强调。(B类)用对照siRNA转染Hek293T细胞(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72 h后，用IFN-α2刺激细胞24 h，并评估IFITM的mRNA水平。误差条表示SD为三倍****P（P）*< 0.001; 采用Bonferroni检验的单向方差分析。(C)用对照siRNA转染Hek293T细胞(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，细胞在暴露于A/PR8/34流感病毒14小时前，不受IFN-α2刺激或刺激24小时。通过病毒蛋白M2的免疫染色和流式细胞仪分析评估感染效率。(D类)用对照siRNA转染Huh7.5细胞(*雷尼利亚*荧光素酶）或*新加坡3A*小干扰RNA。72小时后，在暴露于HCV 48小时之前，用IFN-α2（1 ng/mL）刺激细胞24小时。通过病毒蛋白NS5A的免疫染色评估感染效率。结果代表了至少两个独立的实验。

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