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细胞。作者手稿；PMC 2014年5月9日提供。
以最终编辑形式发布为：
单元格。2013年5月9日；153(4): 828–839.
数字对象标识：10.1016/j.cell.2013.04.015
预防性维修识别码：PMC3677132型
美国国立卫生研究院：美国国家卫生研究院465691
PMID：23663781

生长分化因子11是一种逆转年龄相关性心脏肥大的循环因子

弗朗西斯科·洛夫雷多,1中，2 马修·斯坦豪泽,2 史蒂文·杰伊,1,2 约瑟夫·甘农,2 詹姆斯·潘科斯特（James R.Pancoast）,2 普拉图沙·雅拉曼奇,2 马尼沙·辛哈,1中，三 克劳迪娅·达尔·奥斯索,1,三 Danika孔,1,三 詹妮弗·沙德拉赫,1,三 克里斯汀·米勒,6 布丽塔·S·辛格,4 埃里克斯·斯图尔特,4 尼古拉斯精神病学,5 罗伯特·E·格什滕,5 亚当·哈蒂根,1,6 Mi-Jeong Kim女士,6 托马斯·塞沃尔德,6 艾米·J·瓦格斯,1中，三，6,*和理查德·李1,2,*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

总结

最常见的心力衰竭发生于收缩功能正常的老年人，常伴有心肌肥厚。为了阐明衰老过程中导致心脏肥大的生物学机制，我们使用异慢性联体共生（一种不同年龄的动物联合起来形成共享循环的外科技术）测试了循环因素的影响。暴露于幼年小鼠的循环中4周后，老年小鼠的心肌肥厚显著减轻，伴随着心肌细胞尺寸减小和分子重塑。年龄相关性肥大的逆转并非归因于血液动力学或联体共生的行为效应，这与血液传播因素有关。利用改良的适配体蛋白质组学，我们确定TGFβ超家族成员GDF11是随着年龄增长而下降的年轻小鼠的循环因子。对老年小鼠进行治疗，使GDF11恢复到年轻水平，再现了共生和逆转与年龄相关的肥大的作用，为心脏衰老提供了新的治疗机会。

引言

在与年龄增长相关的疾病和障碍中，最使人衰弱的一种是正常心功能丧失导致心力衰竭。大约1%的50岁以上的人患有心力衰竭，超过5%的75岁以上的人群患有心力衰竭。随着我国人口中老年人比例的持续急剧上升(Schocken等人，2008年)，与年龄相关的心力衰竭越来越普遍。

与“收缩性心力衰竭”相比，大多数与年龄相关的心力衰竭发生在收缩功能正常的情况下，称为“舒张性心力衰竭”(Aurigemma，2006年). 尽管收缩期心力衰竭的治疗取得了进展，但在过去二十年中，疗效有了显著改善，而舒张性心力衰竭的治疗进展则更为难以捉摸(Hunt等人，2009年). 事实上，有人可能会说，对于伴随年龄增长而出现心室“僵硬”并伴有舒张功能障碍的患者，目前还没有专门的治疗方法(Kitzman和Daniel，2007年).

新的证据表明，系统因素深刻影响组织老化。其中一些数据来自19世纪首次开发的联体共生实验模型第个世纪(Finerty，1952年). 在联体共生中，两只小鼠通过外科手术连接在一起，通过共同的循环系统在生理水平上快速、持续地交换细胞和可溶性因子，从而形成共同的血液循环(Wright等人，2001年). 这对动物可能是同一年龄段（等时抛物面）或不同年龄段（异时抛物面）。由于联体小鼠仅通过其共同循环进行连接，因此联体是一个强有力的模型，可以确定循环因素是否可以改变组织功能(Balsam等人，2004年;Brack等人，2007年;Conboy等人，2005年;Eggan等人，2006年;Ruckh等人，2012年;Sherwood等人，2004年;Villeda等人，2011年;Wagers等人，2002年;Wright等人，2001年). 异慢性联体共生实验表明，来自年轻循环的血传信号可以显著影响老化组织的功能，如内源性“老”的适当激活和功能的恢复所示骨骼肌卫星细胞与暴露于“年轻”系统环境后损伤后的成功肌肉修复(Conboy等人，2005年). 相反，将幼鼠暴露在旧的系统环境中可以抑制肌肉发生（Brack等人，2008）和神经发生(Villeda等人，2011年)在小老鼠身上。

心脏肥大是年龄相关性舒张性心力衰竭的一个显著病理特征(Aurigemma，2006年). 在这里，使用联体模型，我们证明暴露于年轻的循环环境可以逆转与年龄相关的心肌肥大。这些实验表明，衰老过程中的心肌肥厚至少部分由循环因子介导，并由此发现全身性GDF11（TGFβ家族成员）可以逆转与年龄相关的心肌肥大。这些数据表明，与年龄相关的舒张性心力衰竭至少有一种病理成分是激素性质的，并且是可逆的。

结果

异慢性联体共生逆转年龄相关性心肌肥厚

我们假设年轻小鼠特有的循环因子可能逆转心脏老化。为了验证这一假设，我们生成了异慢性副生物（HP）对，其中年轻雌性C57BL/6小鼠（Y-HP，2个月）通过手术与老年伴侣（O-HP，23个月）结合，并将其与在相同年龄结合的等时性副生物（IP）对（年轻-年轻，Y-IP，或老年-老年，O-IP）进行比较，和年龄和性别匹配的未配对小鼠作为对照（年轻的Y和老年的O）(图1A). C57Bl/6小鼠的心脏老化概括了人类心脏老化，包括与年龄相关的心肌肥大的发展(Dai等人，2009年)以性别无关的方式。分析前将益生菌对维持4周，并使用同源标记物区分老年（CD45.2+）和年轻（CD45.1+）伴侣的血细胞(Wright等人，2001年). 这一策略使我们能够监测配对中的血液嵌合体；然而，由于旧的CD45.1+小鼠无法在市场上买到，我们仅使用CD45.2+小鼠来生成等时老配对。加入后4周对小鼠实施安乐死，通过测量另一方血液或脾脏中供体衍生血细胞（CD45.1+）的频率，大多数配对（>90%）的小鼠证实了交叉循环(图S1).

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异慢性共生逆转与年龄相关的心脏肥大

（A） 实验方案。生成一对年轻的等时、异时和老年等时抛物线小鼠。联体共生术后4周，对小鼠实施安乐死，并采集组织进行分析。

（B） 暴露于年轻循环4周的老年小鼠的心脏尺寸减小。中脑室三色染色横切面。

（C） ●●●●。表示联体4周后心脏重量/胫骨长度比率的图表。与暴露于旧循环（O-IP）4周的老年小鼠和未配对的老年小鼠（O）相比，暴露于年轻循环（O-HP）的老年小鼠的心脏重量与胫骨长度之比显著降低。在比较老年等时小鼠与老年未配对小鼠或比较任何年轻组时，未观察到显著差异。

数据显示为平均值±标准误差图S1.

年轻血液循环对老年心脏的显著影响在肉眼观察中立即显现出来。暴露于年轻循环（O-HP）4周的老年小鼠的心脏明显小于O-IP小鼠的心脏。通过对取自中脑室内的短轴组织切片进行盲法比较，证实了这一观察结果(图1B). 我们还称量了献祭时的心脏重量，并将心脏重量标准化为胫骨长度，这是一种标准方法，可以校正身体尺寸的差异(Yoshioka等人，2007年)当使用老年小鼠时，这比体重正常化更合适(Jackson等人，2012年;Yin等人，1982年). 在联体共生4周后，与暴露于旧循环（O-IP）的老年小鼠相比，暴露于年轻循环（O-HP）的老年鼠的心脏重量与胫骨长度之比显著降低(7.93+/-0.19与9.61+/-0.21毫克/毫米，P<0.05，图1C).

接下来，我们通过对心脏组织学切片进行盲态形态计量分析来测试心肌肥大的总体消退是否是由于细胞肥大的变化引起的(图2A). 我们发现幼年小鼠的左心室心肌细胞横截面积与三种实验条件中的任何一种都没有显著差异(186.7±4.9微米2在Y中，243.1±12.1微米2在Y-IP中，232.2±16.4微米2在Y-HP中）。如公布数据所预期(Dai等人，2009年)，老等时心脏的平均心肌细胞横截面积显著大于(357.8±25.8微米2)和旧的非阿拉伯控制(348.3±12.6微米2)图2B). 然而，与O-IP心脏相比，暴露于年轻循环4周（O-HP）的衰老小鼠心脏的心肌细胞大小显著减小(220.4±21.9微米与357.8±25.8微米2，P<0.05）。因此，暴露于年轻的循环将老年心脏的肥大细胞表型逆转为年轻成年小鼠的典型形态学表型。

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暴露于年轻循环逆转年龄相关性心肌细胞肥大

（A） 联体共生术后4周对左心室进行定期酸性Schiff（PAS）染色。与老年等时对照组相比，暴露于年轻循环（老年异慢性）的老年小鼠的肌细胞较小。比例尺=20µm。

（B） 图示PAS染色后雌性小鼠心肌细胞横截面积。通过在5个独立的心肌切片中测量每只动物100–200个心肌细胞的横截面积（CSA）来确定心肌细胞大小。结果基于每组4至12只动物的平均CSA。

（C） 使用雄性小鼠进行与（B）相同的实验。

数据显示为平均值±标准误差。

为了评估可能的性别特异性影响，我们使用雄性小鼠重复了这些实验，并观察到暴露于年轻循环后年龄相关肥大的类似消退(图2C). 这些数据表明，性别不是年轻血液循环逆转年龄相关性肥大的因素。因此，通过系统因子的活动，男性和女性的年龄依赖性心肌肥大都可以逆转，这种年轻因子对这种年龄相关病理的显著影响仅在4周的联体共生中表现出来。

暴露于年轻循环的老年小鼠心肌肥大的逆转不能用血压降低来解释

这些数据提出的一个关键问题是，血液动力学效应是否可以介导异慢性联体后老年小鼠心肌肥厚减轻。为了探讨联体共生过程中的血液动力学问题，我们制作了女性异慢性副生物对（年轻、2个月和21个月），并将其与同等数量的年轻和老年等时副生物对以及与性别和年龄匹配的非阿拉伯对照组进行了比较，利用同源标记确定交叉循环的发展(图S2A).

小鼠加入实验10周，在此期间，我们使用计算机化尾剪断系统（BP-2000，Visitech Systems，Apex，NC）进行无创血压测量(Krege等人，1995年)我们改造后可以容纳抛物线小鼠(图3A). 非阿拉伯对照(图3B)，我们观察到老年雌性小鼠（23个月龄和21个月龄，n=32）的收缩压显著低于年轻（8周龄）CD45.2雌性小鼠（n=12）(98.3±1.8毫米汞柱对129.9±2.0毫米汞柱，P<0.05），但我们在比较老年CD45.2和年轻CD45.1雌性小鼠（n=16）时没有发现差异(98.3±1.8毫米汞柱对104.1±1.9毫米汞柱，P=ns）。两组之间的心率无差异(图3B). 这些数据表明，研究开始时血压或心率的差异不太可能解释O-HP小鼠心肌细胞大小和整体心室质量的随后变化。

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暴露于年轻循环中的老年小鼠心肌肥大的逆转不能用血压降低来解释

（A） ●●●●。收缩压是使用一个计算机化的尾剪断系统测量的，我们对该系统进行了改进，以允许同时测量抛物线对的两个成员的血压。

（B） 在未手术的年轻和老年小鼠的基础上测量收缩压和心率。与年轻CD45.1（2个月）小鼠和老年（21个月）小鼠相比，年轻（2个月）CD45.2小鼠表现出显著更高的收缩压，而年轻CD45.1和老年小鼠之间没有差异，所有组的心率也没有差异。

（C） ●●●●。使用（A）所示的系统，在小鼠连体后4周、7周和10周，同时测量所示副生物对的每个成员的血压。O-HP小鼠在7周和10周时收缩压显著升高；与基线值相比，O-IP小鼠在7周时血压显著升高。*：P<0.05

（D） 在配对小鼠连体10周后，通过同时进行末端动脉插管来测定平均动脉压。

（E） 通过基于动脉导管的终末测量，未发现组间血压存在显著差异。

数据显示为平均值±标准误差图S2.

为了进一步探讨副生物小鼠血流动力学变化的可能影响，我们还对异慢性配对小鼠进行了连续时间点的无创血压测量，并将其与10周内的等时年轻和老年配对小鼠进行比较。我们检测到任何组的年轻小鼠的血压随时间没有变化(图3C). 相反，与基线测量相比，暴露于年轻循环（O-HP）的老龄小鼠在第7周和第10周的收缩压显著升高，而等时线对的老龄成员在第7周时的血压显著升高。最后，我们在小鼠加入实验组10周后，通过同时进行微压导管插管，获得了最终的动脉内血液动力学轨迹(图3D). 在这些研究中，各组的平均动脉压没有显著差异(图3E). 安乐死后，通过测量来自一个伴侣（CD45.1+）的供体来源的血细胞在另一个伴侣（CD45.2+）的脾脏中的频率来确认交叉循环（数据未显示），心脏重量评估证实，与旧的对照组相比，10周实验中的O-HP小鼠的心脏重量-时间长度指数也显著降低(图S2B). 此外，与老伴侣一起生活10周的年轻小鼠的心脏大小没有改变，这表明，如果年轻小鼠是老年小鼠产生的肥大因子的汇，那么长时间接触老年循环不会导致年轻小鼠肥大(图S2B). 最后，与这些对副生性小鼠血压的直接测量结果一致，与参与等时性联体共生的年龄匹配的动物相比，参与异时性联体内血管紧张素II和醛固酮的循环水平没有差异（数据未显示）。因此，肾素-血管紧张素-醛固酮（RAA）轴的变化（众所周知其调节血压和容量的能力）不太可能导致老年异慢性副肢的心肌重塑。

综上所述，这些数据清楚地表明，在暴露于年轻循环的老年小鼠中观察到的心肌肥厚逆转不能简单地用血压降低或调节老年小鼠中已知的血压效应器来解释。这些数据进一步表明，年轻小鼠产生的抗肥大因子（而不是老年小鼠产生的促肥大因子的稀释）参与了异时共生诱导的心脏重塑。

年轻的CD45.1和CD45.2小鼠之间的血压差异不能解释心肌肥厚的逆转

由于与年轻CD45.2小鼠相比，年轻CD45.1小鼠在基线时的血压显著降低，因此我们重复了我们的联体实验，仅使用CD45.2鼠，以产生异慢性配对，其中年轻的CD45.2雌性小鼠（Y-HP，2个月）与老年CD45.2伴侣（O-HP，23个月）结合。在联体4周后，我们将这些异慢性小鼠与等时配对（Y-IP，2个月，或O-IP，23个月）进行比较。由于本实验中的小鼠基因相同，我们无法使用流式细胞术来验证这些配对中嵌合体的建立；然而，该模型的广泛经验强烈支持这样的结论，即在完全等基因对中有效地建立了交叉循环(Pietramaggiori等人，2009年).

与我们之前的研究一样，与O-IP动物（n=22）相比，通过联体接触年轻CD45.2小鼠的循环导致O-HP CD45.2鼠（n=18）的心脏重量与胫骨长度之比降低(8.03+/-0.38与9.07+/-0.24 mg/mm，P<0.05，图4A). 与O-IP相比，O-HP小鼠的心肌细胞横截面积也显著减少(286.3±22.7微米与366.4±25.4微米2，P<0.05，图4B). 仅使用CD45.2小鼠的异慢性配对的老年伴侣在4周后也显示出与加入年轻CD45.1伴侣的O-HP小鼠相当的血压曲线(图4C-D). 此外，与使用CD45.1年轻伴侣获得的结果类似，异慢性联体共生未引起心脏重量/胫骨比率的变化(图4A)，心肌细胞大小(图4B)或加入老年伴侣的年轻CD45.2小鼠的血压(图4C-D). 这些数据表明，我们在年轻的CD45.1和CD45.2 C57Bl/6小鼠中观察到的血压差异不能解释暴露于年轻循环的老年小鼠心脏肥大的消退。

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年轻的CD45.1和CD45.2小鼠之间的血压差异不能解释心肌肥厚的逆转

（A） 仅使用CD45.2小鼠进行联体4周后的心脏重量/胫骨长度比率图。

（B） 基于PAS染色的CD45.2小鼠左心室肌细胞横截面积。老年小鼠暴露于年轻CD45.2小鼠的循环中可逆转心肌肥大。

（C） 老年小鼠与年轻CD45.1或CD45.2小鼠结合后，尾剪断系统测得的血压没有差异(图3A)4周后。

（D） 通过基于动脉导管的终末测量，未发现组间血压存在显著差异。数据显示为平均值±标准误差。

异慢性联体与分子重塑相关

心脏肥大与许多心脏标志物的表达改变有关。为了从分子水平评估O-HP小鼠心肌肥大的逆转，我们定量了心肌细胞肥大的分子标记物心钠素（ANP）和脑钠素（BNP）在心脏的转录表达(图5A-B). 与等时年龄匹配对照组相比，我们检测到暴露于年轻循环的老年小鼠心脏中ANP和BNP转录水平显著降低。有趣的是，与年轻等时小鼠相比，老年异时小鼠的ANP和BNP转录水平较低。我们推测，这可能反映了细胞肥大的主动回归过程，这可能不同于稳态下的非肥大心肌细胞。我们还量化了肌浆网钙ATP酶（SERCA-2）的转录水平，其表达可能随年龄变化(Dai等人，2009年)对正常舒张舒张功能很重要。与O-IP对照组相比，暴露于年轻循环（O-HP）的老年小鼠心脏中SERCA-2的表达显著增加(图5C). 这些数据提供了额外的证据，表明年轻的循环因子改变了与心肌细胞肥大和舒张功能相关的离散分子通路。

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年轻体循环导致老年心肌重塑的分子证据

与老年等时小鼠相比，暴露于年轻循环的老年小鼠的ANP和BNP转录水平显著降低。与老年等时小鼠相比，暴露于年轻循环的老年小鼠的SERCA-2转录水平显著升高。用实时PCR测定转录水平并归一化为Y-IP组。

数据显示为平均值±标准误差。

与联体共生相关的行为改变不能解释异慢性小鼠心肌肥厚的逆转

虽然联体模型用于生理学研究已有一个多世纪了(芬蒂，1952年)，我们考虑了抛物线配对的物理约束可能导致行为改变，从而有助于观察到的心肌肥厚的逆转。因此，我们开发了一种我们称之为“假联体”的手术技术，通过手术将小鼠连接起来，同时保持皮肤完整，这样它们就不会形成共同的循环(图6A). 我们生成了假异慢性抛物线对，其中年轻雌性小鼠（2个月）与老年伴侣（23个月）结合，并将其与假等时抛物线对（年轻-年轻或老年-老年）以及年龄匹配的异慢性和等时抛物线对进行了比较(图6A-C). 与之前的实验一样，在4周后分析假配对的心脏。与建立有效交叉循环的传统抛物线连接相比，我们发现参与假异慢性抛物线连接的老年小鼠的心脏重量与胫骨长度之比与老年等时假抛物线连接小鼠相比没有显著差异(9.38+/-0.39与9.63+/-0.22毫克/毫米，P=ns）(图6B). 这些数据表明，逆转年龄相关性心肌肥厚需要血液传播因子的交叉循环和交换。这一发现在细胞水平上也得到了证实，因为老年异慢性沙姆的心肌细胞大小与老年等时沙姆的肌细胞大小没有差异(352.9±18.9微米与355.0±9.5微米2，P=ns）(图6C). 最后，我们评估了假手术配对中ANP、BNP和SERCA-2转录水平。与旧的等时沙姆相比，这些肥大分子标记物的水平在旧的异时沙姆中显著增加（ANP）或未改变（BNP和SERCA-2）（数据未显示），这表明在缺乏共循环的情况下，与心肌肥厚减轻相关的分子重塑不会发生。

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异慢性假联体并不能逆转老年小鼠的心肌肥厚

（A） ●●●●。流式细胞术图，描绘CD45.1（y轴）或CD45.2表达（x轴），所述CD45.1或CD45.2表达是通过从通过假异时共生连接的年轻或老年小鼠分离的脾细胞进行的。假联体对未显示出实验性联体中观察到的伙伴衍生血细胞的交叉循环（参见图S1).

（B） ●●●●。显示假联体4周后心脏重量/胫骨长度比率的图表。

（C） 假联体4周后基于PAS染色的左心室肌细胞横截面积。

数据显示为平均值±标准误差。

生长分化因子11在老年小鼠的循环中降低，“年轻”水平通过异慢性联体作用恢复

上述研究强烈表明，年轻小鼠与老年小鼠的血载因子差异是异慢性联体后老年小鼠诱导心脏重塑的基础。为了确定可能导致暴露于年轻循环中的老年小鼠心肌肥厚退化的候选因素，我们对从参与等时或异时性联体共生的年轻或老年小鼠收集的血清和血浆进行了一系列筛选（持续4周）。将来自旧对羟基苯甲酸酯的血浆暴露于年轻循环或来自等时对照组，我们对69个氨基酸和胺进行了代谢组学分析；和脂质组学分析，评估了9类脂质中的142种脂质：溶血磷脂酰胆碱、溶血磷脂酰基乙醇胺、鞘磷脂、磷脂酰壳、二酰甘油、胆固醇酯、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇和三酰甘油。然而，无论是代谢组学还是脂质组学筛查，我们都没有发现异慢性和等时性副生物小鼠之间的显著差异（数据未显示）。接下来，我们进行了大规模蛋白质组学分析（SomaLogic，Inc.Boulder，CO），使用基于适配体的技术定量评估了10只年轻（2个月）和10只老年（23个月）小鼠的血浆样品。该方法揭示了13种可靠区分年轻小鼠和老年小鼠的分析物(表S1). 在这些候选者中，有一个（生长分化因子11，GDF11，生长和分化因子激活素/TGFβ超家族的成员）在等时和异时副生子小鼠的分析中得到证实，以显示等时幼仔对和等时幼对血浆中的差异丰度，以及更“年轻”的老年异基因动物的表达谱(图7A).

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老年小鼠循环中GDF11水平降低，将GDF11恢复到“年轻”水平有助于逆转心肌肥厚和分子重塑

（A） Western Blot分析显示，与年轻小鼠相比，老年小鼠血浆中GDF11的水平降低（每组3只）。同样，与年轻等时（Y-IP）小鼠相比，老年等时（O-IP）小鼠血浆中的GDF11减少，并且在暴露于年轻循环（O-HP）后，老年小鼠恢复到“年轻”水平（每组3只）。

（B） 苯肾上腺素诱导的心肌肥大三暴露于rGDF11或肌抑制素的心肌细胞中的H-亮氨酸掺入。rGDF11（50nM）阻止苯肾上腺素诱导三H-亮氨酸掺入。

（C） GDF11通过TGFβ途径发出信号并抑制人类心肌细胞中Forkhead转录因子磷酸化。用无血清培养基（对照）或含有所示蛋白质的相同培养基刺激15分钟的人诱导多能干细胞衍生心肌细胞的蛋白质印迹。

（D） 在老龄（23个月）小鼠中进行rGDF11治疗的随机、载体对照研究。每日腹腔注射rGDF11（0.1mg/kg）或生理盐水（溶媒对照）30d。表示心脏重量/胫骨长度比率的图表。

（E） PAS染色后测量的左心室肌细胞横截面积。rGDF11治疗导致心肌细胞横截面积减少。

（F） 用rGDF11或生理盐水处理的老年小鼠心脏中ANP、BNP或SERCA-2的表达。实时PCR转录测量值标准化为生理盐水组的水平。

数据显示为平均值±标准误差。

另请参见 图S3-S6.

为了阐明循环GDF11年龄依赖性降低的可能机制，我们分析了其在一系列组织和细胞群中的表达。我们的数据表明，正如之前报道的那样，表达范围广泛(McPherron，2010年)脾脏GDF11 mRNA水平最高(图S3A). 接下来，我们通过比较老年（24个月）和年轻（3个月）C57Bl/6小鼠的组织，研究了GDF11的表达与年龄的关系(图S3B-C). 我们检测到老年小鼠脾脏中GDF11基因表达和GDF11蛋白水平均显著下降。这些数据表明，脾脏GDF11的减少可能导致衰老小鼠循环GDF11下降，尽管GDF11在许多器官中产生(麦克弗伦，2010年)，其他组织和器官的表达变化也可能起作用。

GDF11预防心肌肥厚在体外并抑制Forkhead转录因子磷酸化

接下来，我们使用亮氨酸掺入试验测试GDF11在培养的新生儿心肌细胞中是否显示抗肥厚特性。在血清饥饿后，用重组GDF11（rGDF11）或三种不同浓度的紧密相关的TGFβ超家族蛋白myostatin处理新生大鼠心肌细胞24小时，然后将其暴露于三亮氨酸和苯肾上腺素（50µM）。我们观察到苯肾上腺素诱导的显著且可重复的抑制作用三用50nM rGDF11处理的心肌细胞中的H-亮氨酸掺入，在用相同浓度的肌抑制素处理后未观察到这种效应(图7B). 我们还测试了rGDF11或肌抑制素在人类诱导的多能干细胞源性心肌细胞中激活TGFβ通路的能力，如之前在非心脏组织中所示(Tsuchida等人，2008年). 用无血清培养基（对照）或用含有rGDF11（50nM）或肌抑素（50nM）的相同培养基刺激细胞15分钟。rGDF11或myostatin刺激的细胞表现出pSMAD2和pSMAD3的显著增加，这与TGFβ途径的激活和Forkhead转录因子磷酸化的抑制一致(图7C). 综上所述，这些数据表明GDF11在心肌细胞水平上具有直接的抗肥厚作用。

GDF11逆转年龄相关性心肌肥厚体内

用GDF11特异性抗体对小鼠心脏切片进行免疫组织化学染色，证明插入椎间盘存在GDF11(图S4)在相邻心肌细胞之间，质膜上的一个区域，其他配体/受体相互作用已被证明影响肥大信号通路(古斯塔夫森·瓦格纳等人，2007年;Johnston等人，2009年). 这些数据以及在体外证据(图7B-C)在心肌细胞中显示GDF11依赖性信号，为测试恢复老年小鼠循环GDF11的“年轻”水平是否可能逆转年龄相关性心肌肥厚提供了理论依据。为了确定rGDF11的最佳剂量、给药途径和给药间隔，我们首先进行了一项剂量反应研究，通过腹膜内推注（i.p.）给小鼠注射蛋白质，剂量范围为0.005至0.1mg/kg（数据未显示）。只有在最高剂量（0.1 mg/kg）下，我们才观察到注射后1小时血浆GDF11水平的可重复增加(图S5). 此外，对单次腹腔注射0.1 mg/kg rGDF11后48小时内连续采集的血浆样品的分析表明，单次注射后，GDF11水平持续升高约24小时(图S5).

基于这些结果，我们设计了一项随机、盲法、车辆对照研究，以测试rGDF11对心肌肥厚的大体和组织学参数的影响。大鼠（23个月龄）雌性小鼠（C57Bl/6）每天腹腔注射rGDF11（0.1mg/kg）或生理盐水，持续30天（每组16只）。与生理盐水注射对照组相比，注射rGDF11的老年小鼠的心脏重量与胫骨长度之比显著降低(图7D). 形态计量学分析进一步证明，rGDF11治疗导致的心肌细胞明显小于盐水注射对照组(图7E).

我们还研究了rGDF11治疗的老年小鼠心脏中的分子变化。我们检测到BNP显著降低，ANP也有类似趋势，这两种分子标记物均与心肌肥厚相关(图7F). 相反，与舒张功能相关的SERCA-2转录水平(Dai等人，2009年)在rGDF11治疗的心脏中，与生理盐水治疗的年龄匹配对照组相比，增加。rGDF11诱导肥大分子标记物减少和SERCA-2表达增加的这种模式与通过联体作用暴露于年轻循环的老年小鼠中观察到的模式相似。我们还对24个月大的雄性C56Bl/6小鼠进行了超声心动图评估，这些小鼠随机接受每日腹腔注射rGDF11（0.1mg/Kg）或溶媒30天。我们评估的功能参数在两组之间没有显著差异(表S2).

GDF11不能预防压力过载后的心肌肥厚体内

为了确定GDF11对心肌细胞的影响是否对年龄相关性心肌肥厚具有特异性，将2个月大的雌性C56Bl/6小鼠进行主动脉横缩，然后随机接受rGDF11（0.1mg/Kg）或载体的每日IP注射，持续30天。我们在第15天和祭祀前进行了超声心动图评估(图S6C). 30天后，对小鼠实施安乐死，并收集心脏进行组织学和分子评估。我们通过测量心脏重量/胫骨长度比率来评估心脏形态计量学：与只接受载体（n=9）的小鼠心脏相比，接受主动脉结扎和rGDF11治疗30天的小鼠（n=10）的心脏肥厚没有显著降低(P=0.4,图S6A). 此外，心肌细胞横截面积没有显著差异(图S6B). 我们还评估了心脏纤维化的发展，没有发现两组之间有任何差异（数据未显示）。这些数据表明GDF11并不能阻止所有形式的心肌肥厚。

讨论

左心室肥厚是心脏老化的一个重要特征，导致舒张功能障碍和收缩功能保持的心力衰竭(拉卡塔和利维，2003年). Anreverse及其同事对无高血压或临床明显心血管疾病的老年受试者进行的尸检研究表明，心肌细胞增大，心肌细胞数量减少，但心肌总质量没有变化，这种模式在男性中更为明显(Olivetti等人，1995年). 然而，一项对类似患者群体的横断面研究表明，男女左心室壁厚度均增加(拉卡塔和利维，2003年). 与收缩功能障碍患者相比，舒张功能障碍患者年龄更大，更容易肥胖、糖尿病、高血压和女性(Owan和Redfield，2005年)提示了不同的潜在病理机制。

本研究的中心假设是，暴露于年轻循环中的因素后，衰老的心脏表型是可逆的。我们用手术吻合的副生物小鼠验证了这一假设。我们选择使用C56Bl/6小鼠进行这些实验，因为它们产生了与人类相似的与年龄相关的心脏表型。此外，因为性别在生理性心脏肥大中起作用(Foryst-Ludwig等人，2011年)，我们对男性和女性进行了实验。我们发现，通过联体作用将老年小鼠暴露在年轻循环中，可以以性别无关的方式逆转心肌细胞肥大，并且这种心肌细胞尺寸的减小转化为整体心肌质量的减少。这种结构转变伴随着利钠肽的心肌基因表达减少，利钠肽可促进适应性不良的心脏重塑，而Ca2+ATP酶（SERCA-2）增加，其表达与心肌舒张功能和正常舒张功能是不可或缺的。总之，这些数据与年轻循环中存在的因素可以逆转心脏老化的关键结构和分子方面的概念一致。

随着可溶物质的循环转移成为老年副生物小鼠心肌肥厚消退的可能机制，我们进行了一项系统研究，以确定幼年小鼠血液中高水平的候选因子，这些因子可能是抗肥厚作用的基础。我们的蛋白质组学分析确定了几个水平随年龄变化的因素，我们不能排除其他因素也参与异时共生中观察到的影响的可能性；然而，GDF11是一系列筛选分析的有力候选者，这些分析比较了年轻血浆和老年血浆中的脂质谱、代谢物和信号蛋白。虽然GDF11在一系列组织中可以检测到表达，但脾脏显示出最高浓度，并且GDF11水平呈年龄依赖性下降。因此，脾脏可能有助于循环GDF11，脾脏中与年龄相关的生成或分泌缺陷可能参与老年小鼠循环GDF1的减少。

最近的一项研究表明，鉴于受体的杂乱性，用可溶性ActRIIB蛋白（sActRIB）治疗恶病质小鼠可以拮抗GDF11（以及肌抑制素、激活素和其他TGFβ家族成员）的信号传导(Tsuchida等人，2008年)逆转荷瘤动物的心脏萎缩(Zhou等人，2010年). 结合我们的蛋白质组数据，这项研究进一步支持了GDF11作为幼鼠体内系统性抗肥厚活性的介质的观点。此外，我们的组织学数据(图S4)GDF11与心肌细胞的建议结合体内试验。因此，我们进行了一项随机、车辆对照研究，对老年小鼠给予rGDF11 30天。如心脏重量测量和形态计量学分析所示，rGDF11治疗导致老年小鼠心肌肥厚显著减轻。

此外，rGDF11（而非肌抑制素）诱导新生心肌细胞中苯肾上腺素介导的肥大的剂量依赖性抑制，在体外表明GDF11在心肌细胞水平上具有特异性和直接作用。然而，rGDF11和myostatin均刺激TGFβ信号通路，包括抗肥厚FoxO因子。虽然rGDF11的抗肥大作用可能是由FoxO依赖性蛋白酶体介导的蛋白质降解介导的(Sandri等人，2004年)，我们的数据并不能解释rGDF11和myostatin的差异作用。我们推测，这种差异效应可能是由于内源性抑制剂活性的差异和/或受体亲和力的细微差异所致(米勒和镍业公司，2012年).

肌肉生长抑制素负性调节骨骼肌质量的观察结果导致了通过阻断肌肉生长抑素信号传导来治疗年龄和癌症相关肌肉萎缩的治疗策略的发展。有趣的是，尽管肌抑制素缺乏小鼠在衰老过程中心脏重量没有持续的重要变化(科恩等人，2007年;Jackson等人，2012年)，用可溶性ActRIIB拮抗剂治疗导致骨骼增加和心肌质量，这表明该拮抗剂的心脏效应可能是由抑制除肌抑制素以外的配体引起的。事实上，尽管通过类似的激活素受体组合发出信号，GDF11和肌抑制素显示出许多非重叠的功能。肌生长抑制素阴性小鼠骨骼肌质量显著增加，而GDF11阴性小鼠骨骼和肾脏异常，出生后24小时内死亡(McPherron等人，1999年). 因此，我们推测报道的ActRIIB拮抗剂对心肌的作用(Zhou等人，2010年)可能是由于GDF11信号的抑制，并且与肌抑制素的作用无关。我们的数据表明GDF11和肌抑制素具有一些共同点在体外属性；显然的体内差异尚未完全理解。

GDF11在压力过载情况下预防心肌肥厚无效，这表明GDF11的抗肥厚特性可能并不适用于所有形式的心肌肥厚。有趣的是，我们的初步研究表明，GDF11治疗可能会影响其他组织（如骨骼肌）的衰老表型，进一步的研究对于确定GDF11在心脏以外衰老中的作用至关重要。

总之，我们对异时共生小鼠心脏逆向重构的分析表明，GDF11是一种具有强大抗肥大特性的年龄调节循环因子。我们的研究表明GDF11与年龄相关性心肌肥厚有关，但不排除其他因素的参与(表S1)我们也没有直接证据表明GDF11在人类年龄相关性心肌肥厚发展中的作用，尽管GDF11确实刺激人类多能干细胞源性心肌细胞中靶蛋白（SMAD2/3）的磷酸化(图7C). 最近在人体循环中发现(Souza等人，2008年)与小鼠相比，GDF11和其他TGFβ家族成员在人体循环中的浓度显著降低(Souza等人，2008年). Ganz及其同事利用蛋白质组学方法报告了初步数据，表明低水平GDF11在稳定的冠心病人群中确定了一个队列，该队列人群具有较高的综合终点全因死亡率、心肌梗死、心力衰竭、中风的风险（在2012年美国心脏协会科学会议上发表）。未来的研究将有必要评估GDF11在人类心肌肥厚中的作用。我们认识到，衰老的心肌肥大是一个多因素过程，在暴露于年轻循环的老年小鼠中观察到的心肌肥厚的消退不太可能完全归因于单一因素的补充。尽管如此，我们的结果表明，通过恢复循环GDF11的年轻水平，靶向老龄化心肌肥厚的治疗可能令人兴奋。

实验程序

动物

衰老（21–23个月）C57Bl/6小鼠取自国家衰老研究所（NIA）；年轻（2个月）C57Bl/6（CD45.1负极CD45.2型+)或年轻的B6.SJL（CD45.1+CD45.2型负极)小鼠取自JAX。小鼠集落的维持和所有实验均按照实验动物使用和护理指南并经相关机构委员会批准。

共生

如前所述进行了共生(邦斯特和迈耶，1933年;Ruckh等人，2012年). 通过流式细胞术测量一对搭档（CD45.1）供体衍生血细胞的频率，在一组副生物对中证实了血液嵌合体+)在另一个伴侣的脾脏中（CD45.2+). 伙伴衍生细胞通常占脾细胞的40-50%，这与副生物交叉循环的建立相一致。由于老的CD45.1+小鼠无法在市场上买到，因此我们无法使用此方法验证等时-旧抛物线对中嵌合体的建立。

假联体

假联体手术是联体手术的改进(Bunster和Meyer，1933年;Ruckh等人，2012年)在不形成共享循环的情况下实现外科连接。将小鼠麻醉至完全肌肉松弛状态，并通过改良Bunster和Meyer技术加入。在剃光每只小鼠相应的侧面后，从鹰嘴到每只小鼠的膝关节做相应的皮肤切口，并直截了当地切开皮下筋膜，形成约1/2厘米的自由皮肤。鹰嘴和膝关节用一条2-0 prolene缝合线连接。缝合线依次穿过第一只小鼠的皮肤和关节，穿过一个硅片来分离两只小鼠的皮肤，然后穿过第二只小鼠的皮和关节。缝合线被捆扎，使得硅盘在关节处分开了每只小鼠的皮肤，并且每只小鼠皮瓣之间没有任何接触。皮肤切口用订书钉缝合。用网状缝合钉加固连接小鼠的普罗林缝合线。

Western Blot、流式细胞术、基因表达、代谢组学和脂质体分析

请参阅补充实验程序.

心肌细胞大小的形态计量学评估

小鼠心脏用4%多聚甲醛固定，石蜡包埋，切片，并用周期性酸Schiff（PAS）染色。使用5个随机选择的心脏切片，以盲法进行染色、扫描和量化。

无创血压

我们使用了一个计算机化的尾剪断系统（BP-2000，Visitech Systems，Apex，NC），我们对其进行了修改，以允许同时测量抛物线对的两个成员的血压。未经手术的小鼠或成对的小鼠在预先加热的尾剪装置中连续训练5天，使其适应该程序，然后测量心率和收缩压。

神经激素测量

用ELISA（美国恩佐生命科学国际公司）测定血清样本中循环血管紧张素II和醛固酮的水平

蛋白质组分析

在SomaLogic蛋白质组学发现平台（SOMAscan）上分析20只小鼠的EDTA血浆样品（20µl），该平台使用SOMAmers同时测量1001个蛋白质。SOMAmers（慢脱速率修饰适配子）是通过SELEX进化而来的基于核酸的蛋白质结合试剂(Tuerk and Gold，1990年)结合蛋白质靶点。SOMAscan通过平衡结合和去除未结合的SOMA单体和蛋白质，将基质中的蛋白质浓度转化为相对数量的SOMA双体。SOMAmer数量通过与微阵列杂交来测量（有关完整描述，请参阅(Gold等人，2010年))

体外心肌细胞肥大试验

从出生后第1天CD1大鼠（Charles River）中分离新生心肌细胞(Seki等人，2009年). 电镀后约36小时，心肌细胞在补充ITS的低血糖DMEM中被血清饥饿24小时（PAA实验室）。心肌细胞在用苯肾上腺素（50µM，Sigma）处理和用三H-亮氨酸（1µCi/ml，莫拉维克）。在苯肾上腺素和三H-亮氨酸。贴上标签后24小时三用冰镇PBS清洗细胞，并用冰镇10%三氯乙酸在4C下固定45分钟。用0.05M NaOH溶解细胞并用液体闪烁分析。

诱导多能干细胞衍生的人心肌细胞

请参阅诱导多能干细胞衍生人类心肌细胞的补充实验程序。

主动脉横向收缩与超声心动图

请参阅补充实验程序用于横主动脉缩窄和超声心动图检查程序。

统计分析

数据比较采用单向方差分析和事后Bonferonni校正或假设双尾分布和不相等方差的Student t检验。统计学意义为p<0.05；结果显示为平均值的标准误差。

​

集锦

  • 异慢性联体共生逆转年龄相关性心肌肥厚
  • 抗肥厚作用不是由血流动力学或行为因素引起的
  • GDF11是一种循环转化生长因子β家族成员，随着年龄的增长而下降
  • 年轻人GDF11水平的恢复逆转年龄相关性心肌肥厚

补充材料

01

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02

单击此处查看。（500万，pdf）

03

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致谢

作者感谢HSCI和DRC（NIH奖编号P30DK036836）流式细胞术核心对细胞术的卓越支持。这项工作的部分资金来源于美国心脏协会向FSL（博士后奖学金）、MLS（AHA FTF）、Glenn基金会和NIH（1RO1 AG033053、1DP2 OD004345和5U01 HL100402）、AJW、NIH（R01 AG032977 1R01 AG040019）、RTL和NIH向MLS（KO8 DK090147）提供的资助。MLS得到了沃特金斯心血管领导奖的支持。AJW是霍华德·休斯医学研究所的早期职业科学家。内容仅由作者负责，不一定代表NIH或其他资助机构的官方观点。SOMAscan和SOMAmers是Somalic，Inc.的商标。

脚注

出版商免责声明：这是一份未经编辑的手稿的PDF文件，已被接受出版。作为对客户的服务，我们正在提供这份早期版本的手稿。手稿在以最终可引用的形式出版之前，将经过编辑、排版和校对结果证明。请注意，在制作过程中可能会发现可能影响内容的错误，适用于该期刊的所有法律免责声明均适用。

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