高糖对分化期足细胞能量代谢和糖尿病肾病的影响

细胞耗氧量

在37°C的1 ml恒温控制室（1.0×10）中监测完整足细胞的内源性细胞耗氧量⁷cells/ml/run），配备了克拉克氧电极（英国诺福克汉萨特仪器有限公司）。内源性呼吸速率以毫摩尔O表示₂每分钟/10⁵细胞。数据收集自每种情况下的3个独立烧瓶。

细胞和线粒体ATP合成

收集足细胞并将其重新悬浮在浓度为5×10的培养基中⁵细胞/ml。细胞悬液（0.1 ml/管）在37°C下培养45分钟，加入或不加入5μl 100 mM抗霉素（Sigma-Aldrich）以阻止线粒体呼吸和ATP合成。培养后，用细胞裂解缓冲液（ATP生物发光检测试剂盒CLS II；瑞士巴塞尔罗氏）处理细胞，并通过生物发光测定释放到培养基中的ATP含量(21). 线粒体产生的ATP计算为总ATP含量减去存在抗霉素时测得的ATP含量。

乳酸浓度

细胞培养基用10-kDa MW截止旋滤器脱蛋白以去除乳酸脱氢酶。通过使用酶测定法（乳酸测定试剂盒；Sigma-Aldrich）测定乳酸浓度。

线粒体生物发生评价

我们测量了过氧化物酶体增殖物激活受体γ辅活化因子1α（PGC-1α）的线粒体DNA（mtDNA）含量和mRNA水平。收集培养的足细胞后，通过使用DNeasy血液和组织试剂盒（Qiagen，Valencia，CA，USA）提取总DNA，并通过使用RNeasy Plus Mini试剂盒（Qiagen）提取总RNA。使用1μg总RNA和50个单位的M-MuLV逆转录酶（RNase H）在20μl体积内合成第一链cDNA⁻)和寡核苷酸d（T）₁₆（美国加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）。如前所述，使用IQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）在热循环器CFX96 Touch实时PCR系统（Bio-Read）上对核DNA、mtDNA和PGC-1αmRNA进行实时定量PCR(22). 使用CFX管理器软件程序（Bio-Read）计算内生参考值的标准化单位（RPLP0和GUSB）。

呼吸链复合物和柠檬酸合成酶酶活性的测定

所有分析均在200µl Tp II：甘露醇缓冲液（225 mM甘露醇、75 mM蔗糖、10 mM TrisHCl、0.1 mM EDTA、pH 7.2）中进行。所有结果均按蛋白质浓度标准化（BCA蛋白质测定；皮尔斯，罗克福德，伊利诺伊州，美国）。我们测定了几种呼吸链复合物（复合物III和IV）和柠檬酸合成酶的酶活性，如前所述(23).

蛋白质印迹

如前所述进行Western blot(22)通过使用以下抗体：PGC-1α（P-19；sc-5815，1:100；Santa Cruz Biotechnology，Santa Cru z，CA，USA）、核呼吸因子-1（NRF-1；ab55744，1:500；Abcam，Cambridge，United Kingdom）、转录因子A、线粒体（TFAM；ab119684，1:500:Abcam）、AMPK（2532，1:1000；Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA，仅在苏氨酸172（2531，1:1000：细胞信号技术）、丝氨酸-苏氨酸肝激酶B1（LKB1；ab15095，1:100；Abcam）和雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR；ab87540，1:200；Abcam）磷酸化时，检测内源性AMPKα。

活性氧测量

使用CM-H监测活性氧物种水平的变化₂DCFDA探头（C6827；赛默飞世尔科技公司）。在96个孔（20000个细胞/孔）中对细胞进行电镀。将探针添加到细胞培养基中，并在37°C下培养30分钟。H的₂O（运行）₂使用10µl作为阳性对照。荧光在Xenius荧光光谱仪上测量（法国摩纳哥萨法斯）。

无标签定量蛋白质组学

该分析由波尔多大学蛋白质组研究所进行(http://www.cgfb.u-bordeaux2.fr/en/synthesis蛋白质组). 样品制备和蛋白质消化、纳米级液相色谱-串联质谱分析、数据库搜索和结果处理的步骤如前所述(24). 使用Proggeneration液相色谱-串联质谱4.0软件（非线性动力学，英国纽卡斯尔）进行无标签定量数据分析。数据处理包括以下步骤：1)特征检测，2)要素对齐，三)2-6个电荷态离子的体积集成，4)蛋白质总丰度的标准化，5)序列信息导入，6)肽水平的方差分析测试和特征筛选P（P）< 0.05,7)蛋白质丰度的计算（相应肽的体积总和），以及8)蛋白质水平的方差分析测试和特征过滤P（P）< 0.05. 值得注意的是，在蛋白质水平上计算时只考虑非冲突特征和独特肽。我们选择了表达水平变化大于20%且具有统计意义的蛋白质(P（P）<0.05）两组之间(n个=每组3人）。此外，在检索相互作用基因/蛋白质（STRING）数据库的搜索工具中，使用《京都基因百科全书》和基因组分析，根据其功能对这些蛋白质进行分类(http://string-db.org). 对数据进行了更全面的分析通过使用灵巧路径分析（Qiagen）。

定量PCR芯片分析

在本研究中，我们使用了2种不同的定量PCR微阵列：人类葡萄糖代谢RT²Profiler PCR阵列（Qiagen）和人类转录因子RT²轮廓仪PCR阵列（Qiagen）。

内核糖核酸酶前体小干扰RNA分析

第12天，我们在4种条件下用内核糖核酸酶前体小干扰RNA（esiRNA）转染细胞：esiRNA增强的绿色荧光蛋白、esiRNA肌生成因子5（MYF5）、esiRNA-肌细胞特异性增强因子2C（MEF2C）和esiRNA MYF5+MEF2C。使用来自Sigma-Aldrich的人类esiRNA和Dharmacon RNA Technologies（美国科罗拉多州拉斐特）提供的Dharmafect转染试剂。我们在无血清培养基中制备5µM esiRNA溶液，将其与Dharmafect转染试剂混合，并在室温下培养20分钟。然后，添加无抗生素的完整培养基，使最终的esiRNA浓度达到25 nM。我们取出烧瓶中的培养基，并为每种情况添加适当的esiRNA溶液。足细胞在5 mM葡萄糖中培养。在第15天，从足细胞中提取蛋白质。

人足细胞分化过程中生物能量机制的分子变化

为了研究足细胞分化过程中的分子变化，我们比较了d 0–3、3–7和7–15之间的蛋白质组(表1). 在这三个时期内表达水平发生变化的蛋白质中，约有8%属于线粒体(图2A类,B)，蛋白酶体构成了最大的群体（>30个蛋白质）。然后，在这两个时期，与糖酵解/糖异生、草甘膦和三羧酸（TCA）循环相关的>10个蛋白质也增加了。从第7天到第15天(图2C类)大量与核糖体生物发生和功能相关的蛋白质（>40）增加，这表明蛋白质翻译和细胞重编程处于一个强烈的阶段。特别是，参与糖酵解/糖异生的酶（>20个蛋白质）、氧化二磷（>15个蛋白质），支链氨基酸降解（>10个蛋白质）和TCA循环（>10种蛋白质）使其含量增加了20%以上(P（P）<0.05）。

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图2。

A类——C类)足细胞从第0天到第3天的差异蛋白质组分析(A类)，从第3天到第7天(B)，以及从第7天到第15天(C类). 表达水平变化大于20%的蛋白质具有统计意义(P（P）<0.05）被京都基因和基因组百科全书（KEGG）分析选择和分类。图表显示了前25类蛋白质的数量。D类)KEGG分析仅将HG中与HG中蛋白质相比减少的蛋白质（变化>20%，具有统计意义）归类为功能组。条形图显示了前20个类别中减少的蛋白质数量。E类)足细胞分化和HG条件下复合物V和亚单位表达变化的示意图。增加的蛋白质以红色显示，减少的蛋白质以蓝色显示（每个亚单位中显示了折叠变化）。ECM，细胞外基质。

人足细胞分化过程中oxphos系统的顺序构建

在上述3个分化阶段，牛肝素的成分没有同时增加(表2). 与复合物I相比，呼吸链复合物IV和V的亚单位在后期增加。特别是，F的F1催化结构域的α和β亚单位的合成₁F类₀ATP合成酶复合物在足细胞分化的最后阶段增加(表2和图2E类). 蛋白质组分析还显示，在足细胞分化过程中，大多数糖酵解酶降低(表2). 根据氧化转变，与脂肪酸、氨基酸或酮类给草磷加燃料有关的蛋白质也上调(表2).

在高糖条件下足细胞发生糖酵解转换

在含有8种不同葡萄糖浓度的培养基中从第7天至第15天培养的早产足细胞显示乳酸水平增加(图3A类)这暗示着存在糖酵解开关。虽然临床上观察到血糖浓度高于7 mM时会出现高血糖，但糖尿病症状通常要到15-20 mM才会明显在体外使用20 mM葡萄糖进行研究。在高糖（HG；20 mM）中，足细胞对oxphos产生细胞ATP的依赖性降低，而与在正常葡萄糖（5 mM；图3B). 这种代谢转换的部分原因是线粒体生物发生减少，如PGC-1α、NRF-1和TFAM的表达以及线粒体DNA的含量在HG条件下降低(图3C类). 因此，柠檬酸合成酶（线粒体活性含量的指标）的活性在这些条件下也会降低(图3C类).

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图3。

A类)分析第11天至第13天的培养基（左：葡萄糖浓度从左到右分别为0、2.5、5、7.5、10、15、20和30 mM；右：分别为5 mM葡萄糖、5 mM葡糖和5 mM甘露醇的培养基，以及从左到右侧分别为5 mmM葡萄糖和15 mM甘露醇的培养液）。培养基的代表性图像（顶部）。培养基的pH值（中间）。培养基中的乳酸水平（底部）。P（P）图中显示了单因素方差分析的值。B)在正常葡萄糖（NG；5 mM）或HG（20 mM）条件下培养时测量足细胞ATP含量。分析了足细胞中的总ATP、线粒体ATP和糖酵解ATP含量，以及氧化二磷对总ATP含量的贡献。C类)用定量PCR检测PGC-1αmRNA的表达。通过Western blotting检测PGC-1α、NRF-1和TFAM的表达。用定量PCR分析HG或NG培养基中足细胞的mtDNA/nDNA比值。柠檬酸合成酶酶活性作为完整线粒体含量的定量标记，也在NG或HG培养的足细胞中进行了测量。D类)分析在NG或HG中培养的足细胞中复合物III和IV的酶活性。E类)在有或没有氧化应激条件下监测在NG或HG中培养的足细胞的活性氧（ROS）水平的变化。F类)通过Western blotting分析HG或NG培养基中培养的足细胞中总AMPK、Thr172-磷酸化AMPK，LKB1和mTOR的表达水平。GUSb，β-葡萄糖醛酸酶；RPLP，核糖体磷酸蛋白。直方图表示平均值±标准偏差. *P（P）< 0.05, **P（P）<0.01，未成对学生t吨测试。

HG触发人足细胞的代谢重编程在体外

我们对生长在20 mM（HG）或生长在5 mM葡萄糖（正常葡萄糖）中的足细胞在第7天到第15天之间进行了差异蛋白质组分析。HG培养的足细胞中有31个线粒体蛋白减少(表1). Oxphos受到严重影响，减少了>10个蛋白质。中间代谢的关键成分，如谷氨酰胺水解或TCA循环发生改变(表2). 一方面，在呼吸链水平，复合物III、IV和V的关键成分减少(表2)以及ADP磷酸化的关键成分，如ATPsynthase(图2E类)、ANT2和线粒体磷酸载体。呼吸链酶活性测定证实复合物III和IV的减少(图3D类). 另一方面，在HG条件下，5种糖酵解酶的含量增加(表2). HG中的乳酸脱氢酶A也增加（+48%），这与图3A类最后，蛋白质组分析表明，抗氧化酶，如过氧化氢酶（+86%）、谷胱甘肽S转移酶（+65%）、谷谷胱甘苷S转移酶ω1（+21%）、硫氧还蛋白还原酶（+59%）和过氧还蛋白2（+51%）在高血糖状态下增加。这可能与H的较高稳态连续₂O（运行）₂在HG条件下测量的水平(图3E类).

HG介导足细胞糖酵解开关的调控

首先，我们观察到在HG条件下生长的足细胞中LKB1-AMPK通路的改变，该通路是牛磺酸的主要调节器(图3F类). 84个参与糖代谢基因的mRNA含量分析(图4A类)此外，高血糖刺激了糖酵解，但也激活了oxphos抑制剂丙酮酸脱氢酶激酶1（PDK1）的表达(25). 寻找参与高血糖诱导的代谢重编程的潜在转录因子(图4B)MEF2C和MYF5下降。先前的研究表明，MEF2C控制氧化代谢许多成分的表达，尤其是PGC-1α(26). 因此，通过在人足细胞中使用esiRNA同时下调MEF2C和MYF5，触发了呼吸链复合物IV的显著下调(图4C类)和PGC1-α(图4D类). 在这些条件下，MEF2C和MYF5的双重抑制也改变了podocin的表达(图4E类). 值得注意的是，单独使用单个esiRNA对抗MEF2C或MYF5并没有改变复合物IV、PGC-1α或podocin的水平(图4C类——E类). MEF2C和MYF5之间的这种协同作用先前被描述为肌生成素的协同反式激活(27). 我们进一步观察到MEF2C控制MYF5的表达(图4F类)相反的情况没有发生（数据未显示）。除了能量代谢和MEF2C-MYF5合作在减少PGC-1α和oxphos中的作用外，HG攻击足细胞的细胞信号通路的变化列于表3如上所述，Ingenuity Pathway Analysis软件确定NRF-2介导的氧化应激反应在HG条件下激活，以及糖酵解和线粒体功能障碍。

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图4。

A类,B)84个糖代谢相关基因mRNA水平的变化(A类)或DNA转录(B)通过定量PCR微阵列分析，在正常葡萄糖（NG）或HG中培养的足细胞之间。面板中的表格显示了两组基因的表达水平在统计学上存在差异。高血糖导致足细胞重塑的主要调节网络方案。C类——F类)综合体IV(C类)，PGC-1α(D类)和podocin(E类)用EGFP、MYF5的esiRNA培养足细胞的表达(F类)通过Western blotting检测MEF2C和MYF5+MEF2C。

作者感谢威尔士GI、学术和儿童肾脏科（英国布里斯托尔大学Southmead医院布里斯托尔分校）提供了人类足细胞，感谢Akira Hiwatashi博士（日本筑波筑波大学）和Mori Tachibana博士（日本国立医院组织千叶东方医院）提供了宝贵的技术咨询和帮助。这项工作得到了日本科学促进会（KAKENHI）拨款80348276（给T.I）、日本国立医院组织（给T.I.）和法国肌病防治协会的资助。作者声明没有利益冲突。