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.2021年2月；20（2）：e13306。
doi:10.1111/acel.13306。 Epub 2021年1月15日。

JUNB-FBXO21-ERK轴通过抑制自噬促进骨关节炎软骨变性

林志明 1, 苗嘉宁 2, 张涛（Tao Zhang） 三, 明和 1, 王子源 1, 信源峰 1, 白伦浩 1
附属公司

JUNB-FBXO21-ERK轴通过抑制自噬促进骨关节炎软骨退化

林志明等。 老化细胞. 2021年2月.

摘要

骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种异质性疾病，由于其发病机制的复杂调控网络，特别是软骨变性，极难治愈。FBXO21是泛素E3连接酶的一个亚单位，通过泛素化降解P-糖蛋白和EID1并激活JNK和p38通路；然而，其在OA中的作用仍然未知。在这里，本研究的主要目的是评估FBXO21在OA退行性变中的潜在作用和机制，我们发现FBXO21.在OA患者、老龄化和碘乙酸单钠诱导的OA大鼠的软骨中上调，以及经白细胞介素-1β、肿瘤坏死因子-α和脂多糖治疗的软骨细胞中上调。此外，FBXO21的体内和体外敲除抑制了OA相关的软骨退化，如激活的自噬、上调的合成代谢、减轻的凋亡和下调的分解代谢。相反，它的过度表达促进了OA相关的软骨退化。此外，利用质谱和免疫共沉淀分析，我们证明FBXO21的下游机制通过与ERK相互作用和磷酸化抑制自噬。此外，FBXO21-通过抑制大鼠软骨细胞的自噬，减轻合成代谢，增强凋亡和分解代谢。有趣的是，对于其上游机制，JUNB通过直接靶向FBXO21启动子促进FBXO21-表达，从而进一步加速SW1353细胞和大鼠软骨细胞中的软骨退化。总之，我们的研究结果表明，JUNB-FBXO21-ERK轴通过抑制自噬来调节OA凋亡和软骨基质代谢。因此，FBXO21是一个很有吸引力的调节OA发病机制的靶点，其敲除可能为OA提供一种新的靶向治疗。

关键词：ERK；FBXO21；六月；自噬；软骨变性；代谢；骨关节炎；胡扯。

PubMed免责声明

利益冲突声明

未申报。

数字

图1
图1
接受全膝关节置换术的膝关节骨性关节炎（OA）患者关节软骨损伤区FBXO21的表达上调。（a） 平片和磁共振成像（MRI）扫描(n个 = 3). A–P：前-后。（b） Alcian Blue、Safranin O和甲苯胺Blue染色和（c）国际骨关节炎研究协会（OARSI）对OA患者未受损（U）和受损（D）软骨组织的评分(n个 = 12). 蓝色方框和箭头表示未受损（U）软骨，红色方框和箭头代表受损（D）软骨。黑框表示放大倍数较高的图像。（d） FBXO21、COL2A1和MMP13的免疫印迹，以及（e）利用热图量化未受损（U）和受损（d）区域中FBXO22的相对蛋白水平，以β-actin作为内源性控制(n个 = 24). U‐04：患者的未受损（U）区域‐04；D‐04：患者受损（D）区域‐04。患者04-06的年龄分别为68岁、75岁和73岁。数据表示为平均值±SD****第页 < 0.0001
图2
图2
FBXO21在OA大鼠关节软骨和软骨细胞中积聚。（a） 衰老（中）和碘乙酸单钠（MIA）（右）OA大鼠模型的大体成像、平片和磁共振成像（MRI）扫描。射线照相显示整个膝盖结构（左）。M： 月份；Ctrl：盐分控制；W： 周。（b） 宏观评分。在（c）衰老和MIA OA大鼠模型和（e）白细胞介素（IL）-1β、肿瘤坏死因子（TNF）-α和脂多糖（LPS）刺激的软骨细胞中，FBXO21、COL2A1和MMP13的免疫印迹（上部）结果和FBXO21-的定量（下部），以β-actin为内源性控制。（d） 使用Alcian Blue、藏红O或甲苯胺蓝和COL2A1免疫组织化学（IHC）染色鉴定大鼠软骨细胞。数据表示为平均值±SD；ns：不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页 < 0.001, ****第页 < 0.0001
图3
图3
FBXO21敲除抑制MIA治疗大鼠和IL‐1β治疗大鼠软骨细胞中OA相关变性。（a） 用携带FBXO21特异性敲除（KD）shRNA和过表达（OE）质粒的腺病毒（Ad）治疗的碘乙酸单钠（MIA）OA大鼠模型的实验图。在10周龄时对大鼠进行评估。第一：第一；第二：第二；第三：第三；d： 天。（b） MIA‐2W OA大鼠的大体成像、平片和MRI扫描。形成了KD‐Ad‐shRNA-NC（KD-NC）、KD­Ad-shRNA-FBXO21-01（KD-01）和KD‐的Ad-shRNA‐FBXO21‐02（KD-02）组。NC：阴性对照。（c） 大鼠膝关节及其矢状切面的甲苯胺蓝染色（左）。方框区域表示放大倍数更高。Ctrl：盐分控制。（d）大鼠膝软骨和（e）大鼠软骨细胞中FBXO21、COL2A1、Aggrecan、MMP3、MMP13、LC3、Beclin1、Bcl2和Bax的免疫印迹结果，β-actin作为内源性控制。2瓦：MIA‐2瓦；20:20 ng/ml白细胞介素（IL）‐1β。（f） FBXO21敲除后软骨细胞中mRFP‐GFP‐LC3腺病毒双标记。mRFP（红色）表示自溶体（ALs）；合并（黄色）表示自噬体（AP）。（g） 用透射电镜观察软骨细胞内AP的超微结构特征。黑框表示放大倍数更高。蓝色箭头表示AP
图4
图4
FBXO21过度表达促进MIA治疗大鼠和IL‐1β治疗大鼠软骨细胞OA相关变性。（a） FBXO21过表达（OE）腺病毒（Ad）转染MIA‐2 W OA大鼠后的大体成像、平片和磁共振成像（MRI）扫描，分为OE-Ad-NC（OE-NC）和OE-Ad-FBXO21-3xflag（OE-FBXO21）。NC：阴性对照。（b） 宏观评分。（c） 大鼠膝关节及其矢状切面的甲苯胺蓝染色（左）。方框区域表示放大倍数更高。以β-actin为内源性对照，对（d）大鼠膝软骨和（f）大鼠软骨细胞中的FBXO21、COL2A1和MMP13进行定量实时（qRT）-PCR分析。2瓦：MIA‐2瓦；20:20 ng/ml白细胞介素（IL）‐1β。FBXO21、COL2A1、Aggrecan、MMP3、MMP13、LC3、Beclin1、Bcl2和Bax的免疫印迹结果，以β-actin为内源性控制，在SD大鼠（e）膝软骨和（g）大鼠软骨细胞中。（h） mRFP‐GFP‐LC3腺病毒双标记和（i）软骨细胞中每细胞GFP和mRFP点的定量。mRFP（红色）代表自溶体（AL），Merge（黄色）代表自噬体（AP）。（j） 用透射电镜观察软骨细胞内AP的超微结构特征。黑框表示放大倍数更高。蓝色箭头表示AP。（k） 流式细胞术分析。数据以平均值±标准差表示；ns：不显著*第页 < 0.05, **第页 < 0.01, ***第页< 0.001, ****第页 < 0.0001
图5
图5
FBXO21通过与ERK相互作用和磷酸化增强OA相关变性，ERK抑制IL-1β处理的大鼠软骨细胞的自噬。（a） 软骨细胞抗FBXO21抗体免疫沉淀（IP）。FBXO21‐IP蛋白复合物用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，考马斯亮蓝染色，蛋白酶消化，并用LC-MS/MS定量。ERK的鉴定肽序列显示为（ALDLLDK）。（b） 用免疫印迹法分析分别由抗FBXO21和抗ERK抗体的软骨细胞免疫沉淀的FBXO21-（上部）和ERK（下部）蛋白。在SD大鼠软骨细胞中转染FBXO21（c）敲除和（d）过表达腺病毒后，以β-actin为内源性对照，pERK和ERK的免疫印迹结果（上部）及其定量（下部）。（e） 用FBXO21击倒腺病毒‐02（KD‐02）和ERK激活剂Honokiol治疗后，LC3和Beclin1的免疫印迹结果（上部）及其定量（下部），以β‐肌动蛋白为内源性对照。（f） mRFP‐GFP‐LC3腺病毒双标记和（g）每细胞GFP和mRFP点的定量。mRFP（红色）表示自溶体；merge（黄色）表示自噬体。（h） 免疫印迹和（i）用KD-02和自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）处理的软骨细胞中COL2A1、Aggrecan、MMP3、MMP13、Bcl2和Bax的定量。（j） 流式细胞术分析和（k）量化。数据表示为平均值±SD；ns：不显著*第页<0.05时**第页 < 0.01, ***第页 < 0.001
图6
图6
JUNB通过促进FBXO21的表达加速OA相关变性。（a） 转录起始位点（TSS）和TSS上游2000‐bp FBXO21启动子区域的JUNB预测结合位点示意图，指定为-1。2000-3000 bp作为阴性对照（NC）。（b） 采用染色质免疫沉淀法（ChIP）对SW1353细胞中的免疫沉淀DNA进行PCR定量，以正常兔IgG为NC。（c）JUNB在膝骨关节炎（OA）患者软骨未受损（U）和受损（D）区域的免疫印迹结果，以β-actin为内源性对照。U‐04：患者的未受损（U）区域‐04；D‐04：患者受损（D）区域‐04。（d） 桑基图所示受损区域肥胖分级、Kellgren-Lawrence分级和JUNB表达之间的关系。（e） 膝OA患者损伤区JUNB和FBXO21表达的线性回归分析(n个 = 24). （f） 转染FBXO21-pEX3过表达质粒（OE-FBXO21）和JUNB敲除质粒的SW1353细胞中JUNB、FBXO21、COL2A1、Aggrecan、MMP3、MMP13、LC3、Beclin1、Bcl2和Bax的免疫印迹结果分为KD‐shRNA-NC（KD-NC）和KD‐的shRNA-JUNB（KD-JUNB）组，以β-actin为内源性对照。（g） JUNB敲除和FBXO21过度表达后SW1353细胞中mRFP‐GFP‐LC3腺病毒双标记。mRFP（红色）表示自溶体；merge（黄色）表示自噬体。（h） 示意图显示了JUNB/FBXO21/ERK轴通过调节OA期间的自噬加速软骨退化的拟议机制。数据表示为平均值±SD；ns：不显著***第页 < 0.001
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