肌萎缩侧索硬化症的代谢重编程

ALS运动神经元中UCP2的抑制改变生物能量学，但不影响氧化还原状态

先前的研究将解偶联蛋白2（UCP2）与ALS的线粒体功能障碍联系起来^三,31,32因此，我们测试了该蛋白在我们研究中观察到的ALS小鼠运动神经元生物能量改变中的作用。京尼平抑制UCP2的药理作用导致细胞ATP水平显著增加（图2安培)在ALS小鼠运动神经元中，线粒体网络恢复正常形态（图2B型). 然而，H没有变化₂O（运行）₂在我们的实验条件下，京尼平在ALS和野生型小鼠运动神经元中都触发了ROS水平下降能力（图2摄氏度). 同样，谷胱甘肽的氧化还原状态也没有被UCP2抑制所改变（图二维). 因此，在症状前ALS运动神经元中没有发现氧化应激的直接迹象，因为H₂O（运行）₂也没有GSH氧化还原状态显示SODG93A和WT细胞之间的差异（图2C和D). 然而，SODG93中检测到抗氧化防御系统（SOD2和过氧化氢酶）显著增加 western blot检测运动神经元（图2E–I型)表明氧化应激的间接征兆。这些发现表明，正如最近提出的，在ALS运动神经元中，UCP2参与ATP合成¹⁶不起解偶联蛋白的作用。

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图2

UCP2在ALS运动神经元生物能量学和H中的作用₂O（运行）₂-扫气。(一个)京尼平抑制UCP2对运动神经元总ATP水平的影响(B)线粒体网络形态(C类)小时₂O（运行）₂稳态水平（由CM-H测量₂DCFDA荧光）和(天)谷胱甘肽氧化还原状态。(E类)SOD1表达水平的Westernblot分析(F类)SOD2和(G公司)SOD1和SOD2蛋白质含量的相对定量（归一化为肌动蛋白）。(H（H）)过氧化氢酶和过氧化氢酶表达水平的Western印迹分析(我)过氧化氢酶蛋白质含量的相对定量（归一化为肌动蛋白）。

ALS小鼠症状前运动神经元的蛋白质组重构

为了研究SODG93A突变对小鼠运动神经元的广泛影响，我们使用无标签蛋白质组学进行了大规模的分子研究。首先，我们评估了差异蛋白质组数据集中过度表达的细胞功能（基因本体术语（GO术语））。结果表明，属于FAO、TCA循环、糖酵解和OXPHOS等几种途径的能量转换酶增加（图3A级)此外，与蛋白质翻译、折叠或复杂组装相关的不同功能也被过度表达。同样，在症状前型ALS小鼠运动神经元中观察到与mRNA剪接、染色体分离和染色质组织相关的蛋白质过度表达。

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图3

SODG93A ALS小鼠运动神经元蛋白质组。（A）与小鼠参考转录组相比，ALS小鼠运动神经元蛋白质组中过度表达GO术语。(B)SODG93A ALS小鼠运动神经元和野生型小鼠运动神经元蛋白质组的比较。进行灵巧路径分析以确定路径显著不同（p<0.05）。−log p值显示在橙色线和底部横坐标中。差异蛋白质组中发现的途径中的蛋白质百分比在顶部横坐标中给出。(C类)ALS小鼠运动神经元蛋白质组重构的预测主要调控因子表。

其次，我们比较了SODG93A和WT小鼠运动神经元的蛋白质组。这项分析确定了两组运动神经元（ALS与WT，p<0.05). 共有290个蛋白在ALS中过度表达（倍数变化范围为1.12到>1000），206个蛋白被抑制。对受这些变化影响的细胞功能的全局分析，考虑到过度表达或表达不足的蛋白质，以–Log为界(第页值）>2.5，使用独创性途径分析进行(IPA，图3B公司)ALS和WT运动神经元之间差异最大的五条IPA通路是“EIF2信号”（p = 2.61 E-14）’，‘TCA循环（p = 2.14 E-13）'，'线粒体（dys）功能（p = 2.11 E-11）'，'氧化磷酸化（p = 2.29 E-8）和tRNA充电（p = 1.15 E-6）”。值得注意的是，在SOD运动神经元中，“胆固醇生物合成的超级通道（通过甲羟戊酸）”也被上调，其−log p = 2.82.

ALS和WT小鼠运动神经元的前两个蛋白质网络存在显著差异（补充图^第1部分和^B分别为“蛋白质合成、蛋白质降解、细胞组装和组织”（得分38）和“脂质代谢、小分子生物化学、能量生产”（得分28）。寻找ALS中观察到的蛋白质组差异的预测调节因子与WT运动神经元识别出4种抑制因子（p<0.05）和8个激活的（图3C公司). 蛋白质组分析还表明，由于参与这些功能的特定蛋白质的表达增加，ALS小鼠运动神经元中的神经发生和细胞突起的形成可能被激活（补充表^{S1（第一阶段）}). 预测的变化（激活Z评分 > 其他细胞功能如“细胞死亡”、“细胞骨架组织”、“微管动力学”、“DNA片段化”和“脂肪酸浓度”也在该分析中检测到（补充表^{S1（第一阶段）}). 总之，蛋白质组学调查表明，ALS小鼠运动神经元的代谢机制发生了重要改变，尤其是涉及氧化能量代谢的分子系统得到了增强。《京都基因和基因组百科全书》（KEGG）对ALS运动神经元蛋白质组中过度表达的蛋白质进行了途径分析，对典型代谢途径的变化提供了更详细的描述（补充表^S2系列)它显示了大量差异（FDR<0.05）在能量传递途径中，如OXPHOS、TCA循环、支链氨基酸降解、丙酸代谢、糖酵解和脂肪酸氧化。这些变化的代谢图如图所示4表明线粒体的主要差异，ACAT2（酮代谢）显著增加。除了能量代谢外，在ALS小鼠运动神经元中过度代表的KEGG通路中，还观察到内质网中的溶酶体、吞噬体和蛋白质加工（补充表^S2系列). 最后，对ALS小鼠运动神经元中表达不足的蛋白质进行KEGG分析（补充表^第3章)显示出显著的（FDR<0.05）“核糖体”、“剪接体”和“内质网蛋白质加工”类成分的改变。核糖体蛋白质变化的详细分析如表所示1在代表性不足的KEGG途径中还鉴定了两种参与酮体合成和降解的蛋白质，即3-羟基丁酸脱氢酶1（BDH1）和3-氧代酸-CoA转移酶1（OXCT1）。最后，KEGG对ALS小鼠运动神经元中低表达通路的分析（补充表^第3章)确定了间隙连接、局部粘附和紧密连接，表明运动神经元的细胞粘附过程可能发生改变。

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图4

SODG93A ALS运动神经元的蛋白质组重塑。SODG93A ALS运动神经元代谢蛋白质组重构图。过度代表的蛋白质以红色显示，相应的折叠变化（SOD/WT）在每个蛋白质的名称后给出。

ALS患者皮肤成纤维细胞OXPHOS解耦与蛋白质组重构

与小鼠运动神经元类似，我们比较了取自ALS患者的人类皮肤成纤维细胞的线粒体生物能量学和蛋白质组组成（补充表^S4系列)对照组（男性58岁，女性46岁）。呼吸分析首先显示OXPHOS偶联减少，通过寡霉素的减少效果进行评估，而常规呼吸没有改变（图5A级). OXPHOS偶联的减少与ALS患者皮肤成纤维细胞中稳态ATP水平的相应降低和ADP含量的增加有关（图5A级). 与对照组相比，患者成纤维细胞的解偶联比率（FCCP刺激呼吸/寡粘菌素处理呼吸）也降低了（图5A级)。

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图5

ALS患者皮肤成纤维细胞的生物能量变化和蛋白质组重塑。（A）常规条件下皮肤成纤维细胞的呼吸，以及呼吸控制率（常规/低氧呼吸）和解耦比（FCCP/低氧霉素呼吸）的计算。(B)在皮肤成纤维细胞中测定ADP/ATP比率。(C类)ALS皮肤病患者成纤维细胞的蛋白质组分析（过表达试验）。(天)ALS皮肤病患者成纤维细胞和健康人成纤维细胞蛋白质组的比较。进行了灵巧路径分析（IPA），路径差异为−log第页价值 > 5所示。(E类)ALS适应性代谢的生物能量模型显示了HADHA、ACAT2、UCP2和HMGCS1的作用。在这个假设模型中，ALS运动神经元转向FAO和氨基酸降解，以传递能量，但反过来生成乙酰辅酶A，然后可用于脂肪酸合成、酮生成和胆固醇合成。因此，必须在FAO的使用和乙酰辅酶a的消除之间保持微调，以促进细胞存活，UCP2可以在这一平衡中发挥中心作用。在我们的模型中，FAO生产的乙酰辅酶A用于氧化磷酸化（路线1）或酮生成和胆固醇合成（路线2）取决于UCP2（路线2等.¹⁶根据这一假设，（i）用京尼平抑制UCP2导致细胞ATP水平增加（阻断路线1；图2安培)，而ii）使用曲美他嗪（HADHB抑制剂）阻断FAO会降低SOD运动神经元的细胞活力（阻断途径1），对野生型细胞的影响较小（图5E）。该模型考虑了先前的发现，这些发现表明VDAC被ALS中突变的SOD阻断²，迫使细胞依赖脂肪酸等外膜扩散能源。它还考虑了最近发现的ALS患者脑脊液中胆固醇的积聚³³.

对ALS皮肤成纤维细胞的蛋白质组进行了过度表达试验（图5亿)糖酵解、翻译、蛋白质折叠、蛋白质复合物生物生成、蛋白质复合体组装和tRNA氨酰化的蛋白质表达变化丰富。为了更好地分析ALS人类皮肤成纤维细胞的蛋白质组特异性，我们将其与从年龄匹配的健康个体中获得的皮肤成纤维纤维细胞进行了比较。这种比较在ALS皮肤成纤维细胞中鉴定出115种过度表达的蛋白质和262种表达不足的蛋白质。灵巧路径分析（图5摄氏度)显示了“EIF2信号”、“TCA循环”、“氧化磷酸化”、“脂肪酸氧化”、“上皮粘附连接重塑”和“糖酵解”的主要变化（见表中的完整列表^第5章). 对细胞代谢途径变化的更详细研究（使用IPA的“毒理学”模块）表明，“脂肪酸代谢”、“NRF2介导的氧化应激反应”和“PPARα/RXRα途径激活（p<0.05)’. 补充表中列出了观察到的蛋白质组变化的主要预测调节因子^S6系列特别是，IPA预测了三种转录因子（TFAP2A、JUNB和PDX1）的激活以及其他五种转录因子的抑制（HSF1和HSF2参与蛋白质毒性应激反应，NFE2L2参与抗氧化反应，MYCN和MYC参与细胞重编程）。关于MYC，在差异蛋白质组中发现了85个该转录因子的靶点（补充图^S2系列). IPA也预测了mTORC2中心成分RICTOR的激活（32个靶基因；补充图^S2系列)。

过表达蛋白质的KEGG分析（FDR<0.05）ALS患者的皮肤成纤维细胞显示“内质网蛋白质加工”、“局部粘连”和“紧密连接”丰富（表2). 关于代谢途径的变化，参与脂肪酸氧化的线粒体三功能蛋白复合体的两个亚单位（HADHA和HADHB）过度表达。ALS小鼠运动神经元的另一个相关主要变化是ACAT2的表达，ACAT2是一种参与FAO主要最终产物乙酰辅酶a可逆生成酮类的蛋白质。最后，对ALS患者皮肤成纤维细胞中低表达蛋白的分析显示<0.05）糖酵解、核糖体、局部粘附、蛋白酶体、RNA转运、脂肪酸降解和磷酸戊糖途径的成分减少（表^第7部分)。

小鼠运动神经元和患者皮肤成纤维细胞的培养

运动神经元是从12.5天SOD1-G93A（ALS）和“野生型”对照同窝（杂合）小鼠胚胎（杂合雌性与纯合子SOD1-G93雄性的胎仔）的胚胎腹侧脊髓分离获得的，如⁶¹简单地说，整个脊髓被解剖并按基因型重新分组。取出背根神经节和脑膜以及脊髓的背侧部分。剩余的腹侧脊髓用胰蛋白酶切割和分离，细胞通过OptiPrep密度梯度培养基通过密度梯度离心分离。含有运动神经元的组分被仔细收集并通过BSA垫过滤，纯化后的运动神经元接种在多聚赖氨酸和层粘连蛋白涂层的培养皿上。培养物在补充有2%B27、2%灭活马血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素以及谷氨酸、谷氨酰胺和神经营养因子（GDNF 10 μg/ml，BDNF 1 μg/ml，CTNF 1 μg/ml），在5%CO中₂在37 摄氏度。在所有实验中，对DIV 3和DIV 5之间的细胞进行分析，以确保最小的胶质细胞侵袭。当提及培养中的初级神经元时，术语“DIV”广泛用于神经科学领域，意思是“天”在体外’. 分析不同代谢处理后神经元细胞死亡的方法改编自Szelechowski等.⁶²简而言之，用SMI32和DAPI对培养物进行染色，并在每个培养病例随机拍摄的3张照片上手动评估SMI32阳性细胞内的固缩核数量（20x，开放场荧光显微镜，徕卡）。在3个独立实验中，每个病例和每个实验至少分析100个神经元。

从ALS患者和对照组年龄和性别匹配的受试者的手臂上采集原代皮肤成纤维细胞。根据《赫尔辛基宣言》，所有患者均在波尔多医院ALS参考中心招募，并出具书面知情同意书以参与本研究。细胞生长在含有5 mM葡萄糖，补充15%胎牛血清、100U/ml青霉素和100U/ml链霉素，在5%CO2中，37 摄氏度。在所有实验中，细胞都是在70%融合率下的指数生长期采集的。在同一天生成原代成纤维细胞系，在进行各种实验（P4至P6）时，细胞经历了相同的传代次数（P）。

生物能量测量

XF96分析仪（SeaHorse Biosciences）在XF分析培养基中分析运动神经元的呼吸，而皮肤成纤维细胞的呼吸则使用高分辨率呼吸测定法（Oroboros）进行评估。术语“常规”呼吸被定义为在5 37℃大气条件下的mM葡萄糖DMEM °C，对2.5敏感 µM抗霉素A抑制作用。术语“低氧”呼吸是指添加F后在常规条件下测得的呼吸频率₁F类₀ATP合成酶抑制剂寡霉素20 µg/ml。这种“低聚”呼吸状态不依赖于ADP磷酸化。术语“FCCP”呼吸定义了添加在2 微米。“FCCP”状态允许评估存在能量基质和“常规”条件中定义的氧气浓度时呼吸链的最大容量。“常规/寡核苷酸”比率可以量化常规条件下呼吸链与ADP磷酸化的耦合程度。FCCP/常规比率给出了呼吸链化学解偶联能力的度量。它表明常规呼吸操作离最大容量有多远。为了分析运动神经元的生物能量学，我们使用了SeaHorse细胞外流量分析仪（XF96）。对于每次运行，我们在96孔板中每孔电镀10.000个细胞。每个条件在3-5个孔中重复（技术重复），该实验重复3次（生物重复）。呼吸速率表示为每10.000个细胞。小鼠运动神经元的原代培养获得如下：通常，一个培养皿取自5个不同的同窝胚胎（混合）。因此，生物复制对应于不同的培养物，每个培养物都来自5种动物。

我们使用Oroboros系统检测ALS患者的原代皮肤成纤维细胞。每次运行时，每毫升细胞培养基使用100万个细胞。对三种不同的培养物进行了三次技术复制（生物复制；N = 3). 每百万个细胞的呼吸速率正常化。使用生物发光ATP测定试剂盒（分子探针，生命技术公司）测量运动神经元的细胞内ATP含量。20 uL 5的细胞悬液 × 10⁵将SOD1G93A或野生型运动神经元/mL置于96周板中。在DIV 5上，用京尼平（20 微米，45 min），使用试剂盒（30）提供的裂解缓冲液进行裂解 μl/孔），然后立即将裂解物转移到保存在冰中并避光的带注释的试管中。ATP浓度是通过发光荧光素酶催化的荧光素与ATP的氧化以及在光度计上的生物发光测量来确定的（Luminoskan，Labsystems，芬兰）。使用随试剂盒提供的已知数量的标准ATP进行标准化。用四甲基罗丹明甲酯（TMRM）荧光成像法测定培养的小鼠运动神经元线粒体跨膜电位。简单地说，细胞与20 20期间的nM TMRM 37时的最小值 在配备Vivatome系统的蔡司Axio Observer显微镜上进行°C和共焦荧光显微镜检查，该系统带有63x油弹簧加载物镜。这些图像是使用AxioVision（6D采集和活体模块）采集的。在每个实验条件下，从三个不同的实验中随机选择至少30个不同的细胞，并使用Morphostryder（Explora Nova）对荧光信号强度进行分析。

线粒体形态学分析

测量个体化SOD和WT运动神经元的所有神经突的线粒体长度。线粒体外膜蛋白Tom20染色显示线粒体网络。使用ImageJ软件测量和记录线粒体长度，如⁶²对于每个神经元，线粒体小管按大小类别排序（短：<2uM；中：2-6uM；长：>6 uM）。我们分析了每种培养物中的20个运动神经元，每个神经元来自每个基因型的3到5个不同的同窝幼崽，进行了3次独立培养以进行分析。

蛋白质组学和westernblot

样品制备和蛋白质消化、nLC-MS/MS、数据库搜索和结果处理以及无标签定量数据分析的步骤在⁶³简而言之，肽混合物在Ultimate 3000纳米LC系统（Dionex）和纳米喷雾LTQ-Orbitrap XL质谱仪（ThermoFinnigan，San Jose，CA）上进行分析。SEQUEST通过Proteome Discoverer 1.4（Thermo Fisher Scientific Inc.）搜索数据。原始LC-MS/MS数据导入Proggeneration LC-MS 4.0（英国纽卡斯尔非线性动力学有限公司），数据处理包括以下步骤：（i）特征检测，（ii）12个样品的特征对齐，（iii）2-6个电荷态离子的体积积分，（iv）总蛋白丰度的归一化，（v）序列信息导入，（vi）肽水平的方差分析测试和特征筛选<0.05，（vii）蛋白质丰度的计算（相应肽的体积总和），（viii）蛋白质水平的方差分析测试和特征p的过滤<0.05. 值得注意的是，在蛋白质水平上计算时只考虑了非冲突特征和独特的肽。使用IPA（Qiagen）、KEGG（String）和Panther进行通路分析。按照⁶³在本研究中，我们使用了以下抗体：SOD1（ab13498）、SOD2（ab13533）和过氧化氢酶（ab16731）。

活性氧的产生和谷胱甘肽REDOX状态的测定

对细胞进行胰蛋白酶处理并计数，以获得1的细胞悬浮液 × 10⁶细胞/mL。胞浆H的变化₂O（运行）₂使用CM-H监测水平₂DCFDA探头。将探针添加到细胞悬浮液中并孵育30 37分钟 °C，根据制造商协议。然后在PBS中清洗细胞两次，并在Xenius荧光光谱仪（法国摩纳哥SAFAS）上的石英试管中测量荧光。进行第二次读数，增加100 微米高₂O（运行）₂在试管中验证CM-H的响应和无饱和₂DCFDA探头。添加H后信号立即增加₂O（运行）₂以剂量依赖的方式。为了评估GSH/GSSG的比率，我们使用了Abcam的检测试剂盒（ab138881），遵循制造商的协议。

统计分析

本研究中提供的所有数据均对应于n个实验的平均值 ± SD，最小n≥3。使用Student t检验或双向方差分析检验（包括Sidak使用Prism 7（Graphpad软件）的多重比较）对数据集进行比较。当P<0.05. 在进行未配对t检验之前，我们通过正态性检验（Prism 7，GraphPad软件）验证了数据的高斯分布。

作者感谢波尔多大学动物研究所的Pierre Costet提供的宝贵帮助。我们也感谢朱塞佩·菲尔蒙特博士的科学讨论。最后，我们感谢支持这项工作的资助组织：法国控制肌病协会-Téléthon（AFM-Teléton；Grant‘Savenerg’）、巴西国家康复机构（ANR；Grant COSMIT 2015-0451）、巴西技术和科学发展国家顾问（CnPQ）、CAPES-COFECUB、，细胞测定仪和INSERM。