减少SIRT1表观遗传学上调NALP1表达，并有助于化疗药物硼替佐米诱导的神经病理性疼痛

注射药物和腺病毒相关载体

如前所述，硼替佐米（浩然生物科技有限公司，上海）每天腹腔注射0.4 mg/kg，连续5天[19]。对照组动物接受等量的车用生理盐水。siRNA经过化学修饰以增强甲基化稳定性，并通过胆固醇偶联物高效传递，是从Ribobio商业化获得的。生理盐水用于siRNA传递。白藜芦醇（50μg/10μl、250μg/10µl和500μg/10¦Μl；Sigma-Aldrich，美国在硼替佐米治疗前30分钟鞘内注射，维持10天。

将4μl编码Cre和绿色荧光蛋白（GFP）标记物的重组腺相关病毒（AAV8-Cre-GFP，北京矢量基因技术有限公司）鞘内注射至L5-L6脊髓蛛网膜下腔STAT3（状态3）^{flox/flox公司}鼠标。在对照组中，鞘内注射相同数量的AAV8-GFPSTAT3（状态3）^{flox/flox公司}鼠标。在注射病毒后第21天腹腔注射硼替佐米。

腰蛛网膜下腔导管插入术和行为评估

对于鞘内注射，在用50 mg/kg戊巴比妥钠腹腔内麻醉动物后，如前所述将聚乙烯鞘内导管（PE-10，Becton Dickinson，USA）植入动物体内[19]。简言之，将导管插入第五节和第六节腰椎之间的腰椎蛛网膜下腔，导管尖端位于L5节段水平附近。鞘内植入导管后，允许动物在随后的药物注射前5天从手术中恢复，任何后肢麻痹或瘫痪的动物都被排除在本研究之外。注射10μl 2%利多卡因，以确定导管的正确位置，如短暂双侧后肢麻痹所示。

如前所述，将冯·弗雷纤维应用于后足跖区，以测试机械性超敏反应。简单地说，将动物放在金属网上的塑料盒中，让它们适应30分钟后再进行测试。将不同弯曲力的von Frey纤丝交替施加于后爪的中平面。每只动物的机械性超敏反应通过后爪机械性撤退阈值进行评估。伤害性反应被定义为在应用冯·弗雷灯丝后快速收回爪子或退缩爪子。每项试验每隔2分钟重复三次。按照之前验证的上下程序，计算每只动物的50%爪子收回阈值[20]。行为测试由一名对所有治疗都不知情的实验者进行。

RNA提取和实时定量PCR

使用Trizol试剂（Invitrogen，美国）从背角（L4–L6）组织中提取总RNA。SYBR Green qPCR SuperMix（Invitrogen，USA）和ABI PRISM7500序列检测系统用于实时定量PCR。根据基于制造商说明的协议，使用寡核苷酸-dT引物和M-MLV逆转录酶（美国普罗米加）进行逆转录反应。使用NALP1（大鼠）特异性引物：正向5′-GTGGTGGCTGGACCTCTGTTTGA-3′和反向5′-GGCGTTCTAGGACCATCCC-3′，通过PCR评估合成cDNA的量。PCR扩增采用初始变性步骤，在94℃下进行3分钟，然后在94℃条件下进行40次循环，持续10秒，在58℃条件下持续20秒，在72℃条件下连续10秒。L4–L6背角组织中mRNA的相对表达率由2^{−△△计算机断层扫描}方法[21].

蛋白质印迹

Western blotting与我们之前研究中的描述一致[22]。简单地说，在用50 mg/kg戊巴比妥钠（i.p.）麻醉动物后，将动物的L4–L6脊髓背角组织移除并在含有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂混合物的15 mmol/l Tris中均质化。接下来，制备L4–L6背角组织的裂解物，并通过凝胶电泳（SDS-PAGE）分离，然后转移到聚偏氟乙烯膜上。然后在室温下将其在块缓冲液中预培养1小时。与SIRT1（1:2000，#ab110304，Abcam，UK）、NALP1（1:1000，#ab 3683，Abcam-UK），磷酸化STAT3（1:1500，#ab76315，Abcam-UK在4°C下过夜，在室温下将膜在辣根过氧化物酶结合二级抗体中培养1小时。最后，按照制造商的指示，通过增强化学发光（ECL，皮尔斯，美国）对膜中的条带进行可视化。然后用计算机辅助成像分析系统（NIH ImageJ）对条带进行定量。

免疫组织化学

如前所述进行免疫组织化学[22]。简单地说，用戊巴比妥钠（50 mg/kg，i.p.）麻醉动物，并使用0.9%生理盐水进行心脏灌注，然后在PBS中加入4%多聚甲醛。接下来，移除L4–L6脊髓组织并在同一固定液中固定过夜，然后用30%蔗糖脱水。切割并处理冷冻切片（16μm厚），用SIRT1（1:400，美国Santa Cruz）、NALP1（1:50，美国Novus Biologicals）、磷酸化STAT3（1:100，英国Abcam）、NeuN（1:500，美国Chemicon）、GFAP（1:800，美国Chemcon）或OX42（1:250，美国Chemison）的一级抗体进行免疫荧光染色。在4°C下孵育过夜后，在室温下用cy3-共轭和荧光素-异硫氰酸盐共轭二级抗体孵育切片1小时。将同型IgG用于分离的切片作为对照，但未产生可检测的免疫信号。然后用莱卡（德国莱卡）荧光显微镜检查染色切片，并用莱卡DFC350 FX相机拍摄图像。

染色质免疫沉淀（ChIP）分析

如前所述，使用ChIP分析试剂盒（Thermo）进行ChIP分析[22]。用戊巴比妥钠（50 mg/kg，i.p.）麻醉动物，立即取出L4–L6脊髓背角，置于1%甲醛中2分钟。然后，通过超声波破碎DNA并用微球菌核酸酶消化。在DNA样品中加入ChIP稀释缓冲液后，保存100μl样品作为输入。将预先分离的染色质溶液与抗p-STAT3抗体（美国Cell Signaling Technology公司）或抗乙酰化H istone H3抗体（英国Abcam公司）或抗乙酰化H stistone H4抗体（美国Millipore公司）在4°C下孵育过夜。阴性对照采用“IgG”免疫沉淀法。第二天，从免疫复合物中纯化DNA，并捕获、洗涤、洗脱和反向交联抗体/DNA复合物之后的输入级分。然后将纯化的DNA重悬于无核酸酶的水中，并如上述方法所述对样品进行实时定量PCR。最后，计算L4–L6脊髓背角的ChIP/输入比率。引物5′-CTCAATTCATGGTCTAAG-3′和5′-GAAGAAATTCATACTACTG-3′设计用于扩增α- 1148/− 大鼠转录起始位点的1057区Nalp1公司启动子，包含STAT3结合位点。底漆5 -TCAAACACCCATTCACAGAGC-3号机组 和5 -CAAGACGCTCTCTGTTGTTG-3 旨在放大a− 139/− 55相对于小鼠转录起始位点的区域Nalp1公司启动子，包含STAT3结合位点。

协同免疫沉淀

如前所述，使用协同免疫沉淀试剂盒（美国赛默飞世尔科学公司）进行协同免疫沉淀[22]。简言之，通过腹腔注射戊巴比妥钠（50 mg/kg）对动物进行麻醉，并切除L4–L6脊髓背角组织并在裂解缓冲液中均质。用树脂固定的抗p300抗体（英国Abcam）或抗p-STAT3抗体（英国Abcam）收集免疫复合物。培养和洗涤后，用抗p-STAT3抗体或抗p300抗体对树脂中洗脱的络合物进行免疫印迹分析。

减少SIRT1上调NALP1表达并参与硼替佐米诱导的机械性痛觉超敏

接下来，我们发现在硼替佐米治疗后第5天和第10天，背角SIRT1蛋白表达显著降低（图2a个). 双重免疫荧光染色显示SIRT1主要在NeuN阳性细胞中表达，但不表达GFAP阳性和OX42阳性细胞（图2亿). 为了进一步证实SIRT1在硼替佐米诱导的持续性疼痛中的作用，我们研究了人工操纵背角SIRT1功能的行为反应。结果表明，连续10天鞘内注射250μg或500μg（而非50μg）的特异性SIRT1激活剂白藜芦醇可减轻硼替佐米引起的机械性痛觉超敏反应（图2厘米). 同时，我们通过连续10天鞘内注射SIRT1 siRNA来特异性下调正常大鼠脊髓SIRT1的表达，然后评估疼痛行为。通过western blotting验证了SIRT1 siRNA的敲除效率（图二维). 与对照组相比，鞘内注射siRNA（50μg/10μl）在幼年大鼠中诱导了机械性超敏反应（图第二版)。

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图2

脊髓背角SIRT1的降低参与了硼替佐米诱导的机械性超敏反应。一典型的直方图和印迹显示，BTZ治疗后脊髓后角SIRT1降低。n个=每组6人**P（P）<0.01与车辆组相比。b条照片显示，BTZ治疗后第10天，大鼠脊髓中神经元标记物（NeuN，绿色）或星形胶质细胞标记物（GFAP，绿色）或者小胶质细胞标记（OX42，绿色）与SIRT1（红色）之间的双重染色。n个 = 每组3人；比例尺，100μm。c（c）连续鞘内注射白藜芦醇（剂量为500μg/10μl或250μg/10µl，但不是50μg/10¦Μl）10天，可以改善BTZ治疗后的机械性痛觉超敏。n个每组=12**P（P）<0.01与车辆组相比，^##P（P） <0.01与相应车辆 + 硼替佐米组。d日鞘内注射SIRT1 siRNA下调背角SIRT1的表达。n个=每组3人**P（P）<0.01对照组，^##P（P）<0.01与相应的siRNA组比较。e（电子）SIRT1 siRNA下调SIRT1可诱导正常大鼠机械性痛觉超敏反应。n个 = 每组8人**P（P）<0.01对照组

接下来，我们确定SIRT1是否调节了接受硼替佐米治疗的啮齿动物背角NALP1的表达。首先，双重免疫染色结果显示，在硼替佐米治疗的大鼠中，SIRT1与NALP1在脊髓背角共表达（图3a年). 此外，在硼替佐米治疗后的第10天，用白藜芦醇（250μg/10μl，i.t.10天）激活SIRT1可阻止NALP1 mRNA和蛋白质的上调（图3亿,​，c）。c（c）). 同时，与对照大鼠相比，鞘内注射SIRT1 siRNA的大鼠NALP1表达上调（图三维). 这些研究结果表明，SIRT1的降低导致NALP1表达增加，随后导致硼替佐米诱导的机械性痛觉超敏。

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图3

SIRT1在硼替佐米治疗后调节NALP1的表达。一照片显示，硼替佐米治疗后第10天，脊髓背角SIRT1（红色）与NALP1（绿色）之间出现双重染色。n个 = 每组4个；标尺，50μm。鞘内注射白藜芦醇（250μg/10μl，持续10天）抑制NALP1 mRNA的上调(b条)和蛋白质(c（c）)BTZ治疗后第10天大鼠背角的水平。n个 = 每组6人**P（P）<0.01与车辆组相比，^##P（P）<0.01与相应的BTZ组相比。d日鞘内注射SIRT siRNA可增加正常大鼠NALP1的表达。n个 = 每组6人**P（P）<0.01与对照组

SIRT1减少诱导的STAT3激活有助于NALP1的表达

研究表明，活化的STAT3可能增加启动子区的组蛋白乙酰化，并增强炎症相关基因的表达[22,24]我们之前的研究表明，STAT3的激活有助于硼替佐米诱导的机械性超敏反应[23]。在本研究中，我们发现p-STAT3在脊髓背角的SIRT1阳性细胞中表达（图4a类)和SIRT1激活剂白藜芦醇显著抑制硼替佐米诱导的脊髓p-STAT3的增加（图4b个). 进一步的免疫印迹结果显示，硼替佐米治疗后，背角H3（k9）和H4（k16）的整体乙酰化水平增加（图4c类,​，d）。d日). 以往研究表明，SIRT1作为一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD1）的脱乙酰酶，可以优先调节H3（k9）和H4（k16）的乙酰化[25,26]。然后，我们确定组蛋白高乙酰化是由硼替佐米治疗大鼠背角SIRT1减少引起的SIRT1脱乙酰酶活性降低还是p-STAT活性增加所致。TFSEARCH和JASPAR数据库的分析表明 1127/− 1117地区Nalp1公司该基因存在STAT3的潜在结合位点。然后，用p-STAT3抗体或SIRT1抗体沉淀的DNA进行PCR分析，设计引物扩增92-bp片段（− 1148/− 第1057页）Nalp1公司启动子侧翼STAT3结合位点。结果显示p-STAT3的募集（图第四版)，但不是SIRT1（图第4页)，至Nalp1公司硼替佐米治疗组大鼠脊髓背角的启动子区在第10天显著增强，与车用治疗组相比。重要的是，ChIP分析还显示H3（k9）和H4（k16）乙酰化水平在Nalp1公司在第10天用硼替佐米治疗后，启动子区域侧翼的p-STAT3结合位点（图4克). 这些发现表明，NALP1上调是由STAT3介导的组蛋白乙酰化作用导致的Nalp1公司启动子区域位于p-STAT3结合位点的侧翼，而不是来自硼替佐米治疗后SIRT1减少的直接作用。

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图4

P-STAT3（而非SIRT1）在硼替佐米治疗后直接介导NALP1的表达。一照片显示，硼替佐米治疗后第10天，脊髓背角SIRT1（红色）与NALP1（绿色）之间出现双重染色。n个=每组4人；标尺，50μm。b条BTZ治疗后第10天应用白藜芦醇（i.t.）可减少p-STAT3的增加。n个 = 每组6人**P（P）<0.01与车辆组相比，^##P（P）<0.01与相应的BTZ组相比。BTZ治疗显著增加组蛋白H3（K9）的整体乙酰化(c（c）)和H4（K16）(d日)在大鼠脊髓背角。n个 = 每组6人**P（P）<0.01与车辆组相比。e（电子）ChIP结果显示，在BTZ处理后的第10天，p-STAT3向Nalp1基因启动子的募集增强。n个 = 每组5人**P（P）<0.01与车辆组相比。（f）在硼替佐米治疗的大鼠脊髓后角，SIRT1对Nalp1基因启动子的募集在第10天没有显著变化。n个=每组5人**P（P）<0.01与车辆组相比。克ChIP分析显示，BTZ治疗增加了大鼠Nalp1基因启动子区p-STAT3结合位点旁组蛋白H3和H4的乙酰化。n个 = 每组6人**P（P）<0.01与相应的车辆组相比，^##P（P）<0.01与相应的车辆组

出版同意书

不适用。

竞争性利益

作者声明，他们没有相互竞争的利益。