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.2009年8月；23(8):2759-71.
doi:10.1096/fj.08-127480。 Epub 2009年4月13日。

β3整合素介导的泛素化激活心肌肥厚时的生存信号

丽贝卡·约翰斯顿 1, Sundaravadivel Balasubramanian语, 哈林塔·卡西加尼桑, Catalin F Baicu公司, 迈克尔·R·齐勒, 达达帕尼·库普斯瓦米
附属公司

β3整合素介导的泛素化激活心肌肥厚时的生存信号

丽贝卡·约翰斯顿等。 美国财务会计准则委员会J. 2009年8月.

摘要

确定代偿性肥大中激活和失代偿期缺失的分子机制将为预防心力衰竭提供分子靶点。我们之前已经证明，在心肌细胞闰盘附近压力超负荷（PO）肥大的早期生长期，泛素化（Ub）增强，其中整合素对机械传递很重要。在本研究中，我们测试了Ub上游整合素的作用，Ub增强是否有助于早期PO的生存信号传导，以及这种机制的丧失是否会导致心室功能下降。该研究使用了一只β（3）整合素（-/-）小鼠和一只野生型小鼠作为通过横主动脉收缩（TAC）控制体内PO和用整合素激活肽RGD刺激体外培养心肌细胞的对照。我们证明β（3）整合素在PO肥大期间介导靶蛋白的瞬时Ub，这对心肌细胞存活和维持心室功能是必要的。生存信号通过启动E3连接酶cIAP1的NF-kappaB转录进行。在POβ（3）（-/-）小鼠中，这种机制的缺失与TUNEL染色增加以及4周后心室重量和功能降低有关。这是首次研究表明β（3）整合素/Ub/NF-kappaB途径有助于代偿性肥厚生长。

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数字

图1。
图1。
Ub随PO增加体内RGD肽刺激整合素在体外.A类)C57BL/6小鼠接受假手术（对照）或TAC诱导PO 72小时或4周(n个≥4/组）。LV样品在Triton X-100缓冲液中均化，并离心以获得可溶性和不溶性组分，如材料和方法中所述。通过调节肌动蛋白水平，在不溶性组分中装载等量的总蛋白，并用抗泛素抗体进行Western blot。B类)将分离的成年小鼠或猫心室肌细胞镀在层粘连蛋白涂层板上。12小时后，取出培养基，用0.2%胶原蛋白替换，添加或不添加可溶性RGD肽（小鼠，6 mM；猫，9 mM）。在培养1小时和胶原聚合后，通过胶原酶处理获取心肌细胞，并在Triton X-100缓冲液中溶解，如材料和方法中所述。用抗泛素抗体对不溶性部分进行Western blot。将样品归一化为肌动蛋白，以获得相等的负载。显示了具有代表性的图像。细胞实验一式四份。
图2。
图2。
β三整合素亚型对心肌肥厚早期代偿期Ub升高是必要的体内采购订单。年龄匹配的WT（C57BL/6）小鼠和β三−/−[β三（−/−）]小鼠接受指定时间的假手术或TAC(n个≥4/组），用Western blot或免疫荧光分析。A类)处理LV样品以获得Triton可溶性和不溶性组分。对肌动蛋白的不溶部分进行归一化，并用抗泛素抗体进行Western blot。B类)新鲜冷冻LV组织切片用抗泛素抗体（红色）和抗泛素-N个-钙粘蛋白抗体（绿色）。C类)WT和β4周切片的高倍图像三−/−用抗泛素抗体（红色）和抗泛素-N个-钙粘蛋白抗体（绿色）。D类)新鲜冷冻LV组织切片用抗泛素抗体（红色）和抗α-肌动蛋白抗体（绿色）染色。E类)WT和β4周切片的高倍图像三−/−用抗泛素抗体（红色）和抗α-肌动蛋白抗体（绿色）染色。如果)分析程序性细胞死亡；TOPRO3（蓝色）染色细胞核，抗泛素抗体（红色）染色泛素，TUNEL（绿色）表示细胞死亡。低增感免疫显像显示WT和β的范围更大三−/−4周TAC。从3只小鼠/组的多个切片中计算出约13000个细胞核。条形图显示WT和β左心室TUNEL阳性细胞核的平均百分比三−/−4周TAC时；误差线=东南方在对照组中或在WT或β的72 h TAC时均不存在TUNEL反应性三−/−老鼠。比例尺=10μm。
图3。
图3。
β三整合素有助于PO心肌的肥厚生长和心室功能。A类)WT和β的富营养生长三−/−[β三（−/−）]小鼠在4wk PO时通过牺牲时LV质量与体重（BW）的比值进行测量。B类)WT和β的控制和4周PO LV三−/−将小鼠石蜡包埋，制作切片。用苏木精和伊红染色的切片通过光学显微镜成像，以观察心肌细胞的大小。C类)使用Sigma Scan Pro-5从100个心肌细胞/动物计算横截面积。图表显示了每只动物的平均心肌细胞大小，然后是每组的平均值；数据为平均值±东南方. *P（P）< 0.05与。控制#P（P）< 0.05与。WT节气门执行器控制。D、 E类)左心室功能（射血分数）(D类)和几何形状（舒张末期尺寸）(E类)分别在TAC前和TAC 4周后处死前进行超声心动图分析。数据为平均值±东南方. *P（P）< 0.05与。基线#P（P）< 0.05与。WT节气门执行器控制。如果)Kaplan-Meyer生存曲线显示WT和β的生存率三−/−对照组和4周TAC小鼠。
图4。
图4。
β三整合素是PO肥大过程中IκB降解、NF-κB核定位和cIAP1诱导所必需的。年龄匹配的WT和β三−/−小鼠在指定时间内接受TAC(n个≥4/组）。A类)制备LV的Triton不溶部分和可溶性部分，并用抗IκB和pIκB（S32/S36）抗体进行Western blot分析。可溶部分归一化为GAPDH；不溶性部分归一化为肌动蛋白。通过NIH图像J对可溶性部分的IκB水平进行密度测定进行量化。汇总数据显示平均±东南方PO组织可溶性部分中IκB的增加是对照组的两倍。B类)用抗p65 NFκB抗体（绿色）和核染色TOPRO3（蓝色）对假手术小鼠和72h TAC小鼠新鲜冷冻LV组织切片进行染色。比例尺=20μM。C类)从假小鼠和72小时TAC小鼠制备核组分，并分析NFκB异二聚体复合物p50:p65的运动。用抗p50和抗磷酸-p65（活性形式）NF-κB亚单位抗体进行蛋白质印迹分析。组蛋白H4用于使单个动物的核组分正常化。D类)用抗cIAP1抗体进行Western blot分析不溶组分和可溶性组分。可溶部分归一化为GAPDH；不溶性部分归一化为肌动蛋白。
图5。
图5。
整合素激活NF-κB转录促进心肌细胞cIAP1表达在体外胶原/RGD模型如图1所示B类.A类)用9mM RGD刺激猫心肌细胞，使用Triton不溶性和可溶性样品进行具有抗泛素、抗IκB和抗pIκB（S32/S36）抗体的Western印迹，并分别标准化为肌动蛋白和GAPDH。细胞实验一式四份。B类)猫心肌细胞感染Ad-NFκB-luc（MOI 10）36 h，然后胶原分层±9 mM RGD 2 h。总RNA经实时RT-PCR检测荧光素酶表达。18S mRNA作为内部对照。总结图表示3个实验的平均值；误差线=东南方. *P（P）< 0.05与。感染控制。C类)猫心肌细胞感染Ad-β-Gal（MOI 150）或Ad-IκB-S32A（MOI 15）36 h，然后用含有9 mM RGD的胶原蛋白刺激1 h。用抗泛素、抗IκB和抗PκB（S32/S36）抗体对不溶性和可溶性组分进行蛋白质印迹；负荷分别归一化为肌动蛋白和GAPDH。D类)用Ad-β-Gal（MOI 150）或Ad-IκB-S32A（MOI 15）感染小鼠心肌细胞36 h，然后用胶原中的6 mM RGD刺激1 h。提取总RNA并对cIAP1进行实时RT-PCR。内源性GAPDH mRNA被用作内部对照。总结图表示三个实验的平均值；误差线=东南方. *P（P）=0.01与。β-Gal对照#P（P）= 0.005与。β-半乳糖+RGD。
图6。
图6。
β三UPS介导的IκB降解需要整合素。A、 B类)从年龄匹配的WT和β中分离心肌细胞三−/−将小鼠置于层粘连蛋白涂层板上。电镀12 h后，细胞预处理30 min±MG132，培养基替换为胶原±6 mM RGD肽1 h。通过胶原酶处理获取心肌细胞，并在Triton X-100缓冲液中提取。不溶物(A类)和可溶性蛋白质(B类)通过离心分离，并用抗泛素、抗IκB和抗pIκB（S32/S36）抗体进行蛋白质印迹分析。肌动蛋白和GAPDH分别用于标准化不溶性和可溶性部分。
图7。
图7。
β信号机制示意图三整合素介导的Ub在代偿性心肌肥厚期间对NFκB活化和cIAP1表达的影响。β三整合素识别细胞外基质（ECM）蛋白的RGD基序，并通过聚集反应，随后将分子募集到肌动蛋白细胞骨架上，以创建局部粘附复合体，从而介导下游细胞内信号反应，包括增强的Ub。可以重新创建在体外通过用含有RGD肽的胶原覆盖心肌细胞。采购订单期间体内或RGD治疗在体外，IκB经历磷酸化，而不是β三整合素特异性。然而，当β三整合素被激活，磷酸化的IκB被招募到肌动蛋白-细胞骨架复合物（一种抵抗Triton X-100溶解的蛋白质复合物）中，在那里它被识别为Ub和随后的降解。然后，NFκB在细胞质中被释放，并转移到细胞核以转录cIAP1，一种E3连接酶。cIAP1也被招募到细胞骨架中，它促进Ub并负调控促凋亡caspase通路以促进细胞存活。
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