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.2004年4月30日；117(3):399-412.
doi:10.1016/s0092-8674（04）00400-3。

Foxo转录因子诱导萎缩相关泛素连接酶atogin-1并导致骨骼肌萎缩

马可·桑德里 1, 克劳迪娅·桑德里, 艾利克斯·吉尔伯特, 卡斯滕·斯卡克, 伊利莎·卡拉布里亚, 安妮·皮卡德, 肯尼思·沃尔什, 斯特凡诺·斯齐亚菲诺, 斯图尔特·H·莱克, 阿尔弗雷德·L·戈德堡
附属公司

Foxo转录因子诱导萎缩相关泛素连接酶atogin-1并导致骨骼肌萎缩

马可·桑德里等。 单元格. .

摘要

骨骼肌萎缩是对禁食、废用、癌症和其他全身性疾病的一种衰弱反应。在萎缩的肌肉中，泛素连接酶atogin-1（MAFbx）被显著诱导，这种反应对于快速萎缩是必要的。在这里，我们表明，在正在萎缩的培养肌管中，PI3K/AKT通路的活性降低，导致Foxo转录因子的激活和阿特拉津-1的诱导。IGF-1治疗或AKT过度表达抑制Foxo和atrogin-1的表达。此外，组成性活性的Foxo3作用于激活素-1启动子，导致激活素-1转录和肌管和肌纤维急剧萎缩。当Foxo的激活被肌管中的显性负性结构或体内小鼠肌肉中的RNAi阻断时，糖皮质激素诱导的饥饿和肌管萎缩过程中的饥饿素-1诱导被阻止。因此，叉头因子在肌肉萎缩的发展中起着关键作用，抑制Foxo因子是对抗肌肉萎缩的一种有吸引力的方法。

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数字

图1
图1
饥饿细胞与糖皮质激素治疗诱导阿奇金-1通过去除生长介质使PI3K/AKT信号通路（A和B）C2C12肌管成员的表达和去磷酸化饥饿，并在PBS中培养6小时。将参考样品中的培养基替换12小时。（A）饥饿对萎缩蛋白-1表达：Northern blots探针阿奇金-1和GAPDH公司（中间图像）和折叠增加阿奇金-1mRNA，通过除以萎缩蛋白-1波段强度(阿奇金-1/GADPH)使用阿奇金-1/GADPH控制条件下的比率（上图）。两者阿奇金-1分析中使用了条带。代表性对照、饥饿和参考C2C12肌管培养物的显微照片（下图）。（B） 饥饿对PI3K/AKT途径成分的影响：从与a中相同的样品中提取蛋白质，并进行免疫印迹分析。如上所述测定磷酸化蛋白与总蛋白之比的定量。数据标准化为100%的对照。（C） 1μM Dex处理对阿奇金-1表达式。（D） Dex对PI3K/AKT通路成分的影响。（E） Foxo因子在饥饿的C2C12肌管中是核。左图：对照组和饥饿组肌管的核提取物用抗Foxo抗体进行免疫印迹。右图：测试核提取物与双链的结合32通过电泳迁移率变化分析，含有Foxo、CREB、NFκB和AP1结合位点的P标记寡核苷酸。Arrow，Foxo–寡核苷酸复合物。小行星，非特异性带。
图2
图2
IGF-1和AKT阻断阿奇金-1通过饥饿和Dex治疗和引起Foxo磷酸化（A），在不存在或存在IGF-1（10 ng/ml）的情况下培养肌管，同时饥饿（6小时）或使用Dex治疗（24小时）。对阿奇金-1如图1所示，通过免疫印迹分析AKT通路成员的表达（上图）和数量及磷酸化（下图）。（B） 用腺病毒载体感染肌管中的c.a.AKT、d.n.AKT或对照病毒（βgal）。感染36小时后，一半的肌管接受1μM Dex治疗24小时萎缩蛋白-1Northern分析的表情。（C） 通过抗HA免疫印迹检测（B）培养物中AKT及其下游靶点的免疫印迹，以及过表达蛋白。
图3
图3
Foxo3诱导阿奇金-1Foxo3诱导的肌管大小减少的表达及原因阿奇金-1表达式。在不存在或存在IGF-1（10 ng/ml）的情况下，48小时后，用FOXO3A和c.a.FOXO3A腺病毒载体感染肌管，阿奇金-1对信使核糖核酸水平进行测定，如图1所示。抗HA免疫印迹检测高表达蛋白。（B） 阿奇金-1启动子被Foxo3激活。成肌细胞转染有阿奇金-1报告者构造1.0自动变速箱1或3.5自动变速箱1分化四天，然后感染FOXO3A或对照（GFP）载体24小时。对提取物进行萤火虫和Renilla荧光素酶活性分析。对照组（GFP）感染的萤火虫/雷尼拉活性正常化为1.0。（C） 过度表达Foxo3的肌管培养物的荧光显微镜。肌管培养物感染对照腺病毒（GFP）或c.a.FOXO3A，并在感染48小时后拍照。每种培养物的平均肌管直径通过三个独立实验进行量化。（D） D.n.Foxo3抑制地塞米松诱导的阿奇金-1肌管直径的表达和减少。用表达d.n.FOXO3A、c.a.FOXO3A或GFP的腺病毒载体感染肌管，并在没有或存在1μM Dex的情况下培养24小时。通过抗HA免疫印迹检测过度表达的d.n.FOXO3A。左图：北部分析阿奇金-1表达式。中图：48小时后肌管培养的荧光显微镜。右图：Dex和Foxo表达时平均肌管直径的量化。
图4
图4
激活Foxo3，但不激活其他AKT目标阿奇金-1表达（A）肌管感染各种腺病毒载体48小时，然后阿奇金-1对表情进行分析（上图）。抗HA免疫印迹检测到过度表达的蛋白（下图）。（B） 成肌细胞转染3.5自动变速箱1、分化并感染指定的载体。如图3B所示，分析了这些培养物提取物中的荧光素酶活性。结果被归一化为对照组GFP感染。
图5
图5
AKT抑制Foxo刺激阿奇金-1表达和Foxo激活导致小鼠肌纤维明显萎缩（A）AKT阻止诱导阿奇金-1通过禁食表达。左图：小鼠胫骨前肌通过电穿孔转染3.5自动变速箱1和pRL-TK公司七天后，喂食或禁食小鼠，然后处死。在肌肉提取物中测量萤火虫和Renilla荧光素酶活性。喂食和禁食小鼠肌肉切片的原位杂交（左图，插入）。比例尺等于60μm。中图：肌肉与3.5AT1，pRL-TK，或者c.a.HA-AKT公司或父向量。七天后，将小鼠禁食24小时并处死。测定萤火虫/Renilla荧光素酶活性。右图：对这些转染肌肉的连续横截面进行处理，用抗HA抗体进行免疫荧光或用阿奇金-1反义探针。比例尺等于50μm。（B） c.a.FOXO3A的核定位。转染c.a.的成人胫骨前肌切片。FOXO3A公司或FOXO3A公司在感染后4天，用抗HA抗体（针对Foxo）和Hoechst染色（针对细胞核）进行制备和可视化。图像被合并以证明同位化。对于c.a.FOXO3A，比例尺等于20μm，对于FOXO3A，比例尺等于30μm。（C） Foxo3激活阿奇金-1转染肌纤维中的启动子。肌肉与3.5AT1，pRL-TK，并且使用其中之一FOXO3A公司或c.a。FOXO3A公司如上所述。类似地，Foxo报告子（DBE启动子）被转染代替萎缩蛋白-1记者。转染四天后测定荧光素酶活性。（D）阿托金-1过度表达Foxo3的肌肉纤维中mRNA增加。转染c.a.的胫骨前肌横切面。FOXO3A公司用抗HA抗体进行免疫荧光或原位杂交阿奇金-1转染后4天。阿托金-1Foxo3过度表达纤维中的转录物增加，靠近Foxo3-阳性核（箭头）标尺等于40μm。（E） siRNA-介导的击倒福克斯1-3禁止阿奇金-1禁食期间的启动子活性。左图：成人骨骼肌与质粒系统-向量，pRL-TK公司和3.5自动变速箱1七天后，小鼠被禁食并处死。如上所述测量萤火虫/肾小球荧光素酶活性。右图：免疫印迹法检测肌管中Foxo1和3蛋白水平。（F） Foxo3表达8或14天会导致明显的肌纤维萎缩。左图：成人胫骨前肌转染c.a。FOXO3A公司并在8或14天后处死小鼠。在用抗-HA染色的横切面上检测到表达c.a.FOXO3A的萎缩纤维（对于Foxo）（八天显微照片中的星点）。八天内，比例尺等于50μm。14天内，比例尺等于20μm。右侧图像：显示横截面积分布的频率直方图（μm2)表达c.a.FOXO3A的纤维8天（红色条）或14天（粉红色条），以及周围未转染纤维（对照纤维）（黑色条）。
图6
图6
需要Foxo结合位点阿奇金-1Foxo3启动子激活（A）序列截断阿奇金-1启动子与萤火虫融合荧光素酶基因。（B） 萎缩蛋白-1记者和pRL-TK公司在有或无c.a.的情况下转染成体肌肉。FOXO3A公司同上。转染四天后处死小鼠，检测肌肉荧光素酶活性。（C） 阿奇金-1发起人。黑圈表示有多个叉头共识结合位点。潜在叉头结合部位（Foxo1)显示了（D）中用于gel-shift实验的最小启动子截断以及突变版本。（D） 测试纯化的FoxoGST蛋白与双链的结合32如实验程序所述，通过电泳迁移率变化分析，含有IGFBP1位点、AT Foxo 1和AT Foxo 1 mut位点的P标记寡核苷酸。Arrow，FoxoGST–寡核苷酸复合物。小行星，非特异性带。（E） 左图：0.4 kb的突变阿托品素-1荧光素酶记者构建。两个假定的Foxo位点被黑圈和X标记的突变。右图：成人肌肉被转染了阿奇金-1左图中描述的记者与pRL-TK公司和c.a。FOXO3A公司测定荧光素酶活性。
图7
图7
IGF-1/AKT通路和Foxo在肌肉萎缩（右图）和肥大（左图）中的作用摘要粗体显示的因子和通路被激活（详见正文）。
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