帕金森病灵长类动物模型小肠的收缩功能障碍和氮能失调

激动剂对收缩反应的影响

正常和MPTP回肠制剂对卡巴胆碱的浓度依赖性收缩没有显著差异（图。​（图1g）。1克). 产生LogEC的卡巴胆碱浓度响应曲线₅₀正常回肠和MPTP回肠分别为−6.641至−5.755和−6.558至−6.128。同样，组胺的累积应用（100 nM至100 µM）可使正常回肠和MPTP回肠产生浓度依赖性收缩，但与卡巴胆碱相比，收缩幅度明显较小。正常组织和具有LogEC的MPTP组织的组胺浓度反应曲线没有差异₅₀正常回肠和MPTP回肠分别为-6.68至-3.636和-6.58至-4.371（图。​（图1h）。1小时). 然而，无论采用何种动物治疗，卡巴胆碱和组胺浓度/反应的斜率都不同。

去甲肾上腺素和多巴胺激动剂对自发活动的影响

去甲肾上腺素（NA，10 µM）使正常回肠和MPTP回肠平滑肌的基础静息张力松弛。在正常回肠样本中，NA将基线降低了-0.5 ± 0.09，而在MPTP回肠中，基线下降为-0.3 ± 0.07 g、 但这种差异在统计学上并不显著(P（P） = 0.116;n个 = 7).

MPTP治疗后回肠自发收缩的频率显著增加了30-40%（图。​（图1i）1个)但振幅没有显著降低（图。​（图1d）。1天). 给药NA，多巴胺D1激动剂，A77636（1 µM）或D2激动剂，罗匹尼罗（1 µM）确实影响正常或MPTP回肠的自发收缩频率。然而，只有NA显著降低了正常回肠和MPTP回肠的自发收缩幅度（图。​（图1j）。1日). NA对正常组织和MPTP组织的影响没有差异。

总的来说，运动障碍之间存在正相关（见表​表1）1)TH-ir数量与自发活动频率呈负相关。然而，在后者中，这种关系没有达到统计显著性(P（P） = 0.0589; 图。1千升).

NOS抑制剂对EFS诱发收缩反应的影响

图2a–f显示正常回肠和MPTP回肠在10时对EFS的代表性反应 s列脉冲，10 赫兹（50 五、 0.2个 ms脉宽），正常对照回肠产生复杂的收缩/舒张模式（图。​（图2a）2a个)它由三个不同的阶段组成：第一阶段：剧烈收缩，然后是第一阶段，持久放松，然后是第三阶段，还有一种补品，收缩后慢慢发展。只是，第一阶段完全被3个 µM阿托品，但第二和第三阶段未受影响（图。​（图2b）。2亿). 联合用药3 µM阿托品和100 µM L-NAME完全阻断了阶段-i和-ii（图。​（图2c）。2厘米). 在MPTP处理的绒猴回肠中，观察到类似的收缩模式（图。第2天至第6天)但松弛成分几乎不存在（图。​（图2e）。第二版). 当EFS在1至60频率范围内诱发反应时 对频率进行了检测，从MPTP处理的动物获得的组织中的i期反应总体频率依赖性增加，频率大于20 与对照组织相比，Hz显著增大（图。​（图3g；3克;P（P） = 0.0049,F类_(1–70) = 8.44;n个 = 6，双向方差分析）。

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图2

EFS诱发的分离普通绒猴回肠收缩和舒张反应的特征。代表性的痕迹显示了正常、未用药的孤立回肠的收缩反应(一–c（c）)和MPTP处理的普通狨猴(d日–（f）)响应电场刺激及其药理学操作。10引起的收缩 10秒脉冲串 Hz产生的三相收缩一：初始收缩（第一阶段），随后出现松弛（第二阶段），以及松弛反应后缓慢发展的收缩（第三阶段）。第一和第二阶段为阿托品b条和L-NAMEc（c）分别是敏感的。从MPTP处理的动物获得的组织中，成分ii显著减少(d–f日). 面板(克–我)总结不同刺激频率下EFS的收缩和舒张反应：克第一阶段；小时第一阶段；我第三阶段。小横条表示EFS的持续时间。每个条形图都是平均值 ± s.e.m.，共n个 = 6. *P（P） < 0.05**P（P） < 0.001; ***P（P） < 0.0005

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图3

氮能传递对EFS诱发的普通绒猴回肠收缩和舒张反应的贡献。L-NAME对正常、未用药者EFS诱发的收缩和舒张反应的影响(一，c（c），e（电子）)和MPTP处理(b条，d日，（f）)普通绒猴回肠。L-NAME浓度依赖性地增加正常人的Ⅰ期收缩反应一但对MPTP处理动物的回肠没有影响b条在正常人中，L-NAME浓度依赖性地抑制了Ⅰ相和Ⅰ相弛豫c（c）但在MPTP治疗动物的组织中，EFS诱发的舒张功能缺失d日.正常组织的第Ⅲ期收缩反应e（电子）和MPTP处理（f）大小相似，但L-NAME对EFS诱发反应没有任何显著影响。每个条形图都是平均值 ± s.e.m.，共n个 = 6. *P（P） < 0.05**P（P） < 0.001

作为对EFS诱发松弛（Ⅰ期）的反应，控制性回肠松弛仅在高于2 赫兹，并保持在60 赫兹。然而，没有明显的频率依赖性弛豫响应（图。​（图3h；3小时;P（P） = 0.116,F类_(6,70) = 1.78;n个 = 6，双向方差分析）。与正常组织形成鲜明对比的是，MPTP处理的动物在超过2倍的所有刺激频率下均无肠Ⅰ期反应 赫兹(P（P） < 0.0001;F类_(1,70) = 50.28,n个 = 6，双向方差分析）。

当检查第三阶段反应时，这种晚出现的“后压缩”有明显的频率相关增强，但对照组和MPTP组织之间的反应幅度没有差异（图。​（图2i第2页).

在正常回肠准备中，NOS抑制剂L-NAME浓度依赖性地给药可显著增加收缩力（图。​（图3a；3a年;P（P） = 0.0004；F类_(3,140) = 6.40,n个 = 6，双向方差分析）。然而，在MPTP处理动物的组织中，L-NAME总体上没有显著影响（图。​（图3b；3亿;P（P） = 0.506;F类_(3,140) = 0.78;n个 = 6，双向方差分析）。当研究反应的松弛成分（第i阶段）时，发现L-NAME浓度依赖性地抑制了仅在正常动物组织中的第i阶段反应（图。​（图3；三;P（P） = 0.0003;F类_(3,140) = 6.81;n个 = 6，2向方差分析），但在那些从MPTP处理的动物中获得的EFS诱发的舒张反应很少。相反，L-NAME更高（>100 µM）浓度似乎将松弛逆转为适度收缩（图。​（图3d）。三维). 然而，L-NAME对Ⅰ期成分的影响并没有达到显著水平(P（P） = 0.0541;F类_(3,140) = 2.61,n个 = 6，双向方差分析）。

第三阶段“收缩后”的幅度随频率增加而增加。然而，使用任何浓度的L-NAME对从正常或MPTP处理的动物获得的组织都没有影响（图。​（图3e；第三版; 控制：P（P） = 0.0765;F类_(3,140) = 2.33; 图。​图3f；第3页; MPTP：P（P） = 0.504;F类_(3,140) = 0.79;n个 = 6; 双向方差分析）。

器官浴研究

过量服用戊巴比妥钠（60 毫克/千克；Euthatal，Merial Animal Health Ltd.），上午7:30至8:30。在停止足部和角膜反射后，打开胸腔和腹腔。动物经心灌注冰镇氧合物（95%氧合物）₂外加5%CO₂)Krebs–Henseleit溶液（以mM计的成分：NaCl 118、KCI 4.7、CaCl₂2.5、硫酸镁₄1.2，NaHCO_三25，千赫₂人事军官₄1.2，葡萄糖11），并在降结肠开始之前切除远端回肠近端的一段长度，放置在该溶液中。当仍处于充气Krebs–Henseleit溶液中时，四到五个2 回肠的长度为cm，通过管腔横向切开。保存用于免疫组织化学分析的近端和远端节段，以及中间部分被运送到实验室，在那里它们被悬挂在15个 ml器官浴，置于1.0的静息张力下 37时的g力 摄氏度。30–60之后 最小平衡期和自发收缩的开始，回肠的收缩活动使用连接到LabChart数据采集系统（英国牛津AD仪器有限公司）的等长传感器进行测量。

组织活力最初通过施用卡巴胆碱（CCH）进行测试，10 µM以获取收缩反应。仅收缩>2的组织 研究中包括g张力。为了评估先前的MPTP治疗是否影响受体/效应器耦合或平滑肌水平是否发生变化，通过累积添加不同浓度的CCh（0.01–30 微米；Sigma-Aldrich）或组胺（0.1–100 微米；Sigma-Aldrich）。然后用几次克雷布溶液的改变彻底清洗组织，然后比较去甲肾上腺素（NA）对幼稚动物和MPTP处理动物回肠自发收缩反应的幅度、张力和频率的松弛作用。因为有证据表明肠道多巴胺能神经元的存在³⁴调节肠道运动，这可能在MPTP治疗后受到影响，多巴胺能D1激动剂、A77636或D2激动剂罗匹尼罗对从正常、未用药或MPTP治疗的动物获得的回肠制剂的自发节律性收缩的音调、幅度和频率的影响进行了测试。振幅是通过将10年内发生的单个收缩的张力加在一起来估计的 min，然后用这个和除以这段时间内的收缩次数。自发活动率（速率/分钟）是由10次宫缩的总次数除以得出的 最小观察期。

电场刺激引起的收缩和放松

为了评估MPTP治疗后收缩和松弛反应中的任何神经源性改变，通过放置在器官浴中肌肉条两侧的一对铂电极传递EFS，间接收缩回肠准备物。用10 1.0、2.0、5.0、10、20、40和60时的s系列脉冲 Hz，脉冲持续时间0.2 超最大电压下ms（50 五） 每5次一次 min。在无EFS或有EFS的情况下诱发收缩反应 µM阿托品（硫酸阿托品，Sigma-Aldrich）评估胆碱能成分对EFS诱发的收缩反应的贡献。服用阿托品30 EFS诱发反应开始前min。为了研究在EFS（非选择性NOS抑制剂，L-硝基精氨酸甲酯，浓度在10 微米至1 mM被添加到器官浴中15 EFS生效前min。

黑质纹状体TH-免疫活性

为了确定MPTP诱导的黑质纹状体病变的程度，30 根据先前公布的方案，对SN和纹状体的µm自由漂浮切片进行TH免疫组织化学处理³⁵对尾状核和壳核中纹状体TH+ve光密度的分析进行了一些修改。简言之，与兔抗TH抗体孵育后（见表​表2）2)在室温下过夜。在颜色显影后，手动计数SN切片中的TH-免疫活性（ir）神经元。通过平均3–4个相邻节段（取决于相关节段的可用性）得出第三神经水平的TH-ir神经元数量，其中第三神经根可清楚识别。使用Image-J软件通过密度测定法评估MPTP治疗后不同区域的纹状体TH-ir。评估尾状核和壳核内染色强度的变化。为了使染色强度的变化正常化，从胼胝体的白质中获得读数，并从尾状核和壳核内获得的读数中减去该读数。

肠道整片制剂

回肠近端和远端浸泡15次 0.1中的最小值 M磷酸盐缓冲盐水（PBS），pH 7.2，含1 µM尼卡地平作为肌肉松弛剂（Sigma-Aldrich，英国）。然后沿着肠系膜线打开切片，并在PBS中清洗以去除内腔内容物。随后，将回肠近端和远端制剂在蜡支撑物上拉伸，使粘膜层朝下，并固定6/7 Zamboni固色剂中的h（2%多聚甲醛，0.1中含有0.2%苦味酸 M PBS）在4 摄氏度。固定后，从蜡支架上取下组织，用二甲基亚砜（DMSO）清洗，然后用三个10 在PBS中至少清洗一次，然后储存在4 °C，在含有0.1%叠氮化钠（Sigma-Aldrich）的PBS中。如前所述，通过剥离不同层（即粘膜、粘膜下层和环形肌肉），将拉伸标本作为纵向肌-肠系膜丛全套制剂（LMMP）进行处理。²

采用双重染色（Hu/Chat、Hu/5-HT、Hu/P物质和Hu/GFAP）或三联标记（Hu/VIP/nNOS、Hu/TH/nNOS）免疫荧光技术分析LMMP肌间神经丛中的肠神经元。根据抗体特征，使用免疫荧光组织化学或标记的链霉亲和素-生物素（LSAB）方法。

双重染色程序

在免疫染色之前，将整个样品渗透1 室温下，在含有1%Triton X-100（10%正常山羊或驴血清，0.1）的封闭缓冲液中放置h M PBS）以减少非特异性结合。然后将整个支架在封闭缓冲液中稀释的初级抗体混合物中孵育过夜，温度为4 摄氏度。抗Huc/HuD抗体用于鉴定所有肌间神经元细胞体。³⁶表中总结了使用的所有初级抗体的详细信息​表1。1.然后用PBS清洗整个支架，并用二级抗体在封闭缓冲液中稀释3 室温下h。然后清洗组织制剂3 × 10 PBS中的最小值，然后使用Mowiol安装介质（Mowiol 40-88 Sigma 324590，Tris Buffer 0.2 M（M） pH 8.5，蒸馏水，甘油，DABCO-Sigma D-2522，叠氮化钠10%储备）。

标记的链霉亲和素-生物素（LSAB）

用一级抗体染色后，在PBS中清洗组织，然后用生物素化二级抗体孵育，在封闭缓冲液中稀释，1 室温下h。然后，按照相同的时间和温度程序，用第二个一级抗体孵育整批制剂过夜。24天后 h、 标本在PBS中清洗，并在荧光染料链霉亲和素和合适的次级抗体中孵育 h、 然后按照上述步骤进行清洗和安装。

表中总结了使用的所有主要抗体及其来源的详细信息​表22.

细胞计数

使用蔡司ApoTome显微镜和蔡司AxioCam摄像头进行图像捕获。图像由蔡司AxioVision 4.0图像分析软件拍摄。使用整装制剂对HuC/HuD-ir神经元群的不同研究神经元群（ChAT-ir、nNOS-ir、VIP-ir、5-HT-ir、TH-ir和SOX-10-ir）进行定量分析。所有观察均在×20物镜下进行。首先，肌间神经丛中每个神经节内计数的神经元细胞数量，其面积通常在0.02到0.04之间 毫米²从随机选择的神经节中，大约总共计数了250–300个HuC/HuD-ir神经元。正常情况下，每个动物样本计数5片。然后将每只动物的平均计数归一化为总计数/mm².

UH的工作由UH-QR基金资助。E.C.的部分资金来自帕金森病非运动组（PDNMG）。PDNMG没有参与研究设计、数据收集、分析和解释，也没有参与撰写报告和决定将文章提交出版。K.R.C.对本论文的贡献代表了由伦敦南部国家卫生研究院（NIHR）生物医学研究中心、Maudsley NHS Foundation Trust和伦敦国王学院资助的独立研究部分。所表达的观点是作者的观点，不一定是NHS、NIHR或卫生部的观点。