国际临床实验医学杂志。2014; 7(12): 5050–5058.
2014年12月15日在线发布。
SIRT1抵消STAT3和NF-κB的激活以抑制胃癌生长
中国兰州市东岗西路160号甘肃省医院消化科，邮编730000
通信地址：马欣医生，甘肃省医院消化科，地址：中国兰州东港西路160号，邮编：730000。电话：+86-931-8281114；传真：+86-931-8281114；电子邮件：zlamnix的moc.361 2014年9月21日收到；2014年11月25日接受。
摘要
Sirtuin-1（SIRT1）在肿瘤调节中具有明显的双重作用。以前的报告记录了白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中SIRT1与信号转导子和转录激活子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）信号之间的串扰。本研究旨在探讨SIRT1对胃癌细胞（AGS和MKN-45）的调节作用以及SIRT1与胃癌细胞STAT3和NF-κB活化的关系。我们发现SIRT1激活剂（白藜芦醇RSV）有助于抑制生存能力和增加衰老，而SIRT1抑制剂（烟酰胺NA）和SIRT1耗竭分别通过CCK-8试验和SA-β-gal试验进行了挽救。进一步研究发现，SIRT1激活（RSV补充剂）不仅抑制STAT3的激活，包括STAT3 mRNA水平、c-myc mRNA水平磷酸化STAT3（pSTAT3）蛋白和乙酰化STAT3的蛋白，而且抑制pNF-κB p65和acNF-κ的B p65。NA逆转了RSV的作用。此外，RSV或NA应用都不能改变STAT3敲低或NF-κB敲低的MKN-45细胞的细胞活力和衰老。总的来说，我们的研究结果表明，SIRT1激活可导致GC体外存活能力的丧失和衰老的增加。此外，我们的观察结果显示，SIRT1在GC细胞中显示出生长抑制活性，该活性与通过脱乙酰化抑制STAT3和NF-κB蛋白的激活密切相关。
关键词：Sirtuin-1、STAT3、NF-κB、胃癌、乙酰化、活化
介绍
胃癌每年导致7万人死亡，被认为是全球第二大与癌症相关的死亡率[1,2]. GC在亚洲国家的流行尤其严重[三]. 2008年，亚洲国家新诊断的GC病例约占总病例的四分之三[4]. 到目前为止，GC患者的5年生存率低于15%，没有有效的治疗和对该疾病的早期识别[5]. 由于GC的高死亡率和高发病率，探索有效的GC治疗方法具有挑战性和紧迫性，包括探索新的GC治疗靶点。
Sirtuin-1（SIRT1）是一种III类蛋白脱乙酰化酶、脱乙酰化蛋白，可发挥多种生理功能，包括DNA修复、细胞应激抵抗、调节细胞死亡阈值和代谢调节[6,7]. SIRT1对糖尿病、炎症和神经变性也有潜在影响[7]. 就癌症而言，SIRT1具有明显的双重作用[8,9]. 一方面，SIRT1功能的丧失可防止结直肠癌[10]. 一些数据还表明，SIRT1促进细胞存活可能与应激条件下的肿瘤发生直接相关[11,12]. 另一方面，SIRT1防止DNA受损，并抵抗复制寿命[8,13,14]. 这意味着SIRT1是肿瘤抑制剂。因此，SIRT1利用依赖于细胞和分子环境的精细网络来促进或抑制肿瘤发生。关于GC，最近的报告显示SIRT1激活剂抑制GC细胞的生长[15,16]. 相反，SIRT1通过结合激活转录因子4促进GC细胞的多药耐药性[17]. 此外，SIRT1的上调促进了饮食诱导肥胖促进的小鼠GC生长[18]. 增加SIRT1水平/活性是否有利于GC的生理功能尚存在争议。
目前，许多调控因子已被确定为SIRT1的底物，如ATG APE1、FOXO、Ku70等，涉及肿瘤中的自噬、DNA修复活性、氧化应激等调控机制[19-22]. 此外，SIRT1抑制信号转导子和转录激活子3（STAT3）和核因子κB（NF-κB）信号传导，从而在白血病、淋巴瘤和骨髓瘤中显示抗癌作用[23-25]. 众所周知，STAT3和NF-κB对肿瘤炎症和肿瘤微环境的调节具有内在激活作用[26,27]. 所有证据都支持SIRT1在影响GC肿瘤发生的重要因子（STAT3和NF-κB）中发挥调节作用的假说。不幸的是，SRIT1在GC中的肿瘤调节功能尚不清楚，并且在很大程度上缺乏SIRT1对STAT3和NF-κB的调节作用是否在GC细胞的生理功能中起主导作用。
本研究采用SIRT1激活剂白藜芦醇和抑制剂烟酰胺来研究SIRT1对GC细胞（AGS和MKN-45）活力和衰老的影响。进一步的研究集中在SIRT1与GC细胞中STAT3和NF-κB活化之间的关系。
材料和方法
细胞系、细胞培养和治疗
GES-1（人正常胃上皮细胞系）购自上海细胞生物学研究所。人类GC细胞系（AGS和MKN-45）来自美国类型培养物收集中心（ATCC，Rockville，MD，USA）。细胞在含有10%FBS的DMEM（Gibco，Invitrogen，Carlsbad，USA）中生长，培养箱中含有5%CO237°C时。细胞达到80%融合后进行传代培养。细胞汇合后用指定方法处理约90%。采用10 mM白藜芦醇（RSV）和5 mM烟酰胺（NA）（美国圣路易斯西格玛）培养细胞[28]. 分别使用SIRT1的siRNA和NF-κB p65的siRNA（美国加利福尼亚州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）进行SIRT1敲除（si）和NF-kb B p65-敲除（NF-kbsi）。STAT3特异性RNAi被用于敲除人类STAT3（STAT3si）[29]. 进行非靶向shRNA对照作为阴性对照（si对照）（Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA，USA）。SIRT1敲除后用RSV培养细胞。处理24小时后提取总RNA或蛋白质。所有细胞转染均通过Lipofectamine 2000（Invitrogen，Carlsbad，USA）进行。
RNA提取和定量实时聚合酶链式反应（qRT-PCR）通过RNeasy试剂盒（Qiagen，Valencia，CA）从细胞中提取总RNA。使用SYBR绿色PCR试剂盒（Applied Biosystems）对ABI 7500进行qRT-PCR。GAPDH基因被命名为内源性控制。数据标准化为2-ΔΔCt方法作为相对定量。引物应用如下。STAT3:F ggg tgg aga agg aca tca gta，R gcc gac aat act ttc cga atc c.c-Myc:F tag aat tgg att ggg gta aa，R cca acc aat caa cat gaa t.GAPDH:F gga gtc aac gga ttt c，R gga atc att gga aca tgt aaa c。
活性测定和细胞衰老测定
为了进行活力测定，将具有指定处理的细胞培养在CCK-8中（日本熊本DOJINDO）。在指示的时间点出现视觉颜色后，分析每个孔的450 nm吸光度。所有实验均一式三份。数据表示为正常细胞的存活率百分比。按照制造商的方案，通过细胞衰老检测试剂盒（Cell Biolabs，San Diego，CA）相关的β-半乳糖（SA-β-gal）检测来测量细胞衰老。简单地说，用RSV、NA或SIRT1敲除处理细胞24小时。然后，在清洗和收集后，在37°C的黑暗中用新制备的荧光底物培养细胞2小时。通过Image-J软件（NIH）测定并量化每个反应混合物的荧光强度。对每个处理的五个场的平均荧光强度进行分析。数据表示为正常细胞荧光强度的百分比。所有实验均一式三份。
蛋白质印迹
细胞在裂解缓冲液中溶解（20 mM Tris HCL pH 8，137 mM NaCl，10%甘油，1%NP-40，2 mM EDTA，蛋白酶和磷酸酶抑制剂），然后在冰上超声处理。用10%SDSPAGE凝胶对上清液进行分级，并在4°C下14000 g离心30 min后将其电转移到硝化纤维素膜（Millipore）上。细胞膜由初级抗体孵育。然后，使用ECL检测系统（Super Signal West Femto，Pierce）在与辣根过氧化物酶结合二级抗体（Pierce，二级抗体）孵育后获得信号。初级抗体使用如下：单克隆STAT3抗体（美国明尼苏达州明尼阿波利斯市）、抗磷酸特异性STAT3（Tyr705）（细胞信号技术）、抗乙酰基-STAT3（Lys685）（细胞信号技术）、抗乙酰基NF-kB p65（Lys310）、抗磷酸化NF-kB p65（Ser536）（细胞信号技术）、SirT1初级抗体（Sigma-Aldrich）β-肌动蛋白抗体（Sigma-Aldrich）。
数据分析
所有数据均按平均值±SEM计算。采用学生t检验对两组进行比较。通过方差分析对多个样本进行比较。采用SPSS 18.0进行统计分析。对<0.05被视为具有统计学意义的差异。
结果
SIRT1降低GC细胞的活性
本研究采用两种GC细胞系（AGS和MKN-45）和人正常胃上皮细胞系（GES-1）。采用SIRT1激活剂白藜芦醇（RSV 100µM）和SIRT1抑制剂烟酰胺（NA 5 mM）分析SIRT1对GC细胞活力的影响。RSV或NA治疗不能显著改变GES-1的活性(). 有趣的是，RSV显著抑制AGS细胞和MKN-45细胞的活性（AGS为80.96%，对=0.007，MKN-45为85.52%，对=0.006），与C组相比，如和在两个GC细胞系中，与正常细胞相比，SIRT1抑制剂NA的存在增加了存活量（AGS和MKN-45为109.02%±9.90%，对= 0.049). 我们还沉默了SIRT1的表达，以进一步研究SIRT1的作用。western plot证实了SIRT1表达的效率(). 结果显示，SIRT1基因敲除的效果与NA相似（P>0.05），与Si组（AGS组为112.37%±5.42%，MKN-45组为109.93%±1.95%，114.14%±7.57%，MKN-45组为111.71%±6.60%）相比，RSV未抑制SIRT1敲除细胞的存活率和这些数据表明，SIRT1激活剂有助于抑制存活率，而存活率被SIRT1抑制剂和SIRT1耗竭所挽救。
SIRT1在影响正常胃细胞和GC细胞的细胞活力方面发挥了作用。用siRNA沉默细胞（GES-1、AGS和MKN-45）以进行SIRT1敲除。用western plot（D）检验击倒效率。然后，将SIRT1沉默的细胞或细胞与NA或RSV预孵育24 h。正常、Si和Si对照组分别代表未经处理的细胞、SIRT1静默的细胞和非靶向shRNA的细胞。采用CCK-8法检测GES-1（A）、AGS（B）和MKN-45（C）的活性。所有实验均一式三份。数据表示为正常细胞的存活率百分比。数据表示平均值±SEM。统计结果用星号表示，**表示对< 0.01.
SIRT1促进GC细胞衰老
先前的研究已经证实SIRT1导致GC细胞G1期阻滞而非凋亡[16]. 由于SIRT1在对抗氧化应激和衰老方面具有重要的抗氧化作用，因此我们对SIRT1是否能够减少GC细胞的衰老感兴趣。在GES-1细胞中，SIRT1不能明显改变细胞衰老(). 值得注意的是，与C组（AGS组为185.70%±23.65%，MKN-45组为219.68%±37.53%，对<0.001），如所示和此外，与呼吸道合胞病毒组相比，添加5mM NA可以消除呼吸道合胞病毒在AGS细胞中诱导的β-gal活性的增加(对< 0.001). SIRT1基因敲除的作用与NA相似，与RSV组相比，SIRT1敲除阻断了RSV诱导的AGS细胞衰老(对< 0.001) (). MKN-45细胞也获得了类似的结果(). 这些数据说明SIRT1促进了GC细胞的衰老。
SIRT1具有调节GC细胞衰老的特性。用指定的方法处理GES-1（A）、AGS（B）和MKN-45（C）。然后，用SA-β-半乳糖试验检测细胞衰老。相对荧光强度标准化为正常细胞β-半乳糖活性的百分比。所有实验均一式三份。数据表示平均值±SEM。统计结果用星号表示，**表示对< 0.01.
SIRT1在体外抵消GC中STAT3和NF-κB的激活
STAT3和NF-κB被认为是SIRT1的底物，SIRT1是一种III类蛋白脱乙酰酶[23-25]. NF-κB的乙酰化是利用其转录活性所必需的[30]. 此外，据报道，SIRT1激活具有抗骨髓瘤、抗淋巴瘤和抗白血病的作用，这些作用与STAT3和NF-κB活性有关[31-33]. 因此，我们更想知道SIRT1是否与GC中STAT3和NF-κB的激活有关。AGS细胞用于这些实验。首先，用qRT-PCR检测STAT3和的相对表达。与C组相比，RSV显著下调STAT3 mRNA(对= 0.024). 与C组相比，NA显著增加了总STAT3 mRNA的表达(对=0.041），如所示此外，比较c-myc mRNA水平以分析STAT3和NF-κB的激活，因为c-myc基因已被确定为STAT3与NF-κ的共同依赖靶点[34]. RSV抑制c-Myc mRNA的表达（0.65±0.10，对=0.004），NA组和c组c-Myc mRNA表达差异显著（3.13±1.10，对=0.028），如所示随后，我们通过western plot检测了不同组中的总STAT3（tSTAT3）、磷酸化STAT3、总NF-κB p65、磷酸化NF-κ的B（pNF-kb B）、乙酰化NFκB（acNF-kB）和乙酰化STAT3的蛋白，如图所示RSV抑制STAT3总蛋白、pSTAT3蛋白和acSTAT3蛋白质的表达。而NA预培养促进了tSTAT3、pSTAT3和acSTAT3三种蛋白质的表达。令人兴奋的是，SIRT1激活也抑制了pNF-κB和acNF-κ的表达。
SIRT1通过去乙酰化调节STAT3和NF-κB的活化。AGS细胞与RSV（RSV组）或NA（NA组）孵育24 h。C组代表未经处理的AGS细胞。然后，从细胞中分离STAT3 mRNA（A）和c-Myc mRNA（B），并用qRT-PCR检测。数据标准化为2-ΔΔCt方法作为相对定量，表示为平均值±SEM。统计结果用星号表示，**表示对< 0.01. 用western plot（C）评估三组STAT3总蛋白（tSTAT3）、磷酸化STAT3蛋白（pSTAT3。
为了再次确认SIRT1与STAT3和NF-κB之间的串扰，对细胞进行STAT3敲除或NFκB p65敲除处理。显示了击倒的效率。随后，对细胞活力和衰老进行评估(,). 根据RSV和NA的应用，我们发现RSV或NA都不能改变STAT3或NF-κB敲低的MKN-45细胞的活性和衰老。所有数据揭示了两种机制。一种是去乙酰化抑制AGS细胞中STAT3和NF-κB的活化。另一种是SIRT1在体外抵消GC中STAT3和NF-κB的激活。
SIRT1对存活和衰老的影响涉及STAT3和NF-κB。分别使用STAT3的siRNA（STAT3si）和NF-κB p65的siRNA（NF-κBsi）敲除AGS细胞。通过western plot（C）评估基因敲除的有效性。si-control组代表非靶向shRNA的细胞。然后将AGS细胞或具有指定处理的AGS细胞与RSV或NA孵育24 h。用CCK-8法和SA-β-gal法分别测定不同组的细胞活力（A）和衰老（B）。所有实验均一式三份。数据表示平均值±SEM。
讨论
SIRT1的激活或抑制是否具有更强的抗癌活性还存在争议。SIRT1可能会根据细胞和分子环境发展精细的网络来促进或抑制肿瘤发生[8,9]. SRIT1在GC中是否具有肿瘤调节功能尚不清楚。为了研究SRIT1的功能，我们提供了白藜芦醇或烟酰胺来激活或抑制SRIT1[28]. 细胞活性在肿瘤进展机制中具有关键作用[35]. 在本研究中，我们说明了SIRT1激活剂有助于抑制存活率，而存活率是由SIRT1抑制剂和GC细胞（AGS和MKN-45）中SIRT1缺失所拯救的(). 我们发现在SRIT1激活或抑制的情况下，正常胃上皮细胞（GES-1）的活性没有显著变化(和)还有。细胞衰老过程是抗击癌症发生和发展的重要屏障[36,37]. 在我们的报告中，NA可以消除RSV诱导GC细胞中β-半乳糖活性的增加(和). 这表明SIRT1加速了GC细胞的衰老。我们的数据不仅支持Yang等人关于RSV抗肿瘤活性的报告[15]，但也进一步提高了对SIRT1抑制剂和SIRT1耗竭逆转RSV抗GC作用的认识。
STAT3活化的特征是STAT3磷酸化，这导致其基因上调，并调节其下游基因发挥内在和外在功能[26]. 组分STAT3激活促进人腺癌和小鼠模型的胃肿瘤发生[38]. 已经证实乙酰化对STAT3磷酸化是关键的和有活性的。此外，Lys-310处NF-κB p65的乙酰化表现出增强的磷酸化和转录活性[39]. 去乙酰化酶SIRT1的激活抑制STAT3和NF-κB的活性，从而发挥抗骨髓瘤、抗淋巴瘤和抗白血病的作用[23-25]. 因此，我们感兴趣的是SIRT1激活剂和抑制剂能否通过去乙酰化和乙酰化作用影响AGS细胞株中STAT3和NF-κB的活性。我们的数据表明，RSV在蛋白质水平上诱导STAT3和NF-κB转录活性的抑制，以及acSTAT3与acNF-κ）B的减少。NA显示RSV的不良反应(). c-myc基因是STAT3激活的靶基因和下游基因[26,40]. STAT3和NF-κB相互依赖。原癌基因转录因子c-myc基因是STAT3激活的靶点，也是NF-κB的下游因子[34]. 因此，我们通过检测c-myc的表达来评估STAT3和NF-κB的转录活性。发现RSV显著降低了AGS中c-myc mRNA水平，NA消除了RSV诱导的c-myc基因水平的降低(). 这些结果表明SIRT1通过去乙酰化作用抵消STAT3和NF-κB的激活。SIRT1的脱乙酰化是泛素化[8,9,41]. 这意味着SIRT1除STAT3和NF-κB外，还具有影响许多转录因子的脱乙酰酶活性。此前的研究证实，SIRT1已开发出精细的网络来进行各种活动。因此，SIRT1介导的STAT3和NF-κB的调节是否在GC细胞的生理功能中占主导地位尚需进一步研究。根据沉默的STAT3和NF-κB p65基因()我们发现STAT3基因敲除或NF-κB p65基因敲除均可显著诱导AGS生存能力的丧失，但补充RSV和NA并没有显著改变STAT3或NF-kb B p65基因敲减对AGS的影响(和). 这些数据进一步支持SIRT1抵消STAT3和NF-κB的激活以抑制GC生长。
综上所述，我们的研究结果表明，SIRT1激活可导致GC体外生存能力的丧失和衰老的增加。此外，我们的观察结果显示，SIRT1在GC细胞中显示出生长抑制活性，该活性与通过脱乙酰化抑制STAT3和NF-κB蛋白的激活密切相关。我们的工作为SIRT1在GC中的抗肿瘤机制提供了详细的证据。我们认为SIRT1激活剂的应用可能是GC的新治疗靶点。
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